CC BY
107
УДК 615.371:616-006.6
Д.С. Пирожкова 1, О.Ю. Смирнова 1, С.И. Бажан 1, Н.А. Чикаев 2, О.Ю. Волкова 2, Л.И. Карпенко 1
ДНК-ВАКЦИНА ПРОТИВ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИ^^-ЭПИТОПНЫЙ ИММУНОГЕН
1ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (пос. Кольцово, Новосибирская область) 2 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск)
Трансмембранный белок Her-2/ErbB-2 — распространенный раковый антиген, гиперэкспрессия этого белка наблюдается, в 20—30 % случаев рака молочной железы, и ассоциируется, с неблагоприятным прогнозом. Перспективным, подходом, к лечению и. профилактике злокачественных опухолей является ДНК-вакцинация, индуцирующая, цитотоксические Т-лимфоциты (CD8+ CTL) — главные эффекторные клетки, противоракового иммунного ответа. Нами был сконструирован, искусственный. поли-CTL-эпитопный противоопухолевый, иммуноген ATI (Anti Tumor Immunogen.) и. кандидатная ДНК-вакцина против Нег-2/ЕгЬВ-2-специфичных опухолей, кодирующая. ATI. Мы. показали, экспрессию целевого иммуногена в эукариотических клетках 293Т, трансфицированных ДНК-вакциной рсDNA-ATI, при. помощи, иммуногистохимического окрашивания, с использованием, моноклональных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Сконструированная. ДНК-вакцина pcDNA-ATI является перспективным, кандидатом, для. проведения, доклинических исследований иммуногенности на лабораторных мышах и. противоопухолевого действия на культурах клеток.
Ключевые слова: трансмембранный белок Her-2/ErbB-2, рак молочной железы, ДНК-вакцина, CD8+ СTL
DNA-VACCINE FOR BREAST CANCER ENCODING POLY-CTL-EPITOPE IMMUNOGEN
D.S. Pirozhkova 1, O.Yu. Smirnova 1, S.I. Bazhan 1, N.D. Chikayev 2, O.Yu. Volkova 2,
L.I. Karpenko 1
State Research Centre of Virology and Biotechnology “Vector”, Koltsovo, Novosibirsk region Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAMS, Novosibirsk
Her-2/ErbB2-transmembrane protein is a widespread cancer antigen, its overexpression occurs in 20-30 % of breast cancers and is associated, with poor prognosis. DNA-vaccination inducing cytotoxic T-lymphocytes (CD8+ CTL), which, are the main anti-cancer immunity effectors, is the promising approach for cancer prevention and. treatment. We have designed, a DNA-vaccine against Her-2/ErbB-2-positive cancer encoding an artificial poly-CTL-epitope immunogen. Using an immunological staining with monoclonal antibodies, conjugated with horseradish peroxidase we showed expression, of target immunogen in 293T cell line. This DNA-vaccine is highly perspective candidate for pre-clinical study of immunogenicity in mice models and anticancer activity in cell lines. Key words: Her-2/ErbB2-transmembrane protein, breast cancer, DNA-vaccine, CD8+ ^L
ВВЕДЕНИЕ
По данным ВОЗ рак молочной железы (РМЖ) является самым распространенным раковым заболеванием среди женщин во всем мире и лидирует по показателям заболеваемости и смертности. Около четверти случаев РМЖ характеризуется гиперэкспрессией молекул Нег-2/ЕгЬВ-2 на поверхности клеток. Нег-2/ЕгЬВ-2 — член семейства тирозинки-назных рецепторов эпидермального фактора роста. Повышенная экспрессия этого рецептора на поверхности опухолевых клеток нередко наблюдается при раке молочной железы, легких, яичников и простаты и ассоциируется с неблагоприятным прогнозом.
Известно, что антитела к Нег-2/ЕгЬВ-2 обладают антипролиферативным действием, а цитотоксические Т-лимфоциты (CD8 + С^) обладают противоопухолевой активностью [5]. Однако по причине толерантности иммунной системы к собственным антигенам иммунный ответ против Нег-2 возникает слишком поздно и его интенсивность недостаточна для эффективной борьбы с опухолью. Т ем не менее, потенциально возможен Нег-2-специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ [2]. Известен ряд препаратов на основе моноклональных антител, способных атаковать раковые клетки, несущие на своей поверхности Нег-2-рецептор, но
все они обладают определенными недостатками. Помимо того что они обладают коротким временем действия, существует вероятность возникновения побочных эффектов и устойчивости к препарату.
Привлекательным и перспективным подходом к лечению онкологических заболеваний является ДНК-вакцинация, индуцирующая цитотоксические CD8 + Т-лимфоциты, которые являются главными эффекторными клетками противоракового иммунного ответа [1]. При ДНК-вакцинации, направленной на индукцию СТЦ в клетках макроорганизма последовательно происходят транскрипция гена искусственной антигенной конструкции, трансляция мРНК, про-теасомальный процессинг целевого иммуногенного белка и представление антигенных эпитопов на поверхности клеток в комплексе с молекулами МНС I класса CD8 + цитотоксическим Т-лимфоцитам. При эндосомальном процессинге эпитопы презентируют-ся на поверхности клетки в комплексе с молекулами МНС II класса (HLA-DR) Т-хэлперам (CD4 + ТЪ). В настоящее время в белке Нег-2/ЕгЬВ-2 идентифицировано большое количество Т-клеточных эпитопов (как CD8 + С1Ъ, так и CD4 + ТЪ), которые используются для разработки полиэпитопных вакцин.
Цель работы: конструирование искусственного поли-С^-эпитопного противо-опухолевого имму-
ногена ATI (Anti Tumor Immunogen) и кандидатной ДНК-вакцины против Her-2-позитивных опухолей, несущей ген ATI, а также оценка его экспрессии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для предсказания эпитопов белка Her-2/ErbB-2 использовалась программа NetMHC-3.0 (http://im-muneepitope.org). Дизайн целевого иммуногена ATI был осуществлен с использованием моделей Toes и соавт. [7] для предсказания протеасомного процессинга и моделей Peters и соавт. [6] для прогнозирования взаимодействия между пептидами и белками TAP (transporter associated with antigen processing). Г ен, кодирующий иммуноген ATI, был синтезирован и клонирован в составе плазмиды pcDNA 3.1, являющейся эукариотическим экспрессионным вектором, в результате получена ДНК-вакцина pcDNA-ATI. Для оценки экспрессии гена проводили трансфекцию клеток 293Т и окрашивание их цитоплазмы с помощью моноклональных антител Mab 29F2 (Вектор-Бэст) к эпитопу белка р24 ВИЧ и конъюгата антител козы против IgG мыши с пероксидазой хрена (Sigma) При окрашивании был использован субстрат 3.3'-диаминобензидина тетрагидрохлорид (Sigma). Клетки выращивали в 6-луночных культуральных планшетах (Costar) на среде DMEM (модификация Iscove) с 10% содержанием FBS (HyClone) и 5 мкг/мл гентамицина. Для трансфекции клеток использовали реагент FuGENE® HD (Roshe).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для конструирования целевого полиэпитопно-го иммуногена из последовательности белка ErbB-2 были отобраны CTL-эпитопы, рестриктированные девятью аллелями HLA I класса, чтобы учесть полиморфизм генов HLA и получить 90 — 95 % охват практически любой человеческой популяции. Из 31 отобранного CTL-эпитопа последовательности шести эпитопов были взяты из базы данных Immune Epitope Database (http://immuneepitope.org), тогда как последовательности 25 других эпитопов были предсказаны с помощью программы NetMHC-3.0. Кроме того, для тестирования иммуногенности проектируемой кандидатной ДНК-вакцины на мышах BALB/c были отобраны пять CTL-эпитопов, рестриктированных молекулами H-2Kd [2, 4].
Отобранные таким образом 36 CD8 + CTL-эпитопов затем были объединены в единую последовательность (polyCTL). При конструировании поли-CTL-эпитопной конструкции учитывались имеющиеся данные о процессинге и презентации антигенов, согласно которым индукция CD8+ CTL ответа при вирусной инфекции или ДНК-иммунизации происходит путем представления эндогенно экспрессируемых антигенов (в том числе вирусных или опухолевых) совместно с молекулами MHC I класса на поверхности клеток. При этом антигены распознаются специфическими CTL не как полноразмерные белки, а как короткие пептиды (8-12 а.о.), ассоциированные со специфическими молекулами МНС I класса. Эти короткие антигенные эпитопы появляются из цитоплазматических белков в результате протеасомного
процессинга [8]. После процессинга пептиды переносятся в просвет эндоплазмотического ретикулума с помощью транспортных белков — TAP1/TAP2 и связываются с образующимися молекулами MHC
I класса. Поэтому, чтобы обеспечить необходимый процессинг полученной полиэпитопной конструкции и презентацию освободившихся пептидов анти-генпрезентирующим клеткам, все эпитопы в составе целевой конструкции были фланкированы специфическими последовательностями, содержащими мотивы, которые по замыслу должны обеспечить протеасомное освобождение каждого антигенного пептида строго по С-концевому остатку, а также мотивы для связывания с TAP.
Для усиления ответа CD8+ CTL в состав вакцинной конструкции включен универсальный пептид ‘PADRE' (Pan DR Epitope), вызывающий ответы CD4+ T-лимфоцитов-хелперов. Для оценки экспрессии и метаболической стабильности целевого иммуногена в его состав был включен эпитоп белка р24 ВИЧ-1, с которым связываются моноклональные антитела 29F2. На N-конце полученной конструкции был помещен убиквитин (Ub), способствующий связыванию полиэпитопного иммуногена с протеасомой [3]. Для мониторинга экспрессии и метаболической стабильности целевого иммуногена в его состав был включен эпитоп белка р24 ВИЧ-1, с которым связываются Mab 29F2. Спроектированный таким образом искусственный иммуноген ATI имеет следующую структуру: Ub — polyCTL — PADRE — р24-эпитоп.
Синтезированный ген ATI был клонирован в составе плазмиды pcDNA 3.1. (рис. 1).
Ap-r CMVpr
ifi'ndlll(9i6)
Neo-r
Рис. 1. Плазмида pcDNA-ATI,
Подлинность сконструированной ДНК-вакцины pcDNA-ATI была подтверждена рестрикционным анализом и секвенированием фрагмента, содержащего ген и промоторную область. Плазмида была наработана в препаративных количествах в клетках Е.соН DH5aF' и использована для транс-
pcDNA-ATI J3CDNA3.1.
* *. ** я ?
Ä- « • 0
* . I • . *
• • # с * • * • , » * A t £ A
29F2-8 1/4000
Рис. 2. Клетки 293Т, трансфицированные плазмидами pcDNA-ATI и pcDNA 3.1.
фекции эукариотических клеток 293Т. Было показано, что окрашивание цитоплазмы клеток 293Т наблюдалось только при трансфекции плазмидой pcDNA-ATI, и не наблюдалось при трансфекции исходным вектором pcDNA 3.1, что подтверждает экспрессию гена ATI (рис. 2).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученная ДНК-вакцинная конструкция pcD-NA-ATI, кодирующая полиэпитопный противоопухолевый иммуноген ATI, является перспективным кандидатом ДНК-вакцины против рака молочной железы и для проведения доклинических исследований иммуногенности на лабораторных мышах и противоопухолевого действия на культурах клеток.
ЛИТЕРАТУРА
1. Балдуева И.А. Противоопухолевые вакцины // Практическая онкология. — 2003. — Т. 4. — С. 157-166.
2. Жукова Л.Г. Современные возможности и перспективы таргетной терапии при раке молочной железы // Практическая онкология. - 2010. -Т. 11. - С. 182-191.
3. Andersson H.A., Barry M.A. Maximizing Antigen Targeting to the Proteasome for Gene-Based
Сведения об авторах
Vaccines // Molecular Therapy. — 2004. — Vol. 10. — P. 432-446.
4. Nava-Parada P. et al. Nava-Parada P. Peptide Vaccine Given with a Toll-Like Receptor Agonist Is Effective for the Treatment and Prevention of Spontaneous Breast Tumors // Cancer Research. — 2007. — Vol. 67 (3). — P. 1326 — 1334.
5. Paula J. et al. DNA vaccination controls Her-
2 + tumors that are refractory to targeted therapies // Cancer Res. — 2008. — Vol. 68. — P. 7502 — 7511.
6. Peters B. et al. Identifying MHC class I epitopes by predicting the TAP transport efficiency of epitope precursors // J. Immunol. — 2003. — Vol. 171. — P. 1741 — 1749.
7. Santambrogio L. et al. Extracellular processing and presentation by immature dendritic cells // PNAS. — 1999. — Vol. 96, N 26. — P. 15056 — 15057.
8. Toes R.E. et al. Discrete Cleavage Motifs of Constitutive and Immunoproteasomes Revealed by Quantitative Analysis of Cleavage Products // J. Experiment. Med. — 2001. — Vol. 194, N 1. — P. 1 — 12.
9. York I.A., Rock K.L. Antigen processing and presentation by the class I major histocompatibility complex // Annual Review of. Immunology. — 1996. — Vol. 14. — P. 369 — 396.
Пирожкова Дарья Сергеевна - стажер-исследователь отдела иммунотерапевтических препаратов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (пос. Кольцово, Новосибирская обл.; e-mail: [email protected])
Смирнова Ольга Юрьевна - к.б.н., ведущий научный сотрудник отдела иммунотерапевтических препаратов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (пос. Кольцово, Новосибирская обл.)
Бажан Сергей Иванович - д.б.н., зав.теоретическим отделом ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (пос. Кольцово, Новосибирская обл.) Карпенко Лариса Ивановна - д.б.н., доцент, зав лабораторией рекомбинантных вакцин ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (пос. Кольцово, Новосибирская обл.)
Волкова Ольга Юрьевна - к.б.н., с.н.с. лабаротории иммуногенетика Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск)
Чикаев Николай Андреевич - к.б.н., с.н.с. лабаротории иммуногенетика Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск)
