CC BY
37
УДК 576.535.+577.722 Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2004, вып. 3
М. В. Доброгорская, Г. А. Сакута, О. А. Займидорога,
А. И. Пшендин, В. Н. Самойлов, В. И. Морозов
ДЕ-ВОДА КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ АНТИДИАБЕТИЧЕСКИЙ АГЕНТ И ЕЕ ВЛИЯНИЕ НА РОСТОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КЛЕТОК ИНСУЛИНОМЫ КРЫС В КУЛЬТУРЕ
Высокая распространенность и понимание причин возникновения диабета выдвигают на одно из важных мест проблему не только его лечения, но и профилактику, что позволяет отсрочить, а возможно, и предупредить развитие диабета. Настоящая работа предпринята с целью изучения антидиабетического действия деионизированной воды - де-воды, которая получена посредством глубокой очистки от ионов металлов и понижением' содержания дейтерия и характеризуется высочайшей степенью чистоты (удельное сопротивление равно 18 Мом • см). Доля органических примесей составляет менее 3 • 10"9 объемных долей. Высокая степень чистоты де-воды, определяющая ее особые физические свойства, позволяет рассчитывать на определенное биологическое действие, направленное на стабилизацию мембранных структур клетки. На модели стрептозотоцинового диабета (диабет I типа), развитой на крысах, показано, что инъекция стрептозотоцина на фоне превентивного перо-рального введения де-воды "животным и ее последующее ежедневное введение в течение одной недели позволяют предотвратить развитие диабета у крыс. В экспериментах, проведенных на культуре бета-клеток инсулиномы крысы, RIN m 5F обнаружено, что де-вода не только усиливает пролиферативную активность клеток, но и обладает протективным действием, защищая клетки от гибели в присутствии стрептозотоцина.
Ключевые слова: стрептозотоциновый диабет, профилактика, де-вода, инсулинома.
Высокая распространенность (около 5% населения России) и тяжелые осложнения, ведущие к инвалидности и укорочению жизни больных, ставят сахарный диабет (СД) в ряд социальных болезней, требующих проведения серьезных профилактических мероприятий и дальнейших исследований [1, 3].
Сахарный диабет - заболевание, в патогенезе которого обязательным компонентом является абсолютный или относительный недостаток инсулина в организме, вызывающий нарушение обмена веществ и патологические изменения в различных органах и тканях [1, 4]. Первичным метаболическим дефектом при СД является нарушение переноса глюкозы и аминокислот через цитоплазматические мембраны в зависимые от инсулина ткани. Угнетение трансмембранного транспорта этих веществ обусловливает все остальные метаболические сдвиги. За последние годы окончательно сформировалось мнение, что СД генетически и патофизиологически представляет собой гетерогенный синдром гипергликемии, при этом наибольшее значение в развитии СД придают наследственному фактору.
Хорошо известно, что практически во всех тканях организма на обмен углеводов, жиров, белков и электролитов влияет инсулин, увеличивая транспорт глюкозы, аминокислот и других веществ через мембрану клетки. Свое биологическое действие на уровне клетки инсулин осуществляет через соответствующий рецептор, который представляет собой тетрамерную белковую Структуру, являющуюся составной частью мембраны клетки [1]. Основное действие инсулина заключается в усилении транспорта глюкозы через мембрану клетки. Стимуляция инсулином приводит к увеличению скорости поступления глюкозы внутрь клетки в 20-40 раз. Транспорт глюкозы через мембрану клетки осуществляется белками-транспортерами. При стимуляции инсулином наблюдается увелйчение в 5-10 раз содержания транспортных белков глюкозы в плазматических мембранах при одновременном
© М. В. Доброгорская, Г. А. Сакута, О. А. Займидорога, |А. И. Пшендин1 В. Н. Самойлов, В. И. Морозов, 2004
уменьшении на 50-60% их содержания во внутриклеточном пуле. Требующаяся при этом энергия в виде АТФ необходима в основном для активации инсулинового рецептора, а не для фосфорилирования белка-транспортера. Стимуляция транспорта глюкозы сопровождается увеличением потребления энергии в 20-30 раз, тогда как для перемещения транспортеров глюкозы требуется лишь незначительное ее количество. Идентифицированы два класса транспортеров глюкозы: №+-глюкозный котранспортер и пять изоформ собственных транспортеров глюкозы [1]. Инсулин, факторы роста, перорально вводимые препараты, снижающие уровень сахара, ванадий, глюкокортикоиды, цАМФ, голодание, дифференци-ровка клеток и протеинкиназа С являются факторами, регулирующими экспрессию транспортеров глюкозы.
В настоящее время при терапии СД типа I широко используют различные препараты . инсулина. Помимо инсулина, являющегося по сей день единственным наиболее эффективным средством, существует целый набор препаратов, позволяющих добиться определенного улучшения состояния пациента за счет снижения уровня глюкозы в крови. Вместе с тем в том случае, когда речь идет о профилактике диабета, важно иметь препараты, позволяющие осуществлять коррекцию звеньев метаболизма, страдающих при диабете. Одним из таких препаратов может быть де-вода, изучение которой начато нами на модели стрептозотоци-нового диабета у крыс. Де-вода получена с помощью глубокой очистки от ионов металлов и характеризуется высочайшей степенью чистоты (удельное сопротивление 18 Мом • см). Содержание дейтерия в ней понижено примерно на 20%. Доля органических примесей составляет менее 3 • 10"9 объемных долей. Столь высокая степень чистоты, определяющая особые физические свойства де-воды, дает, основание предположить о ее биологической активности, направленной на стабилизацию мембран клетки. С точки зрения изучения сделанного предположения о механизме действия де-воды очень интересные возможности может дать использование культуры клеток инсулиномы.
Экспериментальный диабет может быть индуцирован у крыс с помощью введения стрептозотоцина (производное глюкозы - Ы-[метилнитрозокарбамоил]-0-глюкозамин). Еще в 1963 г. было обнаружено, что антибиотик стрептозотоцин, обладающий ростингиби-рующим действием на некоторые экспериментальные опухоли, при введении собакам и крысам вызывает у них диабет [2]. Уже в течение одного часа после внутривенного введения можно обнаружить гистологические повреждения бета-клеток, а через 7ч- избирательную некротическую деструкцию этих клеток. Было установлено, что при использовании стрептозотоцина диапазон между эффективной и общетоксической дозой более широк, чем при использовании аллоксана, и стрептозотоциновый диабет оказывается более «чистым», чем аллоксановый [2].
Этиология диабета указывает на генетически предопределенные, а также приобретенные (метаболические, инфекционные) механизмы, определяющие повреждения мембран бета-клеток поджелудочной железы и трансмембранного переноса глюкозы. Предполагая, что функциональное состояние мембран безусловно зависит от водного окружения (собственно воды и растворенных в ней веществ), целью нашего исследования были изучение антидиабетического действия де-воды, обладающей особыми физическими свойствами, на развитие стрептозотоцинового диабета у крыс, а также исследование механизмов этого действия на клетках инсулиномы в культуре. «
Материалы и методы. Эксперименты со стимулированным диабетом выполнены на белых беспородных крысах-самцах весом 160-180 г (около 2 мес.) из питомника «Раппалово». Для индукции диабета у подопытных крыс использовали стрептозотоцин фирмы «Sigma» (США). Этот антибиотик оказывает прямое токсическое действие на бета-клетки поджелудочной железы крыс и собак, вызывая некроз этих клеток. Препарат в различных концентрациях вводили внутрибрюшинно в 0,05 моль/л натрий-цитратном буфере рН 4,5, Для доказательства зависимости от инсулина полученной модели диабета животным вводили препарат инсулина «Хумулин» (фирма «Эли Лилли», США). Де-воду вводили перорально с помощью шприца, снабженного толстой иглой, конец которой был соответствующим образом обработан, чтобы предотвратить травмирование роговой полости и пищевода и облегчить прохождение зонда.
Кровь для анализа отбирали из хвостов животных. Определение глюкозы проводили или в сыворотке крови (прямой анализ), или в цельной крови (анализ с предварительной депротеинизацией) с использованием наборов реактивов фирмы «Витал Диагностике» (Санкт-Петербург). Результаты анализов, выполненных обоими методами, были хорошо сопоставимы.
»
В работе была также использована культура клеток инсулиномы крысы RIN m 5F, полученная из Банка Российской коллекции клеточных культур (ИНЦ РАН, Санкт-Петербург). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 («Sigma», США), приготовленной на обычной воде и на де-воде, с добавлением 10%-ной бычьей эмбриональной сыворотки и 40 мкг/мл антибиотика гентамицина. Культуральная среда была приготовлена растворением порошковой среды RPMI-1640 в обычной деионизированной воде и де-воде. Для удаления бактериальных загрязнений приготовленные среды фильтровали через фильтры 0,22 ц («Sigma», USA). Клетки высевали в концентрации 200 тыс. кл/мл в 24-луночную плату («Nunc», США), при этом 12 ячеек содержали клетки в среде, приготовленной на де-воде, и 12 ячеек - на обычной воде. Через 1,2 и 3 суток клетки снимали с подложки с помощью смеси трипсина с версеном (1:1) и после окраски трипановым синим подсчитывали в камере Горяева общее количество и соотношение живых и погибших клеток. Для оценки активности синтеза ДНК в ячейки планшета через одни сутки после посева клеток вносили [5Н]-тимидин (1 |iCi), клетки экспонировали двое суток, снимали смесью трипсина с версеном, отмывали от неспецифически связанной радиоактивности и просчитывали на жидкостно-сцинтилляционном счетчике «Beckman», используя сцинтилляционный коктейль на основе диоксана.
Статистическую обработку данных проводили, используя программу «Microsoft Excel». Данные представлены как X ± S.D. Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента. Различия считали достоверными при р < 0,05.
Результаты и обсуждение. Влияние де-воды на динамику диабета у крыс. На начальном этапе работы основное внимание было сосредоточено на воспроизведении модели стрептозотоцинового диабета у крыс, оценке действия инсулина у диабетических крыс для доказательства инсулин-зависимой природы используемой модели диабета и исследовании возможности применения де-воды в качестве антидиабетического средства в условиях ее перорального введения на разных сроках развития диабета.
Литературные данные свидетельствуют о том, что развитие стрептозотоцинового диабета у крыс может быть индуцировано введением существенно различающихся доз стрептозотоцина - 35-70 мг на кг веса [5-8]. Отработку диабетической модели начали с введения препарата в дозе 40 мг/кг 15 крысам. 1-я инъекция (40 мг/кг) не вызвала изменения концентрации глюкозы в крови. Лишь после повторного введения препарата (45 мг/кг) появились животные с повышенным уровнем" глюкозы в крови. 3-я инъекция стрептозотоцина из расчета 50 мг/кг веса позволила получить диабетическую концентрацию глюкозы в крови у всех подопытных крыс.
Основываясь на этих данных и учитывая то, что по планировавшимся экспериментам удобно было получить диабет после однократного введения препарата, в последующих экспериментах животным вводили стрептозотоцин в дозе 60-65 мг/кг веса. Вместе с тем оказалось, что и эти высокие дозы препарата при однократном введении индуцировали диабет у 40-60 % животных. Тем не менее такой результат мы посчитали удовлетворительным и указанную дозу стрептозотоцина применяли в последующих экспериментах.
Доказательства инсулин-зависимой природы стрептозотоцинового диабета. На крысах с диабетом, индуцированным стрептозотоцином, был поставлен эксперимент по исследованию динамики изменения концентрации глюкозы крови при однократном подкожном введении инсулина (из расчета 0,06 ед. на 100 г веса животного):
Время, ч ~ 0 1 2 3 4
Глюкза, ммоль/л 17,9±3,5 4,7 ±1,1* 2,4 ±0,6** 2,6 ±0,5** 1,1 ±0,2**
*р < 0,01; **р < 0,001 (по сравнению с начальной точкой «0» ч).
Уже через один час после инъекции гормона концентрация глюкозы в крови падала почти в 4 раза, и это снижение продолжалось вплоть до 4 ч (последняя точка наблюдения), когда уровень глюкозы был в 17 раз ниже исходного. Такая реакция глюкозы крови однозначно указывает на инсулин-зависимый характер полученной диабетической модели.
Исследование возможности применения де-воды в качестве антидиабетического средства в условиях ее перорального введения на разных сроках развития диабета. Исходя из тех соображений, что возможное практическое применение де-воды наиболее удобно осуществлять перорально, этот способ введения и был применен нами на крысах. При выборе объема де-воды учитывали вес крыс, которым в данном эксперименте вводили по 1,5 мл препарата. При этом исследовали возможность использования де-воды: 1) для пре-
дотвращения развития диабета и 2) для лечения заболевших диабетом животных. Уровень глюкозы, превышающий 10 ммоль/л, расценивали как диабетический. В эксперименте участвовали 4 группы крыс (табл. 1). Всем животным были сделаны внутрибрюшинные инъекции стрептозотоцина из расчета 65 мг/кг веса. Животным группы I (№ 1-7) за 40 мин до инъекции стрептозотоцина перорально вводили 1,5 мл де-воды (однократное введение). Крысам группы II (№ 8-14) за 40 мин до инъекции стрептозотоцина животным перорально вводили 1,5 мл де-воды, и далее введение де-воды в том же объеме продолжали один раз в день в течение одной недели (7 введений). Животным группы III (№ 15-21) за 40 мин до инъекции стрептозотоцина перорально вводили 1,5 мл дистиллированной воды (контроль на введение), и далее введение дистиллированной воды в том же объеме продолжали один раз в сутки в течение одной недели (7 сут.). Всего было сделано 7 введений. Крысам группы IV (№ 22-28) введение де-воды (1,5 мл один раз в день) начинали через одну неделю после индукции диабета. Всего было сделано 8 введений.
Результаты измерения концентрации глюкозы в крови животных приведены в табл. 1. Средняя концентрация глюкозы, рассчитанная по 49 животным, составила 4,1 ± 1,7 ммоль/л (X ± БЭ).
Таблица 1. Концентрация глюкозы в крови крыс в процессе эксперимента
Дата исследования
№ крысы 21.12.03 28.12.03 06.01.03 12.01.03
Концентрация глюкозы, ммоль/л
1-й 4,1 4,0 6,7 ' 7,8
2-й 5,3 • 2,3 20,2 18,6
3-й 4,1 3,2 - 7,9
4-й 4,8 4,7 8,7 7,8
5-й 2,8 ' 1,6 7,0 4,0
6-й 1,6 10,5 20,0 18,5
7-й 1,3 9,3 19,5 15,0
Кол-во крыс с диабетом (I) - I 3 3
8-й 5,1 6,5 7,3 4,3
9-й 2,8 5,2 4,0 4,8
10-й 3,5 5,1 5,0 4,4 '
11-й 1,6 5,5 4,0 7,8
12-й 1,9 4,3 5,3 7,7
13-й . 6,0 5 Л 5,0 6,6
14-й 5,8 3,5 5,7 5,5
Кол-во крыс с диабетом (11) _ 0 0 0
15-й 6,0 3,2 20,0 18,7
16-й 4,4 5,9 7,0 7,8
17-й 4,8 8,8 21,3 21,8
18-й 6,0 25,4 31,7 26,6
19-й 6,1 6,3 7,7 5,6
20-й 6,4 7,5 / ' 4,7. 6,6
21-й 3,7 7,6 20,0 18,5
Кол-во крыс с диабетом (III) - 1 4 4
22-й 3,9. 1,3 7,7 10,6
23-й 4,8 • ' 2,1 4,0 7,7
24-й 4,2 2,7 7,3 7,7
25-й 5,7 3,0 11,3 4,3
26-й 1,6 1,5 4,7 8,6
27-й . 6,0 11,1 30,0 18,6
28-й 3,5 2,0 9,3 7,6
Кол-во крыс с диабетом (IV) - 1 2 2
Данные эксперимента свидетельствуют о том, что однократное введение де-воды до инъекции стрептозотоцина не исключает возможности последующего заболевания животных диабетом (группа I). Однократное введение де-воды до инъекции стрептозотоцина и введение ее в течение одной недели предотвратило развитие диабета у крыс (группа II). Введение де-воды, начатое через одну неделю после индукции диабета, не привело к восстановлению уровня глюкозы в крови до нормального у двух животных, заболевших диабетом в этой группе (IV). В контрольной группе (III) примерно у 60% крыс развился диабет.
Влияние де-воды и стрептозотоцина на культуру клеток инсулиномы крысы. На первом этапе работы было оценено влияние де-воды на рост культуры клеток инсулиномы (RIN m 5F) крысы, а также действие стрептозотоцина на клетки инсулиномы. Для выяснения механизма протективного действия де-воды были проведены эксперименты по влиянию де-воды на рост культуры ß-клеток (RIN m 5F) поджелудочной железы крысы.
Обнаружили, что при культивировании клеток RIN m 5F на среде с де-водой через двое суток общее количество клеток в 1,5 раза превышает таковое на обычной среде (725 тыс./мл против 487 тыс./мл) при примерно одинаковом соотношении живых и погибших клеток (74:26% и 70:30%). Внесение в культуральную среду стрептозотоцина в концентрации 800 мкг/мл, практически не действуя на клетки, растущие на среде с де-водой, снижает содержание клеток в ячейках с обычной средой на 75%. Опыты с включением в культивируемые клетки рНЗ-тимидина показали примерно 20%-ное увеличение активности ДНК-синтеза в клетках, растущих на среде с де-водой (табл. 2).
Таблица 2. Включение }Н-тимидина клетками RIN ш SF
№ опыта Среда
RPMI-1640/контроль, % RPMI-1640/ де-вода, %
1-й 100 117
2-й. 100 124
Необходимо отметить, что при проведении экспериментов, результаты которых представлены в табл.2, клетки перед посевом были суспендированы в RPMI-1640, приготовленной на обычной дистиллированной воде и на де-воде. В том случае, если все клетки были суспендированы и рассеяны в контрольной среде, приготовленной на дистиллированной воде, а через одни сутки после распластывания клеток эту среду заменяли на контрольную и опытную, одновременно внося [3Н]-тимидин, различий во включении не получили. Другое сопутствующее наблюдение, сделанное в экспериментах на культуре клеток, состоит в том, что де-вода обладает в определенной мере бактерицидным или бактериостатиче-ским действием, предотвращая бактериальный пророст в культуре RIN m 5F. Здесь же надо заметить, что опыт 2-й был поставлен через один месяц после опыта 1-го. Вместе с тем видно, что среда, приготовленная на де-воде, своих свойств за это.время не потеряла.
Результаты экспериментов на клеточной культуре RIN m 5F свидетельствуют о том, что де-вода не только усиливает пролиферативную активность клеток, но и обладает про-тективным действием, защищая клетки от гибели в присутствии стрептозотоцина.
Представленные в работе данные позволяют заключить, что де-воду в определенной мере можно рассматривать как антидиабетический агент, обладающий способностью препятствовать развитию диабета I типа у крыс, индуцированного введением стрептозотоцина. В основе этого действия препарата может лежать обнаруженное in vitro на клетках инсулиномы усиление пролиферативной активности под влиянием де-воды, а также ее цитопро-тективное действие в отношении стрептозотоцина.
Статья рекомендована проф. В. Н. Кокряковым.
Summary
Dobrogorskaya M. V., Sakuta G. A. ZaimidorogaO. A.. \Pshendin A. /.j Samoilov V. N.. Morozov V. 1. «De-water» is a potential antidiabetic remedy and its effect on growth of rat insulinoma cell line.
De-water was prepared by deep purification from mineral and organic admixtures. De-water specific resistance was 18 Mom • cm, organic admixture made up about 3 • 10"® parts by volume. It was tested as a potential antidiabetic remedy for prevention and treatment of streptozotocin diabetes induced in rats. If delivering de-water per so began before streptozotocin injection and went on during a week afterwards it could stop the development of diabetes. But attempt to use de-water for treatment the developed diabetes failed. Cultural medium prepared with de-water stimulated the growth of rat insulinoma cell in vitro and protected cells from death. These data allowed to consider de-water as a remedy for diabetes prophilaxis.
Литература
1. Балаболкин M. И. Эндокринология. М., 1998. 2. Баранов В. Г., Соколовврова И. М., Гаспарян Э. Г. и др. Экспериментальный сахарный диабет. Роль в клинической диабетологии. Л., 1983. 3. Баранов В. Г. Сахарный диабет у детей. М., 1981. 4. Теппермен Дж,, Теппермен X. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. М., 1989. 5. Bolzan A. D., Bianchi М. S. Clastogenic effects of streptozotocin on human colon cancer cell lines with gene amplification // J. Environ Pathol Toxicol Oncol. 2003.Vol. 22(4). P. 281-286. 6. Jacobs R. L., House J. D., Brosnan M. E„ BrosnanJ. T. Effects of streptozotocin-induced diabetes and of insulin treatment on homocysteine metabolism in the rat // Diabetes. 1998. Vol. 47(12). P. 1967-1970. 7. Hayek A., Beattie G. M. lntrapancreatic islet transplantation in experimental diabetes in the rat // Metabolism. 1992. Vol. 41(12). P. 1367-1369. 8. Kim E. M., Grace M. K., WeichC.C., Billing-ton C. J., Levine A. S. STZ-induced diabetes decreases and insulin normalizes POMC mRNA in arcuate nucleus and pituitary in rats // Am. J. Physiol. 1999. Vol. 276(5). P. 1320-1326. 9. LakeS. P., Chamberlain J., Bassett P. £>., London N. J., Walczak K., Bell P. R., James R. F. Successful reversal of diabetes in nude rats by transplantation of isolated adult human islets of Langerhans // Diabetes. 1989. Vol.'38(2). P. 244-248. 10. Mohanam S., Bose S. M. Influence of streptozotocin-and alloxan-induced diabetes in the rat on collagenase and certain lysosomal enzymes in relation to the degradation of connective tissue proteins // Diabetologia. 1983. Vol. 25(7). P. 66-70. 11. NagaiT., Yasunami Y., NagataN., RyuS., OnoJ., IkedaS. Amelioration of hyperglycemia in streptozotocin-induced diabetic rats receiving a marginal mass of islet grafts by troglitazone, an oral antidiabetic agent // Pancreas. 1996. Vol. 13(4). P. 381-387. 12. PyG., Lambert K., Mil-havetO., Eydoux N.. Prefaut C., MercierJ. Effects of streptozotocin-induced diabetes on markers of skeletal muscle metabolism and monocarboxylate transporter 1 to monocarboxylate transporter 4 transporters// Metabolism. 2002. Vol. 51(7). P. 807-813. 13. Sanders R. A., Rauscher F. M., Watkins J. B. Effects of quercetin on antioxidant defense in streptosotocin-induoed diabetic rats // J. Biochem. Mol. Toxicol 2001. Vol. 15. P.143-149. 14. Weide L. G., Lacy P. E. Low-dose strepto-zocin-induced autoimmune diabetes in islet transplantation model // Diabetes. 1991. Vol. 40(9). P. 1157-1162.
Статья поступила в редакцию 18 марта 2004 г.
