CC BY
13
УДК 616.379-008.64: 612.34: 57.084.1
Упрощенная стрептозотоциновая модель сахарного диабета у мышей Nude
И. Г. Гвазава1,3, А. В. Косых1,3, О. С. Роговая1,3, О. П. Попова2, К. А. Собянин3, А. К. Хрущев3, А. В. Тимофеев3*, Е. А. Воротеляк1,3
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, 119334 Россия Национальный медицинский исследовательский центр «Лечебно-реабилитационный центр» Минздрава России, Москва, 125367 Россия
3Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова,
Москва, 117997 Россия
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 14.09.2020
Принята к печати 02.10.2020
DOI: 10.32607/actanaturae.11202
РЕФЕРАТ В доклинических исследованиях биомедицинских клеточных продуктов, предназначенных для трансплантационной терапии сахарного диабета типа 1, обязательно используют различные модели, в частности, стрептозотоциновые модели диабета у мышей. Эти модели должны быть фенотипически и патогенетически адекватными, т.е. должны имитировать клинические и метаболические проявления сахарного диабета типа 1 и быть сходными с этим заболеванием по механизмам патогенеза. Кроме того, поскольку биомедицинские клеточные продукты содержат клетки человека, моделировать диабет приходится на животных с иммунодефицитом. Нами описана максимально упрощенная стрептозотоциновая модель диабета у мышей Nude. Диабет индуцировали у 31 самца однократным внутрибрюшинным введением стрептозотоцина в 0.9% NaCl в дозе 150 мг/кг веса. Контрольным мышам (14 особей) вводили 0.9% NaCl. На протяжении 50 дней после введения стрептозотоцина периодически измеряли концентрацию глюкозы в плазме (КГП) не натощак. Ни одна мышь не погибла на протяжении всего срока наблюдения. Через 15 дней после введения стрептозотоцина у 22 из 31 (71%) мышей развился стабильный диабет (критерии стабильного диабета: КГП > 15 ммоль/л при всех измерениях и отсутствие ремиссии болезни). У мышей со стабильным диабетом средняя КГП за 35 дней равнялась 25.7 ммоль/л. На 50-й день средняя концентрация инсулина в плазме, среднее содержание инсулина в поджелудочной железе и среднее количество Р-клеток в островках Лангерганса у мышей со стабильным диабетом были соответственно в 2.6, 8.4 и 50 раз меньше, чем у контрольных животных. Мы считаем, что наша модель диабета у мышей Nude фенотипически и патогенетически адекватна и может использоваться в доклинических испытаниях антидиабетических биомедицинских клеточных продуктов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА модель, мыши Nude, сахарный диабет, стрептозотоцин.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БМКП - биомедицинский клеточный продукт; ВБТТГ - внутрибрюшинный тест на толерантность к глюкозе; КГП - концентрация глюкозы в плазме; ПЖ - поджелудочная железа; СД1 -сахарный диабет типа 1; СТЗ - стрептозотоцин.
ВВЕДЕНИЕ
За два последних десятилетия достигнуты немалые успехи в создании биомедицинских клеточных продуктов (БМКП) для трансплантационной терапии сахарного диабета типа 1 (СД1) [1]. Доклинические испытания таких БМКП обязательно включают оценку их антидиабетического (сахаропонижающего) эффекта на моделях диабета у животных. Наиболее популярны стрептозотоциновые модели диабета у мышей, что объясняется простотой, невысокой стоимостью и,
главное, патогенетической и фенотипической адекватностью этих моделей [2, 3]. Под патогенетической адекватностью понимается сходство механизмов развития стрептозотоцинового диабета у мышей и СД1 у человека: в обоих случаях болезнь обусловлена разрушением Р-клеток и, как следствие, дефицитом инсулина. Под фенотипической адекватностью понимается сходство проявлений стрептозотоцинового диабета и СД1: у мышей развивается гипергликемия, резко уменьшается количество Р-клеток в островках
Лангерганса, наблюдаются полиурия, полидипсия и потеря веса, падает жизнеспособность.
Есть два основных метода индукции стреп-тозотоцинового диабета у мышей: многократное введение низких доз стрептозотоцина (СТЗ) (40-60 мг/кг веса животного) на протяжении 4-5 дней либо однократное введение средних или высоких доз (100-250 мг/кг); первый метод несколько эффективней, но требует больших трудозатрат [2]. СТЗ вводят внутрибрюшинно или внутривенно - в одну из хвостовых вен либо (самцам) в вену полового члена. При внутрибрюшинном введении не исключены случайные проколы кишечника, что приводит к смерти животных, а возможное попадание СТЗ не в брюшинную полость, а в подкожную ткань ослабляет диабетогенное действие СТЗ [4]. Тем не менее внутрибрюшинное введение СТЗ, в силу своей простоты, применяется гораздо чаще, чем внутривенное.
Структурно и конформационно сходный с глюкозой СТЗ проникает в Р-клетки мышей с помощью глюкозного транспортера GLUT2. Поскольку СТЗ конкурирует с глюкозой за захват этим транспортером, для повышения эффективности индукции диабета рекомендуется перед введением СТЗ не кормить животных в течение как минимум 4 ч [5]. Однако Chaudhry и соавт. в экспериментах на мышах C57BL/6 и NOD/SCID показали, что эффективность индукции диабета одинакова при введении СТЗ натощак и не натощак [6]. Введение СТЗ не натощак более предпочтительно, так как при этом исключается стресс, обусловленный голоданием.
Традиционно считается, что СТЗ быстро теряет активность в растворах с нейтральным рН, поэтому во многих протоколах индукции стрептозотоцинового диабета рекомендуется растворять СТЗ в цитратном буфере с рН 4-4.5 [5, 7]. Даже небольшой объем ци-тратного буфера с такими низкими значениями рН может вызвать раздражение брюшины и существенный сдвиг кислотно-щелочного равновесия. Поэтому многие исследователи используют для растворения СТЗ нейтральные среды - фосфатный солевой буфер, сбалансированный солевой раствор Хэнка, 0.9% [4, 6, 8].
Необходимо отметить, что после введения больших доз СТЗ (> 200 мг/кг) у мышей быстро развиваются дегидратация (обусловленная гипергликемией и общим токсическим действием СТЗ) и тяжелая гипогликемия (обусловленная массивным высвобождением инсулина из разрушающихся Р-клеток). Для коррекции водно-электролитных нарушений животным подкожно вводят солевые растворы, а для купирования гипогликемии дают раствор сахарозы [5, 9]. Эти меры не нужны при использовании меньших доз СТЗ.
Изучение антидиабетического действия БМКП на мышах с диабетом сопряжено с рядом трудностей: •для проявления эффекта БМКП обычно требуется довольно большое время: от недель до месяцев. На протяжении этих сроков у мышей должен сохраняться стабильный диабет, т.е. частота спонтанной ремиссии болезни должна быть как можно меньше;
•уровень глюкозы в крови у мышей с диабетом должен быть намного выше, чем у интактных животных. Только в этом случае можно с уверенностью выявить эффект БМКП;
•для исследования влияния разных доз БМКП и/ или разных способов их трансплантации требуется много групп животных со стабильным диабетом, причем численность каждой группы должна обеспечивать статистическую надежность результатов. Поэтому эффективность индукции диабета (заболеваемость) должна быть максимальной, а смертность мышей с диабетом - минимальной;
•увеличение дозы СТЗ для повышения эффективности индукции диабета ведет к росту смертности мышей. Смертность удается уменьшить с помощью постоянной терапии небольшими дозами инсулина [9, 10], однако это усложняет работу с животными и затрудняет оценку эффектов БМКП;
•любой БМКП содержит клетки человека, ксе-ногенные по отношению к мышам-реципиентам. Поэтому в исследованиях антидиабетических БМКП приходится использовать животных, толерантных к ксеноантигенам, в частности мышей Nude. Данные о пригодности мышей Nude для моделирования диабета с помощью СТЗ довольно противоречивы. Некоторые исследователи считают, что эти мыши, в силу их генетической ущербности, особенно уязвимы для токсического действия СТЗ [7]. Другие доказывают, что мыши Nude вполне подходят для создания стрептозотоциновых моделей диабета, но все же прибегают к инсулинотерапии для повышения выживаемости животных [9].
Целью нашей работы был поиск максимально простой и надежной модели диабета у мышей Nude. Основная проблема, которую требовалось разрешить перед началом работы, заключалась в выборе дозы СТЗ. Анализ опубликованных данных показал, что у мышей Nude из разных питомников стабильный диабет удавалось индуцировать путем однократного введения СТЗ в дозах от 160 до 240 мг/кг, однако при использовании таких доз наблюдали значительную смертность животных: от 7 до 100% на протяжении 30 дней после введения СТЗ [4, 9, 11, 12]. В связи с этим было решено использовать меньшую дозу СТЗ. В предварительных экспериментах на мышах C57BL/6 мы установили, что у этих животных СТЗ в дозе 150 мг/кг обеспечивает приемлемую заболе-
ваемость диабетом и почти стопроцентную выживаемость (неопубликованные данные). Именно такую дозу мы применили для индукции диабета у мышей Nude.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Животные
Использовали самцов мышей Nude Crl:NU(NCr)-Foxn1nu; возраст 15-18 недель, средний вес 31.5 ± 3.3 г; питомник Charles River (Германия). Все работы с мышами выполняли в виварии барьерного типа. Животные получали стерилизованные корм и воду ad libitum и содержались при температуре 20-25оС и фоторежиме «12 ч света : 12 ч темноты». Работы проводили с разрешения Комиссии по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных РНИМУ им. Н.И. Пирогова от 27.03.2019 в соответствии с европейской Директивой по охране лабораторных животных 2010/63/EU.
Метод индукции диабета
Животных разделили на две группы - опытную (D, n = 31) и контрольную (C, n = 14). У мышей группы D индуцировали диабет однократным внутрибрю-шинным введением СТЗ (Sigma S0130, США) в дозе 150 мг/кг; за 4 ч до введения мышей лишали корма. СТЗ растворяли в холодном 0.9% NaCl непосредственно перед введением, объем инъекции составлял 450-550 мкл. Мышам группы C вводили 0.9% NaCl.
Методы оценки диабетогенного действия СТЗ
У всех животных определяли КГП не натощак до введения СТЗ (в нулевой день), на 8-й, 10-й дни и далее каждые 5 дней вплоть до 50-го дня после введения СТЗ, между 13:00 и 15:00. Для измерения КГП использовали глюкометр Contour TS и соответствующие тест-полоски (Bayer, Швейцария; регистрационные удостоверения Росздравнадзора 2007/00570 и 2008/01121). Работоспособность глюкометра и тест-полосок периодически проверяли с помощью контрольных растворов Contour с низкой, нормальной и высокой концентрацией глюкозы. Кровь для измерений КГП брали из надрезов кончика хвоста. При КГП > 33.3 ммоль/л на дисплее глюкометра отображался символ High. В таких случаях КГП считали равной 33.3 ммоль/л.
Диагноз диабета устанавливали при КГП > 15 ммоль/л при двух последовательных измерениях (например, на 8-й и 10-й дни). Диабет считали стабильным, если КГП > 15 ммоль/л регистрировалась при всех измерениях с 15-го по 50-й день наблюдения. Ремиссию диабета констатировали, если хотя бы
при одном измерении в период с 40-го по 50-й дни наблюдения КГП была меньше 15 ммоль/л.
На 50-й день у мышей группы D со стабильным диабетом и у мышей группы C провели внутрибрю-шинный тест на толерантность к глюкозе (ВБТТГ). Глюкозу вводили в дозе 2 г/кг, в 500 мкл 0.9% NaCl. На 0-й минуте (перед введением глюкозы), 15-й и 60-й минутах теста мышей наркотизировали изо-флураном (Baxter Healthcare Corporation, США), проводили торакотомию и брали 200-400 мкл крови из камер сердца шприцем с иглой 25G в пробирку с гепаринатом лития (Microvette 500-LH, Sarstedt, Германия). В цельной крови измеряли КГП, затем пробу центрифугировали и измеряли уровень инсулина в плазме методом ИФА (тест-система 10-1249-01, Mercodia, Швеция). После взятия крови мышей умерщвляли цервикальной дислокацией.
Одновременно с взятием крови на 0-й минуте ВБТТГ у мышей забирали поджелудочную железу (ПЖ) и делили ее на три фрагмента. Первый фрагмент фиксировали в 10% нейтральном формалине (BioVitrum, Россия), заключали в парафин и готовили срезы толщиной 4-5 мкм. Срезы инкубировали с антителами мыши к инсулину 035K4884 (1 : 1000; Merck/Sigma, США). Инсулинпозитивные клетки выявляли с использованием набора реагентов EnVision FLEX (Agilent/Dako K8000, Дания). Второй фрагмент замораживали в жидком азоте и готовили криостатные срезы (4 мкм). Эти срезы последовательно инкубировали с антителами кролика к инсулину ab181547 (1 : 200; Abcam, Великобритания) и с антителами против иммуноглобулинов кролика (1 : 500; Invitrogen Alexa Fluor Plus 488, A32790; ThermoFisher Scientific, США) и покрывали защитной средой с флуоресцентным красителем ядер DAPI (Vectashield Antifade Mounting Medium, H-1200, Vector Laboratories, США). Иммуноморфологические исследования проводили под микроскопом Nikon Eclipse 80i (Nikon, Япония). Третий фрагмент ПЖ использовали для оценки содержания инсулина в ткани ПЖ. Этот фрагмент подсушивали, взвешивали, измельчали ножницами в минимальном объеме воды и обрабатывали ультразвуком. Из полученной суспензии экстрагировали инсулин смесью этанола и соляной кислоты [13]; концентрацию инсулина в экстракте измеряли методом ИФА и нормировали на вес фрагмента.
В начале и в конце срока наблюдения измеряли вес мышей всех групп.
Методы обработки и статистического анализа данных
Использовали программу MedCalc Statistical Software (version 19.4.0, MedCalc Software Ltd,
100ч
90804
<и
\о 70-го s
_û 1-
<J
О ?
£ 30-
fü
Ш
Ф 20-
605040-
с
О
ю го
00
10
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Срок наблюдения, дни Число животных, не заболевших диабетом
31 31 12 9 9 9 9 7 6 6 6
Рис. 1. Заболеваемость диабетом в группе D (анализ методом Каплана-Мейера). Стрелкой указан момент введения СТЗ. Звездочкой отмечено начало ремиссии у одного из животных
Ostend, Belgium; https://www.medcalc.org; 2020). Нормальность распределения данных проверяли методом Шапиро—Уилка. Межгрупповые различия при нормальном распределении данных и однородности их дисперсий анализировали с использованием двустороннего i-теста Стьюдента, при нормальном распределении данных и неоднородных дисперсиях — i-теста Уэлча. Во всех случаях уровень значимости различий выбирали равным 5% (а-ошибка 0.05). Для оценки заболеваемости применили графический метод Каплана—Мейера. Результаты измерений КГП, веса животных, уровней инсулина в плазме и содержания инсулина в ПЖ в тексте представлены в виде средних и стандартных отклонений с указанием 95-процентных доверительных интервалов для средних, на рисунках — в виде средних и стандартных отклонений.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Эффективность индукции диабета
За весь срок наблюдения диабет развился у 25 мышей группы D (рис. 1), однако стабильный диабет наблюдался только у 22 животных. Таким образом, эффективность индукции стабильного диабета составила 71%. У одной из мышей с поздним развитием диабета вскоре произошла ремиссия; ни у одной мыши со стабильным диабетом ремиссии не было. Медиана заболеваемости равнялась 10 (10-15) дням. Ни одно животное в группе D не погибло на протяжении 50 дней после введения СТЗ.
Наши данные об эффективности индукции диабета и выживаемости трудно сравнивать с результата-
35
30
с 25 \ ¡2 20 О
I"
Е 10
-, ..о... -,
........j .....'?..........6.........л.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Срок наблюдения, дни — D (п = 22) -о- С (п = 14)
Рис. 2. Динамика КГП у мышей группы D со стабильным диабетом и у мышей группы С на протяжении всего срока наблюдения. Стрелкой указан момент введения СТЗ
ми других исследовании, поскольку в них использовали мышей Nude из иных питомников и применяли иные дозы СТЗ. Например, Deeds и соавт. проводили эксперименты на мышах из питомника Taconic Farms (США). После введения СТЗ в дозе 220 мг/кг у 92.5% животных уже на 5-й день развился тяжелый диабет, но при этом смертность к 20-му дню составила 20% [4]. В исследовании Graham и соавт. у мышей из питомника Charles River (США) стабильный диабет развился на 5-й день после введения 240 мг/кг СТЗ, а смертность к 30-му дню составила всего 8%. Однако такая низкая смертность была обусловлена тем, что животные на протяжении всего срока исследования получали инсулинотерапию [9]. В работе Zhao и соавт. эффективность индукции диабета у мышей из питомника Shanghai Slacass (Китай) на 8-й день после введения 200 мг/кг СТЗ составила 100%, но все мыши погибли на 30-й день [12]. Таким образом, наша «среднедозовая» модель диабета уступает «высокодозовым» моделям в эффективности индукции болезни, но выгодно отличается от них по такому важнейшему показателю, как выживаемость животных.
Динамика КГП
Гипергликемия в диабетическом диапазоне (КГП > 15 ммоль/л) наблюдалась у мышей группы D со стабильным диабетом, начиная с 8-го дня после введения СТЗ (рис. 2). Средние групповые КГП за весь срок наблюдения у мышей группы D со стабильным диабетом и у мышей группы C составили 25.7 ± 3.5 (24.1-27.2) и 7.5 ± 0.3 (7.1-7.8) ммоль/л, а площади под кривыми КГП за весь срок наблюдения составили 1258 ± 172 (1184-1332) и 365 ± 13 (349-382) ммоль/л х 50 дней соответственно; в обоих случаях P < 0.0001;
5
0
35
30
25
20
Р = 0.02
I-1
D (n = 22)
□ 1-й день
Р < 0.001
I-1
C (n = 14) 50-й день
Рис. 3. Вес мышей группы D со стабильным диабетом и мышей группы С в начале и в конце срока наблюдения
35 30 25 20 15 10 5 0
450 400 350 300 250 200 150 100 50 0
n = 6
Y
n = 6
n = 6 n = 6
n = 6 #—■
n = 6
n = 4
n = 4
n = 6 —#—
n = 6
-f
n = 4
n = 4
n = 6 —#
0 10 20 30 40 50 60 70 Время после введения глюкозы, мин -о-С -9-0
Рис. 4. Изменения Кгп и уровней инсулина в плазме крови мышей группы 0 со стабильным диабетом и мышей группы С при ВБТТГ
t-тест Стьюдента. Наши результаты оценки Кгп в группах D и C близки к результатам Deeds и со-авт. [4]. В этом исследовании у мышей Nude средняя Кгп не натощак в норме составляла 7.7 ± 1.1 ммоль/л, а через 7 дней после введения СТЗ повысилась до 28.6 ± 5.3 ммоль/л и сохранялась на этом уровне в течение 20 дней.
Изменения веса мышей
К концу срока наблюдения у мышей со стабильным диабетом вес снизился в среднем на 4.8 ± 0.9%, тогда как в группе C вес увеличился на 13 ± 5.8% (рис. 3). Потеря веса у грызунов со стрептозотоциновым диабетом многократно описана и не нуждается в обсуждении.
Результаты внутрибрюшинного теста на толерантность к глюкозе (ВБТТГ) Базальные уровни инсулина (на 0-й минуте ВБТТГ) у мышей группы D со стабильным диабетом были в 2.6 раза ниже, чем у мышей группы C, и составляли 67 ± 17 (49-85) и 174 ± 31 (141-207) пмоль/л соответственно; P < 0.0001; t-тест Стьюдента (рис. 4).
Площади под кривыми уровня глюкозы у мышей со стабильным диабетом и у интактных мышей составляли 1870 ± 108 (1757-1982) и 996 ± 160 (827-1163) ммоль/л х 60 мин; площади под кривыми уровня инсулина составляли 3770 ± 849 (2879-
4661) и 20008 ± 4052 (15755-24260) пмоль/л х мин соответственно; в обоих случаях P < 0.0001; t-тест Стьюдента.
Наблюдавшаяся нами динамика Кга и уровней инсулина при ВБТТГ у интактных мышей Nude была сходна с динамикой этих показателей в аналогичных тестах, проводившихся как на мышах Nude, так и на мышах иных линий. Так, в работе Christoffersson и соавт. максимальная Кга у интакт-ных мышей Nude, зарегистрированная через 15 мин после внутрибрюшинного введения глюкозы в дозе 2.5 мг/кг, составляла примерно 17 ммоль/л, а площадь под кривой уровня глюкозы равнялась примерно 800 ммоль/л х 60 мин [14]. Harper и соавт. показали, что у интактных беспородных мышей из разных питомников уровни инсулина на 0-й минуте варьировали между 120 и 200 пмоль/л, а максимальные уровни инсулина регистрировались на 15-й минуте после введения глюкозы и варьировали между 165 и 280 пмоль/л [15].
В нашей работе у мышей со стабильным диабетом уровни инсулина в плазме были довольно существенными на всех сроках ВБТТГ. Следовательно, даже на фоне тяжелого диабета у мышей Nude сохраняется некоторое количество функционально активных р-клеток. Остаточная секреция инсулина наблюдается и у больных СД1 на протяжении нескольких лет после клинического проявления болезни [16]. Таким
Рис. 5. Содержание инсулина в ПЖ мышей группы D со стабильным диабетом и у мышей группы С на 50-й день наблюде-
£ у
с
и I
Р = 0.0012
Ъ,.: , ¿i
, t щ
If
C (n = 6) D (n = 6)
C D
Рис. 6. Островки ПЖ мышей группы С и мышей группы D со стабильным диабетом на 50-й день наблюдения. Световая микроскопия, иммунопероксидазное окрашивание на инсулин, Х400. Масштабный отрезок = 100 мкм
образом, наличие инсулина в плазме мышей группы D со стабильным диабетом подтверждает фенотипи-ческое сходство нашей модели диабета с СД1.
Содержание инсулина в поджелудочной железе
На 50-й день наблюдения среднее содержание инсулина в ПЖ мышей группы D со стабильным диабетом и у мышей группы C составляло соответственно 0.7 ± 0.3 (0.2-1.1) и 5.9 ± 0.6 (4.2-7.7) мкг/г веса железы, P < 0.0001, t-тест Уэлча (рис. 5).
Согласно опубликованным данным, содержание инсулина в ПЖ мыши колеблется в широких пределах: у здоровых животных - от 2.5 до 80 мкг/г, у животных со стрептозотоциновым диабетом - от 0.2 до 20 мкг/г веса ПЖ [3, 8, 12]. Такая вариабельность объясняется межлинейными, возрастными и половыми различиями животных, разной длительностью и тяжестью диабета, разнообразием материала (целая ПЖ, отдельные доли ПЖ) и методов экстракции инсулина. Но в конечном счете при оценке степени повреждения Р-клеток важны не абсолютные количества инсулина в ПЖ больных и здоровых животных, а соотношение этих количеств. Например, в нашей работе содержание инсулина в ПЖ мышей со стабильным диабетом на 50-й день после введения СТЗ было в 8.9 раза меньше, чем у интактных животных, а в исследовании Zhao и соавт. на 25-й день после введения СТЗ в дозе 200 мг/кг содержание инсулина в ПЖ мышей с диабетом было в 18 раз меньше, чем у здоровых животных [12].
Патоморфологические исследования ПЖ
К 50-му дню наблюдения у животных со стабильным диабетом сильно снизилась численность Р-клеток в островках, появились очаги интра- и периинсу-лярного склероза (рис. 6). Путем прямого подсчета Р-клеток (рис. 7) мы уточнили, что их количество в островках мышей со стабильным диабетом уменьшается примерно в 50 раз по сравнению с контролем. Подобная патоморфологическая картина типична
Р-клетки
Ядра
Совмещение
• t,
, хушщ 4
Рис. 7. Островки мышей группы C и мышей группы D со стабильным диабетом на 50-й день наблюдения. Флуоресцентная микроскопия, Х200. Р-Клетки: окрашивание на инсулин; ядра: окрашивание DAPI. Масштабный отрезок = 100 мкм
для диабета у мышей, индуцированного однократным введением средней или большой дозы СТЗ [4, 12].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Перечислим достоинства нашей модели диабета:
•использование мышей Nude позволяет трансплантировать животным ксеногенные БМКП, содержащие клетки человека;
•максимальное упрощение методики индукции диабета: СТЗ вводится однократно внутрибрюшинно;
• поскольку для растворения СТЗ используется 0.9% NaCl, а не буферный раствор с низким pH, исключено раздражение брюшины и снижен общетоксический эффект СТЗ;
•эффективность индукции диабета составляет примерно 71%, при этом выживаемость животных равна 100%. Это дает возможность формировать несколько опытных групп мышей с численностью, достаточной для получения статистически надежных экспериментальных результатов;
8
6
4
ния
2
0
•использование средневысоких доз СТЗ не требует коррекции водно-электролитного баланса и поддерживающей инсулинотерапии;
•стабильный диабет сохраняется в течение длительного времени: с 15-го по 50-й день после введения СТЗ. Этот срок достаточен для оценки антидиабетического эффекта БМКП;
•измерения КГП проводятся не натощак. Тем самым у животных исключен стресс, обусловленный длительным голоданием;
• у животных со стабильным диабетом КГП намного выше, чем у контрольных животных, и нет спонтанной ремиссии болезни, что упрощает оценку антидиабетического эффекта БМКП;
•модель фенотипически и патогенетически сходна с СД1 у человека;
• модель позволяет проводить биохимические, гормональные и патоморфологические исследова-
ния, необходимые для оценки антидиабетического эффекта БМКП.
Мы считаем, что наша модель диабета у мышей Nude вполне подходит для доклинических испытаний антидиабетических БМКП и удобна для исследователей. Единственный недостаток нашей модели - сравнительно невысокая эффективность индукции диабета. Это обстоятельство нужно учитывать при расчете исходного количества животных. •
Исследование выполнено при поддержке гранта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-15-2020-773).
Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Loretelli C., Assi E., Seelam A.J., Ben Nas M., Fiorina P. // Expert Opin. Biol. Ther. 2020. № 3. P. 1744-1768.
2. Gvazava I.G., Rogovaya O.S., Borisov M.A., Vorotelyak E.A., Vasiliev A.V. // Acta Naturae. 2018. V. 10. № 1. P. 24-33.
3. King A.J.F., Estilles E., Montanya E. // Methods Mol. Biol. 2020. V. 2128. P. 135-147.
4. Deeds M.C., Anderson J.M., Armstrong A.S., Gastineau D.A., Hiddinga H.J., Jahangir A., Eberhardt N.L., Kudva Y.C. // Lab. Anim. 2011. V. 45. № 3. P. 131-140.
5. Diabetic Complications Consortium. High-dose streptozoto-cin induction protocol (mice). 2015. https://www.diacomp.org/ shared/protocols.aspx.
6. Chaudhry Z.Z., Morris D.L., Moss D.R., Sims E.K., Chiong Y., Kono T., Evans-Molina C. // Lab. Anim. 2015. V. 47. № 4. P. 257-265.
7. Estilles E., Tellez N., Nacher M., Montanya E. // Cell Transplant. 2018. V. 27. № 11. P. 1684-1691.
8. Kintoko K., Xu X., Lin X., Jiao Y., Wen Q., Chen Z., Wei J., Liang T., Huang R. // Arch. Med. Sci. 2018. V. 14. № 5. P. 1163-1172.
9. Graham M.L., Janecek J.L., Kittredge J.A., Hering B.J., Schuurman H.J. // Comp. Med. 2011. V. 61. № 4. P. 356-360.
10. Cavelti-Weder C., Li W., Zumsteg A., Stemann-Andersen M., Zhang Y., Yamada T., Wang M., Lu J., Jermendy A., Bee Y.M., et al. // Diabetologia. 2016. V. 59. № 3. P. 522-532.
11. Ricordi C., Kneteman N.M., Scharp D.W., Lacy P.E. // World J. Surg. 1988. V. 12. № 6. P. 861-865.
12. Zhao T., Luo D., Sun Y., Niu X., Wang Y., Wang C., Jia W. // J. Mol. Histol. 2018. V. 49. № 4. P. 419-428.
13. Mercodia Technical Note No 334-0137 v.4.0. Analysis of insulin, C-peptide or proinsulin from acid ethanol extractions from islets, cells or tissue. Mercodia AB, 2019.
14. Christoffersson G., Henriksnas J., Johansson L., Rolny C., Ahlstrom H., Caballero-Corbalan J., Segersvard R., Permert J., Korsgren O., Carlsson P.O., et al. // Diabetes. 2010. V. 59. № 10. P. 2569-2578.
15. Harper J.M., Durkee S.J., Smith-Wheelock M., Miller R.A. // Exp. Gerontol. 2005. V. 40. № 4. P. 303-314.
16. Miller R.G., Yu L., Becker D.J., Orchard T.J., Costacou T. // Diabet. Med. 2020. V. 37. № 8. P. 1386-1394.
