CC BY
11
Научни трудове на Съюза на учените в България-Пловдив Серия Г. Медицина, фармация и дентална медицина т.ХХ1. ISSN 1311-9427 (Print), ISSN 2534-9392 (On-line). 2017. Scientific works of the Union of Scientists in Bulgaria-Plovdiv, series G. Medicine, Pharmacy and Dental medicine, VoLXXI. ISSN 1311-9427 (Print), ISSN 2534-9392 (On-line). 2017.
МАТУРАЦИЯ НА ОРАЛЕН БИОФИЛМ, СФОРМИРАН В IN VIVO УСЛОВИЯ ВЪРХУ ПОВЪРХНОСТТА НА КОМПОЗИЦИОНЕН МАТЕРИАЛ FILTEK Z250. СЕМ ИЗСЛЕДВАНЕ
Костадин Георгиев, Иван Филипов МУ-Пловдив, Факултет по Дентална Медицина, Катедра Оперативно Зъболечение и Ендодонтия
ULTRASTRUCTURAL EVOLUTION OF IN VIVO GENERATED ORAL BIOFILM, COVERING THE SURFACE OF THE RESIN COMPOSITE MATERIAL FILTEK Z250. SEM ANALYSIS Kostadin Georgiev, Ivan Filipov Medical University of Plovdif, Faculty of Dental Medicine, Department of Operative Dentistry and Endodontics
Abstract.
The oral cavity is a complex ecosystem inhabited by more than 700 bacterial species. To be more resilient to the constantly changing environment, the oral microbiota organize in multispecies oral biofilms. Biofilm formation on composite resins can cause surface deterioration of the matrix and destruction of the dentine-composite interface. In recent studies, these changes are associated with the term biodegradation. Aim.
The aim of this study is to collect data of the plaque maturation on composite resins after
they are seated in the oral cavity for different time intervals.
Results.
The SEM analysis confirmed the hypothesis of early and late colonizers. After shorter periods of time (3 days, 1 week) the composite samples were covered with biofilm with predomination of coccal forms. After longer time intervals (2 weeks) cocco-filamentous biofilms were observed with predomination of spirochetes and fusobacteria. Key words: oral biofilm, resin composite, dental materials, biodegradation, SEM analysis.
Въведение.
Устната кухина е комплексна екосистема, обитавана от над 700 различни бактериални вида. За да бъдат по-устойчиви към постоянно променящите се условия на живот, оралните микроорганизми се групират в многовидови биофилми, покриващи не само тъканите в устната кухина, но и възстановителните материали, които използваме в съвременната дентална медицина (Moons, 2009). Бактериите от устната кухина колонизират успешно както хидрофилни, така и хидрофобни повърхности, използвайки различен механизъм за първоначална адхезия към материалите (Ван дер Ваалсови и електростатични сили
или алкално-киселинни химични взаимодействия) (Van Oss, 1995). Архитектурата и състава на микробния биофилм зависят в най-голяма степен от свойствата на различните възстановителни материали. Изследвания върху повърхността на златни и амалгамени възстановявания показват плътен и видово многообразен биофилм със слаба патогенност. Със сходна архитектура, но по-висок патогенен потенциал се отркоява микробният биофилм върху апроксималните повърхности на композитни обтурации. Тънък, разнороден и силно патогенен е бактериалният филм върху керамични повърхности (Busscher, 2010). Сформирането на орален биофилм върху повърхността на композиционните материали води до ензимна биодеградация на органичната композитна матрица. Използвайки естеразни ензими, мутантните стрептококи предизвикват повърхностна дезинтеграция на материала и разкъсване на адхезивната връзка между зъбните тъкани и обтурацията. Мономерните продукти на биодеградацията на свой ред усилват растежа на микробните колонии, като по този начин се подпомага сформирането на плътен и многослоен биофилм с висока деградационна активност (Busscher 2010).
Различни методи са използвани за проучване на етапите в развитието на оралните биофилми. В практиката са се наложили две основни групи подходи: изискващи култивиране и не изискващи култивиране (Darren, 2016). Методите, изискващи култивиране са по своята същност микробиологични. Събраната чрез остъргване зъбна плака се диспергира и подлага на микробиологична идентификация чрез директно наблюдение след оцветяване по Грам или чрез посявка на селективни растежни среди (Zou, 2014). За проследяване на динамиката във формирането на орален многовидов биофилм се предпочитат методите не изискващи култивиране. Сред тях най-често цитирани в литературата са сканиращата електронна микроскопия и PCR- анализите (Do, 2013; Almstrand, 2013).
Цел.
Целта на нашето проучване е чрез извършване на СЕМ анализ да се придобие информация по отношение на динамиката при сформирането на орален биофилм върху повърхността на композитни образци, поставени в in vivo условия.
Материали и методи.
За целта на експеримента бяха използвани нанохибридни композитни прототипи (от материал Filtek Z250), които инкубирахме in vivo за 3 различни времеви интервала - 3 дни, 1 седмица и 2 седмици. Композитните образци по своята същност представляваха временни композитни овърлеи, изработени по индиректна методика в лабораторни условия. В експеримента се включиха 5 участника - пациенти на катедрата по Оперативно зъболечение и ендодонтия - с индикации за индиректно кавитетно възстановяване на ендодонтски лекуван дъвкателен зъб. Бяха селектирани само дефекти от втори клас по Black. За всеки пациент бяха изработени 3 идентични композитни овърлеи, като на случаен принцип означихме времето за престой на всеки от тях в устната кухина (Фиг. 1). За фиксиране на прототипите в кавитета използвахме временен не-евгенолов цимент, а за отделянето им -ръчни пародонтални инструменти. При финализирането на експеримента на пациентите бяха изработени дефинитивни възстановявания по индиректна методика. След предвидения престой в устната кухина пробите бяха подложени на СЕМ анализ по морфологичен критерий. Образците за СЕМ изследването фиксирахме в 2 % глутаралдехид за 30 минути, с последващо дехидратиране в етанол с нарастващи концентрации, както следва - 60%, 70%, 96% . Непосредствено преди СЕМ анализа пробите бяха покривани със злато чрез разпрашаване. За провеждането на експеримента беше използван емисионен сканиращ
Фиг. 1 За всеки пациент бяха изработени 3 идентичны композитни овьрлеи, като на случаен пршщип означихме времето за престой на всеки от тях в устната кухина.
електронен микроскоп - FE-SEM. Резултати.
Извършеният СЕМ анализ на образците потвърди хипотезата за ранни и късни колонизатори при сформирането на орален биофилм върху композитни повърхности.
Фиг. 2 Скаииращо-електронни микрографии, изобразяващи апроксималната повьрхност на композитни образци след 3-дневиа in vivo инкубация. Устаиовява се добра колонизация на наблюдаваните повърхности.
Морфологичен анализ на образците след 3 дни (брой прегледани образци: 5). Наблюдавахме биофилм, покриващ само гингивалната 1/3 на апроксималната композитна повърхност, съставен предимно от сферични микроорганизми - вероятно стрептококи. На 3 от образците различихме добре организирани микробни популации с типична гроздовидна подредба на микроорганизмите и междуклетъчен полизахариден матрикс. Върху така описаните колонии открихме единични пръчковидни форми. Върху един от овърлеите не успяхме да идентифицираме никакви признаци на микробен растеж в рамките на 3 дни. Апроксималната повърхност на последния композитен образец, който разгледахме показа наличие на единични микробни колонии от стрептококи, без специфична структурна организация (Фиг. 2, 3).
Фиг. 4 Сканиращо-ел ектронни микрографии, изобразивший апроксималнага повьрхност на композитни образци след едноседмична ill vivo инкубация. При трима от участниците се установи наличие на комплексен биофилм, представен от пръчковидни микроорганизми, адхериранн към подпежашите коки (А, В). При останалите двама участници се наблюдаваше биофилм с превалиращо коковидни микроорганизми и единични филаментни форми (С, D).
Фиг. 3 Сканиращо-електронни микрографии, изобразяващи апроксималната повьрхност на композипш образци след 3-дневна in vivo инкубация. Установява се слаба до липсваща микробна колонизация на наблюдаваните повърхности.
Морфологичен анализ на образците след 1 седмица (брой прегледани образци: 5). При двама от пациентите установихме забавено протичане на процесите на биофилм-матурация. Биофилм от коки, подредени в гроздове и добре обособен полизахариден матрикс открихме в едноседмични проби от участниците, при които наблюдавахме минимален или липсващ микробен растеж в предходния времеви интервал. Останалите трима участници се обособиха с по-бърза матурация на плаката и техните проби показаха комплексен многовидов биофилм, съставен от гроздовидно подредени коки и пръчковидни микроорганизми, адхерирани към тях. Така описаната сложна структура се поддържа и изхранва от екстрацелуларен полизахариден матрикс (Фиг. 4).
Морфологичен анализ на образците след 2 седмици (брой прегледани образци: 5).
Фиг. 5 Сканиращо-електронни микрографии, изобразяващи апроксималиата повърхност на композитны образцы след двуседмична in vivo инкубация. Описаната иреди коко-филаментна морфология на биофилма е иреминала в изцяло филаментна (А,В). Плътният екстрацелуларен матрикс осигурявавръзкасга между слоевете на биофилма и поддьржа относително по стоянии условия за живот на микроорганизмите (C,D).
След двуседмичен престой в устната кухина бяха отчетени видими промени в наблюдаваните образци. Описаната по-рано коко-филаментна структура на биофилма се беше видоизменила и морфологичният анализ отчете предимно пръчковидни форми в състава му. Пробите от участниците с по-бавно плакообразуване отчетоха биофилми с полиморфна структура и голямо количество стрептококи (Фиг. 5).
Дискусия.
За да бъде овладяна микробната деструкция на биоматериалите е нужно да се опознае динамиката при формирането на оралния биофилм и съществува ли разлика между микробните популации, заселващи възстановителните материали и твърдите зъбни тъкани. С тази цел са разработени множество експериментални модели на биофилми, използващи различни субстрати за in vitro и in vivo бактериална колонизация (Samot 2011). В повечето методики авторите използват опростен биофилм, съставен от един микробен вид - най-често Streptococcus mutans. Като съществен недостатък на тези биофилм модели се посочва това, че при реални условия в устната кухина не съществуват едновидови биофилми (Beyth, 2008; Hayati, 2011). Настоящото проучване е част от експеримент, състоящ се от клиничен и лабораторен етап. Целта ни беше да инкубираме лабораторно изработени тестови прототипи в in vivo условия и да проследим формирането на сложен многовидов биофилм върху нанохибридна композитна повърхност. Тестовите прототипи по своята същност възпроизвеждаха дизайна на композитна обтурация от втори клас по Black. Чрез сканираща електронна микроскопия наблюдавахме апроксималните повърхности на образците, като предварително ги разделихме на три групи според времето на престой в устната кухина: Група 1. Образци с престой в УК - 72часа; Група 2. Образци с престой в УК - 1 седмица; Група 3. Образци с престой в УК - 2 седмици. Използваният СЕМ-анализ позволява да се установи микробното разпределение в плаката по време на нейната матурация. Водещ критерий беше морфологичната характеристика на бактериалните видове. След период от две седмици матурирал биофилм се откриваше по апроксималните повърхности на всички композитни образци, близо до гингивалната основа. Коронарно, в близост до контакт-пункта бяха сканирани единични колонии, без структурни характеристики на биофилм.
Данните, които получихме корелират с предишни проучвания на биофилми в in vivo условия (Kolenbrander, 2010; Ferrer, 2016).
Изводи и заключение.
Микробната колонизация на композиционните материали е злокачествен процес, който атакува най-слабите места на една композитна обтурация, а именно - проксималният интерфейс и адхезивната връзка. В описания експеримент представяме неинвазивен клиничен подход за набиране на информация относно сформирането и матурацията на орален биофилм върху апроксималната повърхност на композитните възстановявания. Вземайки предвид получените резултати и използвайки оригиналната клинична методика, която екипът създаде, имаме възможност да проведем експеримент с по-дългосрочна in vivo инкубация на композитни образци с цел изучаване на ензимната биодеградация на композиционните материали. Познаването на този сложен процес има както научна, така и клинична значимост като част от превенцията срещу вторичния кариес.
Библиография.
1. Moons P, Michiels CW, Aertsen A (2009). Bacterial interactions in biofilms. Crit Rev Microbiol 35:157-168.
2. Van Oss CJ (1995). Hydrophobicity of biosurfaces - Origin, quantitative determination and interaction energies. Colloids Surf B Biointerfaces 5:91-110.
3. Busscher HJ, Rinastiti M, Siswomihardjo W, van der Mei HC (2010). Biofilm formation on dental restorative and implant materials. J Dent Res 89(7):657-65.
4. Lopez-Nguyen Darrene and Badet Cecile (2016). Experimental Models of Oral Biofilms Developed on Inert Substrates: A Review of the Literature. BioMed Research International 2016(3)1.
5. Y. Zou, Y. Lee, J. Huh, J. Park (2014). Synergistic effect of xylitol and ursolic acid combination on oral biofilms. Restorative Dentistry & Endodontics 39(4):288-95.
6. T. Do, D. Devine, P. D. Marsh (2013). Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry 5:11-19.
7. R. Almstrand, H. Daims, F. Persson, F. SЁorensson, M. Hermansson (2013). New methods for analysis of spatial distribution and coaggregation of microbial populations in complex biofilms. Applied and Environmental Microbiology 79(19):5978-87.
8. Samot J., Lebreton J., Badet C (2011). Adherence capacities of oral lactobacilli for potential probiotic purposes. Anaerobe 17(2):69-72.
9. Beyth N, et al (2008). Streptococcus mutans biofilm changes surface-topography of resin composites. Dent Mater 24:732-36.
10. Hayati F, et al (2011). An artificial biofilm induced secondary caries model for in vitro studies. Aust Dent J 56:40-47.
11. Kolenbrander PE, Palmer Jr RJ, Periasamy S, Jakubovics NS.Oral multispecies biofilm development and the key role ofcell-cell distance. Nat Rev Microbiol 2010; 8:471-80.
12. Ferrer MD, Mira A. Oral biofilm architecture at the microbialscale. Trends Microbiol 2016; 24:246-8
