CC BY
312
БИОТЕХНОЛОГИЯ
Известия ТСХА, выпуск 1, 2010 год
УДК 631.533:631.543
УКОРЕНЕНИЕ — КЛЮЧЕВОЙ ЭТАП РАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ IN VITRO
В.И. ДЕМЕНКО, К.А. ШЕСТИБРАТОВ, В.Г. ЛЕБЕДЕВ (Кафедра плодоводства)
В статье представлены результаты многолетних исследований о влиянии различных регуляторов роста, углеводов, длительности пассирования, качества агара, структуры среды, солевого состава питательной среды на корнеобразова-ние. Обсуждаются этапы ризогенеза и их продолжительность. Особое внимание уделено проблеме этиоляции, физическим факторам, гормональном и солевому состав питательной среды. Содержатся важные и достоверные сведения о влия нии света, состава среды на ризогенез, жизнедея тельность растений и нестерильных услови х.
Ключевые слова: in vitro, регуляторы роста, питательная среда, ювениль-ность, этиоляция, углеводы, земляника, яблоня, груша, сирень, роза, актинидия китайская, ясень обыкновенный.
Процесс корнеобразования — это серия различных биохимических, физиологических и гистологических событий. Близость к сосудистым ткан м предрасполагает клетки закладывать корневые примордии [4]. Место заложения корней влия ет на жизнеспособность укорененных растений, особенно полученных in vitro. Можно получить 100% укоренение in vitro и 100% гибель растений в нестерильных условиях [26]. При любых способах укоренения процесс адвентивного корнеобразовани проходит 3-4 этапа: индукция, инициация , поя вление корней за пределами стеблевой части черенка [3]. Продолжительность первых двух этапов 10$15 дней, за этот период предком-петентные клетки приобретают способность регенерировать меристема-тические очаги, в них начинается си-нез корнеспецифических белков [13].
По вление корней зависит от генома растений и условий укоренени .
Одна из особенностей размноже-ни растений in vitro — ювенилиза-ция тканей, что является причиной легкости ризогенеза in vitro [19]. Степень ее про влени зависит от условий культивирования, и в первую очередь от содержания в сосудах э ти-лена [25].
Предпосылкой дл начала корне-образовани при любых способах размножения я вля ется этиоля ция . Причина вли ни этого феномена св зана с анатомическими и биохимическими изменения ми, а также с ювениализа-цией тканей. У этиолированных черенков выделены белки-рецепторы, обладающие высоким сродством с ауксином. В темноте большая часть ауксина свя зана с белками [17]. Этиоля ция повышает активность пероксидазы, ИУК — оксидазы в тканя х, что уско-
р ет начало образовани корней. Она усиливает чувствительность тканей к экзогенному ауксину, давая возможность использовать меньшие концентрации. Характер действия этиоля-ции in vitro зависит от вида растений и имеет пролонгирующий эффект [23]. Укоренение in vitro происходит при освещении всего черенка, что сказы-ваетс на ризогенезе и частично может нивелироваться ИМК, которая в меньшей степени стимулирует синтез этилена по сравнению с ИУК [20]. Основная проблема успешного ризо-генеза in vitro заключаетс в трудности разделения момента заложения первого корневого приморди с началом синтеза этилена. При этом очень высокий или очень низкий уровень этилена отрицательно вли ет на укоренение [7]. Свет выполня ет важную роль в регулировании морфогенетических процессов. Облучение уже обра-зовавшихс корней светом подавл ет удлинение корней на 40-50%, за счет 4-кратного увеличения содержания этилена [14]. Для трудно укореня е-мых видов рекомендуют использовать темновой период на начальном этапе укоренения. Его продолжительность зависит от культуры и колеблетс от 3-5 дней до 4 недель. Р д авторов отмечают сложную зависимость укоренения от светового режима, ре-гуля торов роста, рН среды [15, 22]. Положительное действие этиоляции на этапе пролиферации побегов зависит от сорта. Применение ауксинов и темноты на последней неделе пролиферации побегов М2 7 уменьшало укореня емость на 65% [6].
Действие ферментативных систем, которые катализируют разрушение ИУК, осуществля ется только в присутствии кислорода. Питательные среды, применя емые для укоренения побегов in vitro, содержат очень мало кислорода, что не способствует развитию корневых волосков.
Поэтому подходы к укоренению in vitro должны отличаться от уко-
ренени in vivo. Современное промышленное размножение растений in vitro невозможно без использования регуля торов роста. Как правило, для укоренени используют аналоги ИУК. Отношение к экзогенному ауксину, времени и способу его применени in vitro неоднозначно. Достаточное количество заложившихся корней и хорошая приживаемость растений в нестерильных условиях получены при экспозиции 7 дней на среде с ауксином. Более длительное воздействие приводит к образованию каллуса [18]. Побеги легкоукорен емых культур можно укоренять на средах без ауксинов. Однако ауксины часто не в-л ютс лимитирующим фактором и дл трудно укорен емых видов.
Кроме веществ из группы ауксинов отмечают стимулирующее вли ние ретардантов на укоренение и характер развития корней [1, 16]. Некоторые из них активируют транспорт ИУК, углеводов к базальной части черенка. Методика укоренени in vitro позвол ет контролировать физические факторы, гормональный и солевой состав питательной среды. В то же время освещение основания побега, длительное воздействие ауксином, разнокачественность побегов, незначительный замкнутый объем, отсутствие или недостаточно интенсивный газовый обмен, его специфичность, недостаточное содержание кислорода в зоне укоренения, возможная латентная стекловидность побегов, отсутствие транспирации, фотосинтеза и воздействия ультрафиолетовой радиации создают проблемы дл укоренени и последующей приживаемости растений в нестерильных условиях. Оптимизация этих факторов и их взаимодействи вл -ютс основной задачей исследований ризогенеза in vitro. В подавл ющем большинстве опытов по укоренению in vitro исследователи отмечают важность осмотического потенциала среды, который зависит от концентрации
сахарозы, солевого состава, особенно азота и калия [9]. Как правило, минеральный состав среды М.С. уменьшают в 2-8 раз или заменяют на среду Уайта [B]. При этом ведуща роль отводится содержанию нитратного и аммиачного азота [21]. Отсутствие той или иной формы азота отрицательно вли ет на укоренение побегов [24].
Пригодные для укоренения побеги плодовых культур формируютс только после длительного культивирования . Даже на 11-14-м пассаже укоренение трудноукорен емых видов растений представл ет серьезную проблему [2]. Однако очень длительное пассирование нежелательно, особенно для видов, вегетативное потомство которых предназначено дл многолетних насаждений.
Считается перспективным укоренение побегов, полученных in vitro, в стерильных субстратах при повышенной влажности либо в атмосфере искусственного тумана [10]. По способности к укоренению in vitro в научной литературе представлен широкий диапазон данных — от легко укорен е-мых видов (земл ника) до отсутстви укоренения (груша каллариана) [11]. Поэтому неудивительно, что многие авторы считают успешное укоренение побегов in vitro ключевым этапом ми-кроклонального размножения [5].
Материалы и методика
Способность к укоренению in vitro земляники, яблони, груши, сирени, роз, актинидии китайской, ясеня обыкновенного изучали: с использованием различных регул торов роста (ИУК, ИМК, НУК, культар, мивал, крезацин, гумат натрия, азотнокислое серебро); углеводов (сахароза, глюкоза, мальтоза, фруктоза, сорбит, маннит); ПAB (твин-40, КЭП); вли ни длительности пассировани и качества побегов, агара и его заменителей, структуры среды и воздействия физических факторов, солевого состава питательной среды. Расте-
ни выращивали по общеприн тым методикам с учетом специфики этапа укоренени . Учитывали начало кор-необразования, развитие каллуса, количество корней, рост побега. В каждом варианте по 10-14 растений в четырех повторност х.
Результаты и их обсуждение
Способность боковых побегов к укоренению in vitro во многом определ -ет эффективность технологии микро-клонального размножения . Это наиболее затратная статья (75% затрат ручного труда) в стоимости конечной продукции. Успешное прохождение этапа ризогенеза зависело от культуры, сорта, условий этапа пролиферации, солевого и гормонального состава среды, количества пассажей. Только побеги земл ники были способны к укоренению на первом пассаже, а робинии и вейгелы на втором пассаже. Укоренение земл ники зависело от солевого состава среды и ее формы. Среда Фоссарда лучше подходит для укоренени земл ники. Корнева система на этой среде отличалась сильным ростом, была окрашена и имела боковые корни. Растени на среде Фоссорда были развиты сильнее, имели 4-5 листьев темно-зеленого цвета. Развитие каллуса отсутствовало. Менее концентрированные среды уменьшали укорен емость и угнетали развитие корневой системы.
Среда М.С. стимулировала укоренение и развитие каллуса у основани побега, а наличие каллуса нежелательно, так как при пересадке растений в нестерильные условия они погибают от ботритиса, фузариоза и питиума. Сокращение в среде М.С. макроэлементов или азота на 1/2 или 4/5 увеличивало укоренение практически всех изучаемых культур, а корнеобразование происходило при более низких концентраци х ауксина. На полной среде М.С., содержащей 0,5 мг/л ИМК, развивались толстые, короткие корни. На бедных средах
корни были нитевидные и развивались из основания побега.
Характер развити корневой системы зависел от типа регул тора роста, индуцирующего корнеобразо-вани . Стимулирующее вли ние ИМК и ИУК в опытах с земля никой в большей мере про вилось на твердых средах, а НУК — на жидкой. Более мощна корнева система образовалась на жидкой среде, содержащей НУК. Однако развитие надземной системы не происходило, что свя зано со способностью НУК поглощаться и перемещатьс по растительным ткан м. На всех средах отмечено интенсивное развитие каллуса, особенно на средах с НУК. С учетом недостатков ауксина на этапе укоренени in vitro необходим поиск других веществ, которые стимулировали бы быстрое развитие корневой и засухоустойчивость надземной систем. Из литературных источников известно, что такими свойствами обладает культар, который хорошо себ зарекомендовал на интактных растени х при зеленом черенковании (табл. 1).
Т а б л и ц а 1
Влияние культара на укоренение земляники in vitro
(среда 1/2 М.С., сорт Холлидей)
С увеличением концентрации культара в среде происходило ингибирование роста надземной и корневой системы, которые отличались интенсивным радиальным ростом. Использование культара в диапазоне концентраций
0,3-0,5 мг/л также ингибировало раз-
витие надземной системы, однако в меньшей степени. Развитие каллуса не отмечали ни в одном из вариантов. Концентраци культара свыше 1 мг/л вызывала гибель побегов. Укоренение побегов in vitro возможно только при определенной их длине. Ни одно из испытанных веществ не способствовало развитию корней непосредственно из меристематической верхушки, т.е. в начале необходим рост растяжением, а затем начинают развивать-с корни. Введение в среду культара (0,1$0,2 мг/л) полностью ингибировало рост растяжением меристематиче-ских верхушек и вызывало развитие у них корневой системы. Часть корней была окрашена в зеленый цвет, т.е. корнева система прин ла на себ функцию фотосинтезирующего органа при отсутствии роста надземной системы. Культар в концентрации
0,5 мг/л стимулировал развитие корней второго, а в некоторых случа-х — третьего пор дка у сирени.
С целью устранения отрицательного вли ни ауксинов на процесс корнеобразовани in vitro испытывали вещества из группы кремнийор-ганических соединений (мивал, кре-зацин, КЭП) и гумат натрия . Применение мивала и крезацина существенно повли ло на укоренение и развитие корневой системы земл ники, актинидии китайской, груши. Оптимальные концентрации испытанных веществ наход тс в диапазоне 0,12 мг/л, в котором изменяются все параметры развити корневой системы. Увеличивается процент укоренения , количество корней и их длина (табл. 2).
Укорен емость побегов земл ники при сочетании кремнийорганических соединений с другими индукторами корнеобразовани зависела от их концентраций. Укоренение ингибировалось полностью, если концентра-ци мивала и крезацина превышала 2 мг/л в сочетании с ИМК и при совместном их введении в питательную
Культар, мг/л Укоренение,%
0 50 б
0, 3 100 в
0, 5 100 в
0, 7 44, 3 б
0, 9 10 а
1, 0 10 а
2 0 а
Влияние регуляторов роста на укоренение земляники in vitro
(среда 1/2 М.С., сорт Редгонтлит)
Регулятор роста, мг/л Укоренение, % Количествово корней, шт. Длина корней, мм Каллус, %
Контроль 75 5,4 8,5 0
ИМК 0,2 55 4,9 4,3 53
Культар 0,2 100 8,2 15 0
КЭП 0,5 100 8,02 17,5 0
КЭП 2 100 3,9 11,3 0
КЭП5 65 6,8 7,3 0
Мивал 0,5 90 7,9 16,3 0
Мивал 2 100 9,65 16,3 0
Мивал 5 90 6,4 11,3 0
Крезацин 0,5 100 6,4 12,5 0
Крезацин 2 95 4,9 6 0
КЭП 2 + ИМК 0,2 100 5,1 7,5 10
Мивал 2 + ИМК 0,2 0 0 0 0
Крезацин 2 + ИМК 0,2 0 0 0 0
Культар 0,2 + ИМК 0, 2 10 — 20,5 50
КЭП 2 + культар 0, 2 15 Очень слабое развитие
Мивал 2 + культар 0,2 0 0 0 0
Крезацин 2 + культар 0,2 55 3,8 14,3 0
Крезацин 5 100 4,1 15,1 0
НСР05 2,6 4,7
среду. Аналогичное влия ние совместного применени ИМК с кремнийор-ганическими соединени ми отмечено в опытах с грушей. Стимулирующее вли ние крезацина про вл етс в более узком диапазоне концентраций (0,1$0,2 мг/л), а мивала при концентрациях 0,1$0,5 мг/л.
Можно предположить, что мивал обладает ауксиноподобным действием, но при этом не стимулирует развитие каллуса. При низких концен-траци х мивала и крезацина наблю-даетс синергизм действи с ИМК на процессы роста и развити земл ники in vitro — увеличивается высота растени за счет длины побегов и листьев.
Раздельное применение мивала и культара в малых концентраци х способствовало 100% укоренению
земля ники; совместное использование при больших концентраци х полностью ингибировало корнеобразование. Актинидия китайская в отличие от
земляники максимально увеличивала развитие корней от совместного применения ИМК с мивалом, при этом концентрация ИМК также превышала концентрацию мивала. Совместное действие мивала и крезаци-на ингибировало укоренение данной культуры. Очевидно, актинидия требует большей концентрации ауксина на этапе индукции по сравнению с земля никой. Потому высокие концентрации ИМК в большей степени стимулировали корнеобразование актинидии, если ее применя ли отдельно.
Существенно ускоряли прохождение этапов укоренения побегов зем-л ники гумат натри и азотнокислое серебро. Их использование в концентрации 0,5$1 мг/л сократило время начала укоренения побегов, ускоря-ло получение растений, пригодных к пересадке в нестерильные условия . Данные наших опытов с азотнокислым серебром и метионином дают нам основание утверждать, что на первом
этапе укоренения значительный синтез этилена ингибирует заложение корней. Введение в питательную среду метионина полностью подавля-ло ризогенез в вариантах с ИМК и мивалом и значительно в вариантах совместного действи индукторов корнеобразовавния. Очевидно, что метионин увеличивает содержание этилена в фазу индукции заложения корней до ингибиторного уровн .
На всех этапах микроклонально-го размножения в питательных средах используют углеводы, в основном сахарозу, как наиболее мобильный углевод. Углеводы в культуре тканей имеют значение не только как элементы питания, но и как вещества, создающие вместе с солевым составом определенное осмотическое давление. Значение углеводов возрастает на этапе укоренения в связи с необходимостью подготовки растени к автотрофному питанию в нестерильных условиях. Концентрация углеводов сахарозы, фруктозы, глюкозы 10 г/л недостаточна для укоренения земля -ники. Маннит и сорбит, не имеющие пищевой ценности, но обладающие способностью вли ть на осмотическое давление, также не способствовали образованию корней. Поя вление первых корней на побегах сен отмечалось на 9-10-й день после посадки на среду дл укоренени . Вли ние испытанных углеводов зависело от приме-ня емых регуля торов роста (табл. 3).
Различные углеводы не оказали су-шественного влия ния на частоту уко-
ренени : в варианте с НУК она составила 86-93%, а в варианте с ИМК — 55$71%. Однако количество корней и их длина различались сушественно: максимальные значени отмечены на среде с 30 г/л сахарозы или 10 г/л глюкозы. Корни на среде с мальтозой были в 2,4 раза короче, чем на среде с сахарозой, и в 3,2 раза — чем на среде с глюкозой, при этом растения отставали в росте от растений на средах с сахарозой и глюкозой.
Рост и развитие корней in vitro завис т от аэрации питательной среды, которая, в свою очередь, зависит от концентрации агара. Укоренение побегов в плотной среде затруднено, развитие корней второго пор дка не происходит. С уменьшением концентрации агара существенно увеличи-ваетс укоренение побегов и развитие корней второго пор дка.
Однако при длительном развитии растений на средах с малым содержанием агара (1,5-2,5 г/л) у них по-вл ютс признаки стекловидности. На питательных средах, содержащих даже небольшие концентрации агара, никогда не развиваются корневые волоски, что говорит о недостаточном содержании кислорода. С учетом важности содержания кислорода при заложении и развитии корней и корневых волосков делали попытки заменить агар на этапе укоренени . При использовании полной среды М.С. и заменителей агара побеги погибали уже через несколько дней после посадки. Гибель побегов и растений,
Т а б л и ц а 3
Влияние углеводов и ауксинов на укоренение ясеня, мг/л
Вариант, концентрация, г/л Укоренение, % Количество корней на побег Длина корней, мм, НУК 0,5
НУК 0,5 ИМК 0,5 НУК 0,5 ИМК 0,5
Сахароза, 10 92,9 71,4 1,9 аб 1,7 19,1 б
Сахароза, 5 87,5 55,4 1,9 аб 1,3 7,5 в
Сахароза, 30 85,7 69,6 2,3 а 1,8 31,4 а
Глюкоза, 10 87,5 71,4 2,4 а 1,7 25,7 а
Мальтоза, 10 85,7 73,2 1,7 б 1,5 8,1 в
начавших развивать корни на среде 1/2 М.С. и заменителя х агара (перлит, песок), была связана с иссушением верхнего слоя субстрата.
Агар стимулировал более раннее корнеобразование. Возможно, он повышает диффузию веществ из питательной среды, а также помогает диффузии веществ из экспланта, ингибирующих корнеобразование. Большая часть укоренившихся побегов в вариантах с заменител ми агара прижилась в нестерильных у словия х, однако их рост в дальнейшем был слабым. Объединение агара с перлитом способствовало получению хорошо развитой корневой системы земл -ники, которая обеспечила успешную приживаемость растений в нестерильных условиях. Сочетание перлита с агаром дает возможность уменьшить концентрацию агара в 3 раза. После автоклавирования и застыва-ни среды в сосудах дл укоренени образуются два слоя: вверху перлит, пропитанный средой, внизу агаровая среда с вкраплени ми частиц перлита (табл. 4).
Т а б л и ц а 4 Влияние соотношения среда : перлит на укоренение и приживаемость разных сортов земляники в нестерильных условиях (среда 1/2 М.С., ИМК 0, 1 мг/л)
Соотношение по объему среда : перлит Количество укоренившихся, % Количество прижившихся в нестерильных условиях, %
Фести- вальная Зенга- Зенгана Фести- вальная
Контороль 80 а 34 39
0,3:3 85 а
0,5:1 100 б
1,0:1,0 100 б 67 64
1,0:2,0 100 б
0:1 70 а
Fc^ > FT F* > FT
Соотношение перлита и питательной среды с агаром 0,5-1:1 по объему
было оптимальным. Использование такой среды дл укоренени груши не дало положительных результатов.
Существующа методика укорене-ни боковых побегов большого числа видов с использованием ауксинов возможна только после длительного пассирования. Положительное влия-ние на размножение, возможно, свя -зано с ювенилизацией растительного материала. Не исключена веро тность стимулирующего эффекта этиоля -ции, так как с увеличением количества пассажей увеличивается количество боковых побегов, основание которых, как правило, этиолировано. Спуровые формы блони и клонового подвоя 62-396 начали хорошо укоре-ня ться с 12$13 пассажа. Укоренение их зависело от солевого состава питательной среды. Укоренение древесных растений на более поздних пассажах создает биологические и организационные проблемы, которые отчасти решаютс хранением культур на стадии пролиферации при пониженных температурах. Однако действие этого фактора может иметь отрицательные последствия на укоренение (влия ние этиоля ции и низких положительных температур). В связи с этим изучали вли ние условий освещени на укоренение боковых побегов я блони in vitro (табл. 5). Результаты опытов выявили определенную зависимость между влиянием света, низкой температурой, регуляторов роста и укоренением побегов.
При использовании в качестве индуктора корнеобразования ИМК укорен емость побегов повышалась на 14$30%, если пролиферирующие культуры подвергались воздействию темноты, особенно в сочетании с низкими положительными температурами. Отсутствие света на этапе размножения существенно уменьшило укоренение в варианте с культа-ром и мивалом, особенно в варианте с культаром. Низкие положительные температуры уменьшили ингибиру-
Влияние условий освещения на укоренение боковых побегов яблони in vitro
(среда М.С., 4/5 азота, 10-й пассаж, подвой 62-396)
Способ воздействия светом, регуляторы роста, мг/л Укоренение, % Количество корней, шт.
Пролиферирующие культуры 1 мес при 1 4°С, укоренение на свету, 90 3,4
ИМК 0,5
Культар 0,5 10 0,5
Мивал 1 30 1,3
15 дней в темноте, ИМК 0,5 40 4,4
Культар 0,5 6 0,8
Мивал 1 26 1,4
Пролиферирующие культуры 7 дней при 1 24°С в темноте, укорене- 76 4,7
ние на свету, ИМК 0,5
Культар 0,5 0 0
Мивал 1 16 0,8
Укоренение 15 дней в темноте, ИМК 0,5 16 2,7
Культар 0,5 0 0
Мивал 1 20 1,5
Пролиферирующие культуры на свету, укоренение на свету ИМК 0,5 60 4,5
Культар 0,5 70 4,5
Мивал 1 80 5,2
15 дней в темноте, ИМК 0,5 50 4,7
Культар 0,5 30 4,7
Мивал 1 16 1,4
НСР05 15,4 1,1
ющее действие этиоля ции в данных вариантах. Если индукция укоренения (15 дней) проходила в условиях этиоляции, то укоренение уменьшалась на 10-64% в зависимости от индуктора корнеобразования . Как уже отмечалось, в укоренении основную роль играют ауксины, синтезируемые эксплантами. Они необходимы на этапе индукции корнеобразования , который продолжает-
ся 6$10 дней. Отсутствие света при
хранении и укоренении стимулирует корнеобразование только в присутствии ИМК.
Сокращение темнового периода до 5$10 дней увеличило укореняемость побегов подвоя 62-396 на 24% при использовании ИМК. Хранение конгломератов земл ники при низких положительных температурах перед укоренением побегов вли ло на скорость прохождения этапов корнеобразова-ни (табл. 6).
Т а б л и ц а 6
Влияние условий выращивания конгломератов земляники и регуляторов роста на укоренение побегов in vitro (среда 1/2 М.С.)
Условия выращивания, регуляторы роста, мг/л Укоренение через 6 дней, %
Зенит Редгонтлит
Хранение 2 мес при 2°С, укоренение на свету, ИМК 0,3 26,7 б —
Культар 0,5 16,7 а —
Светокомната: укоренение на свету ИМК 0,3 0 а 0 а
Культар 0,5 60 в 74 в
Последействие низких положительных температур зависело от индуктора корнеобразования . ИМК ускоря -ла, а культар тормозил прохождение этапов корнеобразования при таких условиях. Многочисленные опыты по зеленому черенкованию убедительно показывают, что укоренение черенков сильно ингибируется, если их поместить полностью в услови темноты (она необходима только для основания черенка). С учетом такой реакции черенков на отсутствие света мы испытывали различные способы затенения основания побега in vitro. Побеги подвоя 62-396 сажали в капсулу из фольги, заполненную питательной средой, или в питательную среду вводили активированный уголь. Наибольший процент укоренения (86%) отмечен в варианте с использованием капсулы. Введение активированного угля в среду уменьшало укоренение на 35%. Известно, что 1 мг активированного у гля может поглотить 100 мкг 6БАП и НУК. В активированном угле содержатся феноламиды, что может отрицательно влиять на укоренение. Активированный уголь поглощает этилен, который неоднозначно влия -ет на процессы ризогенеза. Использование капсулы дл укоренени стимулировало интенсивный рост корневой системы в длину, развитие корней второго порядка. Однако использование капсулы не технологично. Нами разработана композиционна среда, которая значительно улучшает укоренение блони за счет эффекта эти-ол ции. Отличительной особенностью такой среды от стандартной вл етс размещение на стандартной среде укоренения или размножения слоя среды (2-3 мм), состоящего из воды, агара и активированного угля (2-5%). Композиционна среда способствовала укоренению побегов после 4-го пассажа, увеличению в 2 раза общего числа корней, корней второго пор дка и стимулировала ризогенез на средах, содержащих 6БАП. Через
1 ,5 мес длина укоренившихс побегов на среде, содержащей 6 мг/л 6БАП, увеличилась в 2 раза. Прирост побегов в контроле составля л 27% от опытного варианта. Свет (стандартна среда) ингибировал рост корней в длину и развитие корней второго пор дка. На композиционной среде корни развивались между основной средой и затемненным слоем. К концу пассажа на корн х развились корневые волоски. Если стенки сосуда затемняли фольгой, то корневая система развивалась и внутри среды. На основании полученных данных укоренение древесных растений необходимо начинать уже после 4-5-го пассажа. Побеги длиной больше 2,5 см следует использовать для дальнейшего размножения, так как у них отсутствуют предпосылки возникновени стекловидности. Побеги длиной меньше 1,5 см необходимо пересаживать на среду с пониженным содержанием 6БАП (0,1 мг/л), а побеги 1,5-2,5 см — использовать для укоренени .
Жизнеспособность растений в нестерильных услови х во многом опре-дел етс способностью растений in vitro и in vivo к быстрому росту. В услови х in vitro это свойство зависит от культуры, регуляторов роста, условий выращивани . Часто на этом этапе отмечаетс гибель верхушек укорененных растений. В этой свя зи изучали влия ние электростатического поля (10$40 квт/м) на укоренение побегов груши на фоне различных регуляторов роста. Электростатическое поле измен ло характер ризогенеза и рост укорененных побегов. В лучших опытных вариантах количество жизнеспособных побегов было больше на 47,5%, их длина превышала длину контрольных на 17%, увеличилось количество корней и их длина.
Размер боковых побегов влиял и на укоренение их in vitro. С увеличением длины боковых побегов увеличивается количество корней, их длина, высота растений и уменьша-
ется количество листьев. Скорость роста надземной системы была выше у побегов длиной 0,5 см. Увеличение количества листьев у побегов небольшого размера, очевидно, связано с остаточным действием 6БАП. Не исключено, что небольшой рост побегов объя сня ется превалированием у них роста делением на этапе пролиферации побегов, которое реализуется увеличением количества листьев на этапе укоренени .
Укорен емость побегов блони
также зависела от их длины. Короткие побеги клонового подво 62-396 были способны к укоренению, но развитие надземной и корневой системы было слабое. Эффективным приемом повышения укоренения побегов яв-л етс травмирование их основани , особенно продольные надрезы побегов. При таком способе на 27% увеличилась укореня емость и в 4 раза — количество корней спуровой формы лони.
Прохождение основных этапов ми-кроклонального размножения либо невозможно, либо очень затруднено без включени в состав питательной среды регуляторов роста. Для получения желаемой направленности морфогенеза иногда приходитс примен ть их в больших концентрациях, что может вызвать побочные нежелательные реакции (образование каллуса, стекловидности, преждевременную гибель отдельных органов). Вместе с тем известно, что
действие регул торов роста опреде-л етс их способностью проникать в клетку. Ослабить некоторые барьеры проникновени веществ в клетку могут поверхностно-активные вещества (ПАВ). Действие твин-40 зависело от его концентрации, положительное вли ние отмечено в вариантах с твин-40 (0,5$1 мг/л). При такой концентрации начало и интенсивность корнеобразовани проходили при более низком содержании в среде индукторов корнеобразовани (0,1 мг/л ИМК). Более высокие концентрации твин-40 снижали способность побегов земл ники к ризогенезу. Более активным в этом процессе был гумат натри в концентрации 0,5 мг/л.
Получение целостного растени in vitro и характер его развити зависели от солевого и гормонального состава среды, предшествующей укоренению.
Процесс корнеобразовани боко-
вых побегов роз лучше протекал, если предыдущий пассаж размножения проходил на среде, в которой соотношение NH4 : NO3 было 1 : 2. При таком соотношении существенно увеличилось количество корней и их длина. Высота надземной системы не зависела от соотношени аммиачного и нитратного азота. Укоренение боковых побегов груши зависело от содержания в питательной среде для размножения 6БАП (табл. 7).
Несмотр на отсутствие взаимосвязи между концентрацией 6БАП
Т а б л и ц а 7
Влияние концентрации 6БАП в среде для пролиферации на укоренение побегов груши in vitro (среда 1/2 М.С., сорт Лада, 10-й пассаж, 1990)
Концентрация 6БАП предыдущего пассажа Укоренение, % Количество корней, шт. Количество растений с живыми верхушками, % Количество растений с корнями 2-го порядка, %
0,5 70 4,8 72,5 а 26,3 а
1,0 80 4,1 56,2 б 15,0 б
1,5 77,5 4,1 72,5 а 17,6 б
2,0 77,5 4,5 68,7 б 5,0 в
2,5 90 4,7 86,2 а 13,8 б
и последующим укоренением побегов, имеетс тенденци ее возрастани с увеличением концентрации 6БАП. Уменьшаетс число растений с погибшими верхушками и ингибируетс способность корней первого пор дка к ветвлению. Такая реакция груши на 6БАП согласуется с его физиологическими свойствами как цитокинина. Изучение качественного состава почек в процессе пассировани земл ники показало, что при использовании в питательной среде больших концентраций 6БАП (1 мг/л) у всех сортов (Фрагинета, Хавеланд, Заря, Ко-кинская ранняя, Редгонтлит, сеянец 139-13-11) начиная с 4-5-го пассажа увеличивается количество почек, неспособных к развитию полноценных растений. По-видимому, это св зано с длительным воздействием высокой концентрацией 6БАП.
Агар — наиболее часто используемый гельобразующий материал в культуре ткани. Он наиболее дорогой компонент среды. В св зи с этим ведутся поиски заменителей агара, которые обладают гелирующими свойствами. В своих опытах проводили испытание гельрайта*. Использование гельрайта (0,5-2,5 г/л) при укоренении подво 62-396 стимулировало развитие стекловидности. Количество стекловидных растений уменьшалось, если гельрайт примен ли вместе с агаром (2,5 г/л). Така реакци растительных тканей, возможно, свя-зана с его способностью поглощать двухвалентные катионы.
Выводы
1. Укоренение побегов земля ники возможно на первом, робинии и вей-гелы на втором пассаже, яблони и груши после 5-10-го пассажа в зависимости от гормонального и солевого состава среды. Сокращение в среде М.С.
на 1/2 макроэлементов или на 1/2 $1/3 общего азота способствует увеличению укоренямости побегов земляники и блони.
2. Характер укоренения побегов in vitro зависит от используемых индукторов корнеобразования, их концетра-ций и сочетаний. При введении в питательную среду гумата натрия, креза-цина, мивала, культара существенно увеличилось укоренение, уменьшилось развитие каллуса. Культар способствовал развитию корневой системы непосредственно из меристематической верхушки размером 250-300 мкм, при этом корни были окрашены в зеленый цвет. Применение П'В (КЭП, твин-40) повышало активность ИМК в 2 раза и уменьшало активность культара в 6 раз, позволяло проводить этап укоре-нени при более низких концентраци х ауксинов. Совместное применение ИМК и AgNO3 ускоря ло начало корнеобра-зовани у земл ники.
3. Укоренение побегов блони зави-
село от способа и продолжительности этиоляции, температурного режима и регул торов роста. Этиол ци пролиферирующих культур при пониженных температурах в дальнейшем увеличивала укоренение побегов на среде с ИМК и уменьшала — на среде с культаром и мивалом. Композиционна среда способствовала укоренению побегов блони после 4-го пассажа, увеличению количества корней 2-го порядка, площади листьев, стимулированию развития
надземной и корневой системы на среде с 6 БАП (6 мг/л).
4. Структурная среда, состоящая из перлита и агара в соотношении 0,5-1:1 по объему, способствует получению хорошо развитой корневой системы земля ники, позволяет уменьшить кон-цетрацию агара в 3 раза.
5. Тип и концентрация углеводов в среде оказывает вли ние на характер ризогенеза растений. Наиболее приемлемыми следует признать сахарозу и глюкозу.
* Гельрайт — самогеллирующий гидроколлоид, представляющий полисахарид, содержащий уроневую кислоту, рамнозу и глюкозу (гельрайт любезно представлен доктором Циммерманом, США).
1. Аладина О.Н. Обоснование способов подготовки маточных растений ягодных кустарников к вегетативному размножению: /О.Н. Аладина/ Дис. докт. с.-х. наук: 06.01.07. М., 2004.
2. Катаева Н.В. Особенности микроразмножения трудноукореняемых сортов яблони /Н.В.Катаева // Сельскохозяйственная биология. М., 1986. Вып. 4. С. 18-22.
3. Кефели В.И. Онтогенез. М., 1970.
4. Орлов П.Н. Роль перивискулярных волокон в образовании придаточных корней у зеленых черенков садовых растений // Плодоводство ТСХА, 1985. Вып. 6.
С. 102-115.
5. Abbott A.J. Culture of Mallus tissues in vitro multiplication of apples plants from isolated shoot apices // Sci. Horticult, 1976. № 4. P. 183-185.
6. Amitrani A. et al. Influence of the moment of application of IBA and darkness on in vitro rooting of M27 // Agr. Med. Vol, 1989. № 119. P. 417-423.
7. Bartoline G. The effects of regulators of ethylene synthesis on rooting of Olea European L. cuttings // Acta Horticult, 1986. V. 8.
8. Brian C.H.,Hicks G. Micropropagation of the Cold-hardy apple rootstock KSC-3 // Can. J. of Plant Sci., 1989. V. 69. № 2. P. 555-564.
9. Cardenas Lare. Alicia et al. Potencial osmotica del medio de cultivocon differ-ents components parala propagation in vitro // Rev. fito teen. Mex., 2002. V. 25. № 2. P. 213-217.
10. Chu C.J. Effects of micropropagation techniques on guowth and development of miniature roses // Hort. Sci., 1990. V. 25. № 3.
11. Dennis P., Stmart et al. In vitro shoot proliferation of Pyrus calleriana from vegetative Buds // Hort. Sci., 1989. V. 24. № 2. P. 298-299.
12. Doolan D.W., Hennerby M.J., Moorgan J.V. Culture of micropropagated
strawberry plants in nutrient film technique // Acta. Horticult, 1983. № 133.
P. 103-109.
13. Druart P. In vitro promotion of root formation by apply shoots trough darkness effect on endogenous phenols and peroxidases // Z. Pflanrenphysiol, 1982. № 1085. P. 429-436.
14. Eliasson I., Bollmark Marie. Ethylene as possible mediator of light-induced inhibition or root growth // Physiol Plant, 1988. V. 72. № 2. P. 605-609.
15. James D. J. et al. The control of rhizogenesis in vitro in difficult-to-root apple rootstocks // Plant tissue culture, 1982. P. 187-198.
16. Geneve R.L. Root Formation in Cuttings of English Ivy treated with Paclobutra-zol // Hort. Sci., 1980. V. 25. №6.
17. Kopcewier I. The influence of red light on auxin level in coleoptiles of etiolated seed - lights in two oat varieties // Interact. Plant Symp. Occas, 1985. V. 175. P. 47-48.
18. Nicholas I.R. The use of fluorescence microscopy to monitor root development in micropropagated explant // J. of Hort. Sci., 1986. V. 61. №4. P. 417-421.
19. Pliego-Alfare F.J. Development of in vitro rooting bioassay using juvenile stem cuttings of Persea americane Mill // Hort Sci., 1988. V. 63. №2. P. 295-301.
20. Raphael Plus. IAA-induced adventitious root fo rmation in green wood cutting of populas tremula and formation 2-indoline-3acetyeasparatic acid a new metabolite of exogeneo usly applied IAA // Physiol. Plant, 1989. V. 75. P. 86-89.
21. Reiner I. Control of Morphogenesis in Plant Tissue culture by Hormones and Nitrogen Compounds // Plant growth substrances, 1970. P. 686-694.
22. Ripley K.P. et al. Micropropagation of Euphorbia lathyris // Plant. Cell Tissue and Organ Culture, 1986. V. 5. № 3. 213-218.
23. Rugini E. et al. In vitro control of shoot virtification in almond and development of a technique to Eliminate apex necrosis and shoot base photo-axidation in pistachio // Hort. Sci., 1986. V. 21. №3.
24. Scott E. Sucrose and nitrogen regulation of adventitious root initiation from cultured rose shoot tip // Hort. Sci., 1984. V. 14.
25. Smith D.L. Ethylene associated phase change from juvenile to mature phenotype of daylily // Phisiol. Plantarum, 1989. V. 76. P. 466-473.
26. Takashi Harada et al. Stades the Morphogenesis of asparagus organ formation in the in vitro culture of segments with a node excited from the shoots seedlings // J. Fac. Agr. Hokkaido Univ, 1983. V. 61. № 3. P. 295-306.
Рецензент — д. с.-х. н. А.В. Исачкин
SUMMARY
Results of a long-term investigation into effect of various growth regulators, carbohydrates, passaging duration, agar quality, medium structure, food solution saline composition on root growth are provided in the article. Both stages and duration of rhyzogenesis questions have been discussed. Much consideration is given to the etiolation problem, physical factors, both hormonal and saline composition of nutrient medium. Both true and important data on light and medium composition influence upon rhyzogenesis and viability of plants under unsterile conditions are given in the article.
Key words: in vitro, growth regulators, nutrient medium, etiolation, carbohydrates, strawberries, apple tree, pear tree, lilac, rose, Chinese actinidia, ash tree.
Деменко Василий Иванович — д. с.-х. н., РГАУ - МСХА имени К.А. Тимир язева. Тел. 976-21-98.
Лебедев Вадим Григорьевич — к. б. н., Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Шестибратов Константин Александрович — к. б. н., Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
