CC BY
519
ПЛОДОВОДСТВО, САДОВОДСТВО И ОВОЩЕВОДСТВО
Известия ТСХА, выпуск 2, 2005 год
УДК 631.535.5
ПРОБЛЕМЫ И ВОЗМОЖНОСТИ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ САДОВЫХ РАСТЕНИЙ. ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ
В. И. ДЕМЕНКО
(Кафедра плодоводства)
В статье приводятся данные многолетних опытов по введению в культуру большого числа видов растений. Показана важность воздействия на экспланты температуры, электростатического поля, дефолиации, этиоляции. Представлена методика подбора солевого состава среды, а также показана необходимость использования в качестве регуляторов роста гиббереллина совместно с ССС, куль-тара, пике; кремнийорганических соединений, гумата натрия.
Прошло 30 лет после публикации Боксюса [4], которая положила начало промышленному размножению садовых растений in vitro. Его заслуга заключается в том, что он сумел оценить морфогенетическую реакцию эксплантов на применение 6БАП в технологии размножения растений. Методы микроклонального размножения, несомненно, имеют достаточно преимуществ. Однако у них есть и недостатки. Они требуют больших затрат ручного труда, при этом более 50% времени тратится на работы, не связанные с растительным материалом. Для того чтобы свести к минимуму потери регенерантов на основных этапах размножения, требуется дорогое оборудование. Кроме технических микроклональное размножение имеет много и чисто биологических проблем. 30-летний опыт промышленного использования, а также данное исследование позволяют несколько по-иному оценить его значимость. В современных публикациях уже не встретишь высказывания о том, что коэффициент размножения может достигать 1 : 106 — он теоретичес-
ки возможен, но не целесообразен по ряду причин.
Перед современными исследованиями в области микроклонального размножения стоят две основные проблемы. С одной стороны, это достижение экономически целесообразного коэффициента размножения, с другой — сведение к минимуму возможных отклонений от сорта. Они зависят от сорта и его возраста, склонности к образованию каллуса, типа экспланта, продолжительности культивирования, способа культивирования, состава питательной среды, условий выращивания.
Процесс микроклонального размножения состоит из ряда последовательных этапов, каждый из которых имеет свою значимость и создает определенные проблемы. Первым этапом является отбор эксплантов и введение их в культуру. Он наиболее затратный. Производительность мала, а потери могут быть большими. Лаборатории, планирующие производить несколько миллионов растений в год, должны начинать такое производство с неменее 2000 сте-
рильных эксплантов. Однако задача первого этапа получить не только стерильные, но и способные к дальнейшему росту экспланты.
Культура изолированных органов и тканей растений в начале использовалась как метод исследований в физиологии растений. Большинство авторов ставили задачи длительного роста эксплантов. Поэтому среды, перенесенные с физиологических исследований, стимулируют развитие каллуса. Водный потенциал питательных сред примерно в 10 раз ниже, чем водный потенциал почвенного раствора при нормальной увлажненности почвы. Такая концентрация питательной среды необходима для выращивания растений in vitro, но может быть причиной возникновения стекловидности.
Для успешного размножения растений in vitro следует детализировать состав питательных сред с учетом многих факторов, влияющих на рост и развитие эксплантов. Это необходимо, так как среды, отработанные для одних условий, в полной мере не могут соответствовать для других. Условия выращивания могут влиять на метаболизм синтезируемых веществ и компонентов, добавляемых в среду.
Вопрос о составе макро- и микроэлементов в питательных средах, пожалуй, является наименее изученным разделом микроклонального размножения, несмотря на огромное количество публикаций. Большинство работ выполнены на основе минерального состава питательных сред Мурасига и Скуга, Уайта, Хеллера, Нича, раствора Кнопп. Выбор состава питательной среды усложняется тем, что получению целостного растения предшествуют несколько этапов размножения, при этом поведение экспланта может варьировать в зависимости от физиологического,
онтогенетического статуса растения. Для каждого сорта оптимальная среда должна подбираться индивидуально [6]. Большинство процессов роста и развития у целых растений и их отдельных органов могут нормально осуществляться лишь при участии физиологически активных веществ.
Одним из основных аргументов возможного интенсивного размножения растений in vitro является утверждение, что физиологические процессы у эксплантов проходят при строго контролируемых оптимальных условиях. Действительно, мы можем задать необходимые параметры температуры, света, влажности, состава питательной среды. Однако следует отметить, что экспланты, отделенные от маточного растения и подвергнутые стерилизации, находятся в стрессовом состоянии, а изменения в процессе выращивания газового состава внутри сосуда и состава питательной среды усиливают его. Если все это накладывается на неоптимальный состав среды, условия выращивания, то в процессе размножения возникают анатомо-физиологические расстройства, которые могут значительно снизить эффективность микрокло-нального размножения.
Наибольший ущерб наносят стек-ловидность, некроз верхушек, отсутствие кутикулярного слоя, нефункциональные устьица и неработающая корневая система. У одних растений признаки стекловидности (заполнение межклеточного пространства жидкостью) появляются уже на первых этапах размножения, у других стекловидность — явление редкое. Побеги с признаками стекловидности при размножении in vitro производят себе подобных. Они редко укореняются, а полученные растения могут жить
только in vitro. Но даже, если степень проявления стекловидности незначительна, то перенести такие растения в нестерильные условия очень проблематично. Стекловид-ность связана с нарушением водного потенциала клеток экспланта, что, в свою очередь, объясняется нарушением процесса транспирации in vitro. Воздействие на стекловидные растения темнотой, АБК, антитран-спирантами, манитолом, высокими концентрациями С02, т. е. факторами, которые закрывают устица у нормальных растений были безуспешными.
Так как перемещение макро-, микроэлементов происходит по ксилеме и зависит от интенсивности транспирации, то экспланты in vitro часто испытывают недостаток в элементах питания, в частности Са, что является одной из причин некроза верхушек побегов in vitro [3].
Все аномальные явления, наблюдаемые у растений in vitro, связаны с изменениями в содержании и активности эндогенных гормонов. Ненормальная структура листьев и побегов может быть следствием и результатом потери полярности перемещения ауксина, что, в свою очередь, обусловлено интенсивным синтезом этилена. Получается замкнутый круг. Размножение растений in vitro невозможно без введения в питательную среду цитокининов и ауксинов, но эти регуляторы роста стимулируют синтез этилена, который вызывает развитие аномальных процессов. Таким образом, оптимальное соотношение экзогенных регуляторов роста в питательной среде очень важно для промышленного применения микроклонального размножения. Промышленное его использование возможно только при условии успешного переноса растений из in vitro в нестерильные условия.
Вследствие перечисленных выше физиологических расстройств, растения в нестерильных условиях испытывают водный стресс, что задерживает их рост или вызывает гибель [5]. К водному стрессу добавляется неспособность пробирочных растений к фотоаутотропии [8]. Еще один фактор, создающий проблемы при пересадке растений в нестерильные условия — недостаточно функциональная корневая система. Корни растений, полученные in vitro, имеют особое анатомическое строение, их сосуды часто не связаны с сосудами побега, у них отсутствуют корневые волоски [7]. Поэтому у растений, которые перемещают в другие условия, либо должны адаптироваться старые их части, либо вырасти достаточно быстро новые. Желательно, чтобы эти два процесса происходили одновременно.
Адаптация пробирочных растений зависит от вида растений, времени пересадки. Те виды растений, которые быстро растут в нестерильных условиях, адаптируются без тщательного контроля за влажностью воздуха. Большинство видов растений, особенно древесные, необходимо начинать готовить к новым условиям еще in vitro. Для этого предлагают открывать сосуды на несколько дней; уменьшать влажность воздуха в сосуде, нанося на поверхность среды ланолиновую пасту; создавать температурный градиент внутри сосуда; наносить на листья антитранспиранты. Однако все эти воздействия часто не обеспечивают высокий процент приживаемости растений в нестерильных условиях. Несмотря на достаточную изученность многих физиологических процессов, до и после переноса, ответственных за приживаемость, мы не имеем простого технологического решения. Одни ре-
комендации сложны в исполнении, другие требуют сложного технического решения.
В связи с вышеизложенным все проведенные исследования были направлены на решения проблем, возникающих при микроклональном размножении с целью разработать технически не сложную технологию.
Условия и методы исследований
Работа выполнялась с 1976 г. по 2004 г. в НИЗИСНП и МСХА. В качестве объектов исследования были использованы различные жизненные формы растений (деревья, кустарники, лианы, травы). Экспланты растений были представлены меристо-матическими верхушками, растущих побегов и боковых почек. На первом этапе использовали среду Мурасига и Скуга (М.С), содержащую 0,5 мг/л 6БАП и 0,5-0,01 мг/л ИМК. В процессе исследований изучали влияние температуры, этио-ляции, дефолиации, электростатического поля на рост и развитие эксплантов плодовых и ягодных культур. Для устранения отрицательного влияния, выделяемых эксплан-тами фенолов испытывали витамин Е и различные способы посадки эк-сплантов. Стерилизацию эксплантов проводили сулемой, азотнокислым серебром и сернокислой медью. С целью определения оптимального состава — макро-, микроэлементы, хлористый кальций, хелат железа, питательных сред Муросига и Скуга, Кноппа испытывали (1, 1/2, 1/3) при всех возможных комбинациях (81 вариант). Экспланты выращивались при 16-часовом дне, 23— 25°С, освещенность 3000-3500 люкс.
Результаты исследований
Традиционно технология микро-клонального размножения делится на 4 этапа. Однако данные, полу-
ченные в процессе наших исследований, предполагают их увеличение. Необходимо узаконить такие понятия, как выбор маточного растения, тип экспланта, физиологический и онтогенетический статус растения, предварительное воздействие на растение и эксплант.
Все этапы микроклонального размножения сопровождаются травмированием тканей, что приводит к образованию некротической прослойки. Неповрежденные клетки интенсивно делятся, вызывая образование каллуса. Поэтому уже на этапе введение в культуру необходимо создать условия для превалирования роста растяжением над ростом делением.
Количество эксплантов, пригодных для дальнейшего размножения, зависело от вида растений, сорта и состава питательной среды, способов предварительного воздействия на растение и эксплант (табл. 1).
Регенерационная способность эк-сплантов в наших опытах не зависела от жизненной формы маточного растения и не коррелировала со способностью испытанных видов к вегетативному размножению традиционными способами.
Реакция видов на общепринятую методику размножения in vitro позволяет их разделить на несколько групп.
Экспланты черешни, миндаля, грецкого ореха, лещины, лимонника, можжевельника погибали уже к концу первого пассажа без признаков увеличения его длины. Причины гибели эксплантов других культур (яблоня, ива козья, ирга канадская) были связаны с интенсивным выделением фенолов, с развитием каллуса и стекловидности (черешня, тополь серебристый, крыжовник). Очень долго оставались живы верхушки кедра, у которых преобла-
Таблица 1
Реакция эксплантов различных видов растений на введение в культуру
(среда М.С.; 6БАП 0,5 мг/л; ИМК 0,5-0,01 мг/л)
Способность к микроклональному размножению
Вид Жизненная форма % живых эксплантов после % эксплантов
1-го пассажа 2-го пассажа стекловидных с каллусом
Дерево Яблоня 0-67 30
Груша 60 40
Черешня 33 0
Вишня 80 56
Вишня разноцвет. 70 19
Магнолия кобус 27 9
Тюльпанное дер. 63 50
Робиния 100 100
Грецкий орех 0 0
Лещина 75 0
Тополь сереб. 100 0
Кедр 90 0
Клен Фламинго 75 60
Клен японский 60 0
Миндаль махров. 90 0
Ива козья 0 0
Кустарник Крыжовник 0~45 0
Камелия 0
Жимолость 90 0
Облепиха 0
Ирга канад. 0
Лох серебрист. 0
Шиповник 70 0
Рододендрон 60 30
Можжевельник каз. 70 2
Вейгела 100 100
Форзиция 60 100
Пион древовид. 40 10
Лианы Бугенвилла 30 0
Лимонник 0
Киви 98 75
Травы Земляника 40-50 95
Флокс 90 60
10 100
11 20 0 0 100 100 100
50
55
100
90
10 50 0 о
5 100
25
дал интенсивным радикальный рост. Из всех видов только вейгелла, робиния, форзиция легко вводились в культуру, обеспечивая хорошее развитие материала для дальнейшего размножения in vitro.
Для получения желаемого роста на этапе введения в культуру, т. е. удлинения экспланта, необходимо стимулировать к росту растяжением субапикальную меристему. В субапикальной меристеме вторичная
меристема представлена прокамбием, его превращение в камбий контролируется гормонами. Только после этого в растущем экспланте создается функциональная сосудисто-проводящая система, обеспечивающая его рост в длину.
Характер развития эксплантов на питательной среде зависел от местоположения его на маточном растении (табл. 2), времени введения в культуру, состава питательной среды и возраста маточного растения.
Таблица 2 Влияние положения почки на побеге крыжовника на ее регенерационную
способность (сорт Русский, среда Фоссарда 6БАП 0,5 мг/л; НУК 0,1 мг)
№ почки от % реге- Кол-во Дли-
вершины нера- листьев, на,
побега ции шт. мм
Верхушечная
Вторая
Третья
Четвертая
Пятая
НСР,„
45а 656 47а 30а 20в
2,8 3,9 3,3
6.3 3,0
2.4
6,8 7Д
6.4 6,6
6.5 1,8
Регенерационная способность эксплантов крыжовника уменьшалась по мере удаления от верхушки побега. Результаты опытов с земляникой подтвердили пригодность мери-стематических верхушек рожков, усоплетей на этапе введения в культуру. Однако только пазушные меристемы усоплетей обеспечивали
100%-ю регенерацию, и культуры с большой степенью пролиферации. Нецелесообразным оказалось введение в культуру боковых почек взрослых растений яблони типа спур зимой и в фазу активного роста. Первые очень долго оставались в состоянии покоя, вторые выделяли в среду много фенолов. Наиболее высокой регенерационной способностью и быстрым началом активной пролиферации обладали экспланты, взятые с растений, выращиваемых в теплице в фазу активного роста.
Существенное влияние на реализацию морфогенетического потенциала оказывает возраст маточного растения (табл. 3).
Экспланты с молодых растений груши обладали более высоким мор-фогенетическим потенциалом, способны образовывать и развивать в большем количестве листьев, что в дальнейшем сказывается на коэффициенте размножения. Удаляя эксп-лант с маточного растения, мы фиксируем его физиологическое и анатомическое состояние, нарушая корреляционные связи с органами маточного растения. Поэтому успешное начало микроклонального размножения во многом зависит от того, на сколько условия in vitro приближены к состоянию целостного растения. Огромная роль в данном процессе отводится составу питательной среды. Однако, исследуя реакцию большого числа видов на этапе вве-
Таблица 3
Влияние возраста маточного растения на регенерационную способность меристематических верхушек груши
(сорт Лада, среда Кноппа 6БАП 0,5 мг/л, ИМК 0,1 мг/л)
Место взятия эксплантов Кол-во листьев, шт. Длина, мм % приживаемости
24-й день 35-й день 24-й день 35-й день 35-й день
'Маточное растение (15 лет) 6 6,2 21,7 22,8 96
Окулянты 8 11,8 19,6 20,1 92
нср|16 1,4 1,9
дения в культуру, можно сделать вывод, что для культур с плохой регенерационной способностью необходимы другие факторы воздействия на эксплант до и после его введения в культуру
В своих опытах мы исследовали влияние температуры, этиоляции, дефолиации, электростатического поля и др. Факторы, которые изучали в данном опыте (табл. 4), очевидно, создают стрессорные реакции, способствующие повышению регене-рационной способности верхушек, что, очевидно, связано с увеличением содержания ИУК, а также с активацией системы антиоксидан-тной защиты [1]. Повышение содержания ИУК и активация анти-оксидантной защиты являются определяющим на этапе введения в культуру. Практически 100%-я регенерация была отмечена в опыте с меристематическими верхушками крыжовника, подвергнутыми термотерапии (+38°С).
В процессе микроклонального размножения уже на этапе введе-
ния эксплантов в культуру могут возникнуть предпосылки для отклонения от сорта. Как правило, избежать их возможно, если уже в начале культивирования удается получить единичный побег на средах, содержащих небольшие концентрации регуляторов роста, либо без них. Однако это трудно осуществить для ряда культур. В связи с этим изучали возможность выращивания верхушек в условиях электростатического поля. На разные виды растений его воздействие было неоднозначным (табл. 5).
Электростатическое поле стимулировало рост эксплантов в длину и увеличивало количество листьев. Максимальное увеличение отмечено для крыжовника (78%) и груши (46%). В данном опыте использовали меристематические верхушки боковых почек, которые в условиях in vitro долго не развиваются. С целью определения механизма действия электростатического поля на меристематические верхушки изучали совместное его
Таблица 4
Влияние абиотических факторов на рост и развитие меристематических верхушек груши (сорт Лада, среда М.С.; 6БАП 1 мг/л; ИМК 0,5 мг/л)
Абиотические факторы
Приживаемость,
%
Количество листьев, шт.
Длина, мм
Контроль 60а
Хранение при температуре 0~2°С 786
Верхушки с дефолиированных побегов 67а
3,2а 4,76 9,6в
14,2а 16а 18,46
Таблица 5
Влияние электростатического поля на регенерацию меристематических верхушек различных растений (среда М.С.; 6БАП 0,2 мг/л; ИМК 0,05 мг/л)
Культура Кол-во живых меристем, % В т.ч. тронувшихся в рост меристем, %
контроль электростат. поле контроль электростат. поле
Подвой 62-396 95
Крыжовник 0
Груша 90
Смородина крас. 45
Облепиха 61
Черешня 86
100 58 100 55 83 100
25 0 60 55 0 86
30 90 90 70 0 100
действие с регуляторами роста, для чего в питательную среду вводили культар, обладающий сильным ан-тигиббереллиновым свойством. В качестве эксплантов использовали меристематические верхушки малого размера земляники и груши (табл. 6).
В контроле экспланты земляники отличались слабым ростом, больше половины погибли к концу первого пассажа. Культар существенно ин-гибировал рост верхушек в длину, но верхушки оставались жизнеспособными на протяжении наблюдений.
Электростатическое поле существенно увеличило рост верхушек земляники и груши и устранило ин-гибирующее действие культара. Электростатическое поле «защищало» экспланты от экстремальных условий физических и химических факторов. Меристематические вер-
0,2 мг/л 6БАП 64 100 2,5
0,2 мг/л культар 100 100 3,0
го фенолов. Однако при всех комбинациях многие экспланты развивали у основания каллус.
Снижение последействий стресса, вызванного поранением и окислением тканей экспланта, возможно при введении в состав питательной среды веществ с антиокислительными свойствами. В опытах с сортом Мелба эффективной оказалась питательная среда с добавлением витамина Е в количестве 0,001 объема среды. Регенерационная спо-
хушки крыжовника оставались живы в условиях электростатического поля, если на них воздействовали температурой +38°С, контрольные погибли.
Высокие дозы в питательной среде 6БАП (5 мг/л) вызвали гибель эксплантов земляники; в условиях электростатического поля они оставались живы.
Экспланты ряда видов на этапе введения в культуру выделяют много фенолов. Учитывая, что фенолы в условиях этиоляции не метаболи-зируют использовали верхушки побегов подвоя 62-396, полученные в условиях этиоляции при высокой и низкой температуре (табл. 7).
Выгонка побегов при низкой температуре и выращивании в условиях освещенности могло бы быть приемлемой методикой введения в культуру видов, выделяющих мно-
6
6,0 4 6 41,6 92,3
6,0 2 7 0 40
Влияние подготовки эксплантов и условий дальнейшего выращивания на их приживаемость
Условия получения эксплантов Приживаемость верхушек (%) в условиях
этиоля-ции освещенности
Этиоляция —2°С 35а 606
Этиоляция +24°С 15а 45а
Выгонка побегов
на свету 25а 40а
Таблица
Влияние электростатического поля на рост меристематических верхушек
(земляника — сорт Редгонтлит, груша — сорт Лада, среда М.С., экспланты — меристематический купол + примордиальный лист)
Регулятор роста
Земляника
живые меристемы, %
листья, шт.
длина, мм
конт. опыт.
Груша
живые мерис темы, %
собность верхушек в мае на среде с витамином Е повысилась в два раза по сравнению с контролем.
В процессе выделения фенолов и их окисления верхний слой среды загрязнялся продуктами окисления. В этой связи провели испытание нового способа посадки экс-плантов. Верхушки сорта Мелба помещали на питательную среду верхней частью, а пробирки ставили таким образом, чтобы не нарушить их полярность. Отсутствие контакта основания экспланта со средой, увеличение площади поглощения компонентов среды стало причиной интенсивного роста и повышения приживаемости эксплан-тов (табл. 8). Данная методика исключает необходимость частых пересадок на первых пассажах.
Таким образом, этап введения эксплантов в культуру сопровождается двумя событиями: отделение экспланта, что вызывает реакции на поранение (выделение этилена, окисление) и посадка на питательную среду, что приводит к новым корреляционным связям на уровне тканей и органов, изменению в гормональном балансе и энергетике. Эти два процесса взаимосвязаны, зависят от среды и условий выращивания, давая развитие, подобное интактному растению (удли-
Таблица 8 Влияние способа посадки эксплантов яблони (сорт Мелба) на регенера-ционную способность in vitro (боковые почки — числитель, верхушки — знаменатель)
Способ Кол-во, Дли- Кол-во Кол-во
посадки на, листь- пасса-
верхушек /о мм ев, шт. жей
Контроль 22 ЗЛ 1,5 2
20 4,4 2
Опыт. 97 8J3 2,5 1
87 9,3 1
нение междоузлий, образование листьев), либо отличное (формирование каллуса, адвентивное образование почек).
Негативные последствия отделения эксплантов можно уменьшить, изменив методику стерилизации. Максимальное увеличение длины побегов земляники отмечено в варианте стерилизации эксплантов AgNOs совместно с CuS04. Данный синергизм, очевидно, обусловлен нивелированием действия этилена AgNOs и уменьшением активности ИУК-окси-дазы под влиянием CuS04 [2].
Опыты, проведенные со многими видами растений, подтверждают важность подбора солевого состава питательной среды. Для успешного размножения состав солей должен быть подобран таким образом, чтобы получить максимум междоузлий на побеге. Данные опытов позволяют рекомендовать среду М.С. для земляники сорта Фестивальная, Заря, среду Ёниге — для сорта Зенга-Зенгана, Редгонтлит, среду Фоссарда — для Зари, Редгонтлит, Фестивальная. Регенерационная способность верхушек крыжовника сорта Русский выше на среде В5 и на половинной среде М.С. с двойным содержанием Са.
Неоднозначная реакция видов на количественный и качественный состав и форму среды предполагает необходимость изменить методику подбора солевого состава. Для этого необходимо было испытать среды, отличающиеся количественным и качественным составом. В качестве объекта исследований были выбраны груша (сорт Лада) и вишня (сорт Апухтинская), которые выращивали на средах М.С., Кноппа, Мак Коуна. Меристематические верхушки груши лучше росли на среде М.С., а вишни — на среде Кноппа. Макро-, микроэлементы,
Са, хелат железа этих сред испытывали в комбинациях 1 : 1/2 : 1/3. Для каждой культуры провели испытания 81 варианта солевого состава сред. В опытах с грушей ни одна из комбинаций не оказала ос-лабяющего действия на рост эксп-лантов, пять — существенно усилили его (табл. 9).
Наиболее приемлемы среды для груши — № 38 и № 47. В начале они стимулируют рост растяжением, а к концу первого пассажа существенно увеличивают количество листьев и длину экспланта. Сложная реакция эксплантов на солевой состав отмечен в опытах с вишней. Половина сред способствовала существенному изменению интенсивности образования листьев и росту растяжением эксплантов, из них 36 сред влияло положительно, 16 — отрицательно, 18 сред существенно увеличили количество листьев и длину эксплантов. Если в питательной среде макроэлементы представлены рецептурой раствора Кноппа, то увеличение количества листьев и длины экспланта вишни происходило с уменьшением концентрации кальция. Существенное влияние на рост эксплан-та оказывало уменьшение концентрации хелата железа. Таким образом, наиболее приемлемой средой для вишни на этапе введения в куль-
туру следует признать среду № 49 (1/2 : 1/3 : 1/2 : 1 среды Кноппа). Уменьшая содержание макроэлементов, мы в первую очередь уменьшаем содержание азота. В этой связи изучали влияние уменьшения азота в среде М.С. при введении в культуру эксплантов земляники сортов Редгонтлит, Зенга-Зенгана. Азот применяли в концентрации 1/2 - 1/8 рецептуры среды М.С. Уменьшение содержания общего азота в среде М.С. на 1/2 было наиболее оптимальным для введения в культуру эксплантов земляники. Уменьшение до 1/6 содержания азота вызывало развитие стек-ловидности. Известно, что рост и развитие растений зависит не только от общего содержания азота, но и от соотношения аммонийной и нитратной форм. При наличии в питательной среде М.С. только КЩ+ (5, 10, 20 мМ) приживаемость эксплантов земляники сорта Редгон-тлит была максимальной, однако больше половины из них были стекловидными. Если в питательной среде азот был представлен NO, (5, 10, 20 мМ), то приживаемость эксплан-тов была минимальной. При равном соотношении NH4 : NOa 1 : 1 приживаемость увеличилась с увеличением содержания общего азота. Если в среде превалировал NH4+ (2 : 1), то приживаемость уменьшалась с уве-
Таблица 9
Влияние солевого состава питательной среды на рост и развитие верхушек груши (сорт Лада, 6БАП 1 мг/л, ИМК 0,5 мг/л)
Состав среды На 12-й день На 22-й день На 34-й день
№ среды макроэлементы Са микроэлементы хелат Ге кол-во листьев, шт. длина, мм кол-во листьев, шт. длина, мм кол-во листьев, шт. длина, мм
М.С. (контроль) 1111 0,7а 4,7а 2а 6а 2,3а 7,3а
42 1/2 1/2 1/2 1/3 2,36 186 н.с. н.с. н.с. н.с.
74 1/3 1/3 1 1/2 3,0в н.с. 7,06 н.с. н.с. ас.
38 1/2 1/2 1 1/2 н.с. 15,66 н.с. 16,36 7,06 17,3а
47 1/2 1/3 1 1/2 н.с. 9,7а 6,36 157а 7,36 20,36
личением общего азота. Если соотношение NH4 : N03 равно 1:3, то при общем азоте 10 мМ приживаемость была минимальной, если соотношение NH4 : N03 — 3:1, то при общем содержании азота 10 мМ приживаемость была максимальной.
Приживаемость и рост растяжением эксплантов зависит не только от солевого состава питательной среды, но и от регуляторов роста, в основном цитокинов и ауксинов. Часто трудно подобрать оптимальное их соотношение вследствие разнокачественности эксп-лантов. Поэтому необходим поиск других регуляторов роста, особенно для культур, способных уже на первом этапе образовывать адвентивные побеги. Для этой цели мы испытали сочетание гиббереллина с антигибберелинами — ССС, куль-тар, пике, которые применяли в диапазоне концентраций ОД-1 мг/л. Все сочетания существенно увеличили длину эксплантов земляники сорта Эстафета. Максимальный рост растяжением отмечен в вариантах 0,1 мг/л гиббереллина + 0,1 мг/л ССС; 0,5 мг/л гиббереллина + ОД мг/л культара; ОД мг/л гиббереллина + + 0,5 мг/л пике. Длина побегов (без учета длины листьев) увеличилась в 3-4 раза. Некоторые побеги достигли длины 3,5 см, т. е. земляника теряла розеточный габитус. Положительные результаты получены при введении в питательную среду кремнийорганических соединений мивала и крезацина, а также гу-
мата натрия. Во всех вариантах, где присутствовал гумат натрия, у эксплантов развивались трехлопастные листья.
Заключение
Эффективность микроклонального размножения садовых растений зависит от регенирационной способности мерис-томатических верхушек и может быть увеличена за счет усиления роста растяжением первичного экспланта, уменьшения интенсивности образования каллуса и стекловидности. Сокращение физиологических расстройств на первом этапе возможно при использовании сред, сбалансированных по солевому составу, физических факторов (температура, электростатическое поле), регуляторов роста и методов, уменьшающих отрицательное влияние окислительных процессов на рост эксплантов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Веселое J1. П. IV Съезд общества физиологов растений России, 2000. Т. 1. С. 332-333. — 2. Вонсаеичене В. Н. и др. IX Всесоюзная конференция по проблемам микроэлементов в биологии, 1981. С. 155-157. — 3. Boxus Ph. et al. Plant Cell. Tissue and Organ Cult. Berlin (West), 1977. — 4. Branke М. M. et al. Plant Cell. Tissue and Organ Culture, 1989. 19(1). P. 85-89. — 5. David W. et al. Plant Cell. Tissue and Organ Culture, 1989. V. 17. № 3. P. 225-234. — 6. Ellen Sutter. J. Am. Hort. Sri., 1988. 113(3). P. 234-238. — 7. Gront B. W. Acta Horticultare, 1988. № 230. P. 129-135.
В ближайших выпусках журнала будет продолжение публикации данного материалал
Статья поступила 16 декабря 2004 г.
SUMMARY
In this article some data on longterm experiments with introduction of great number of plant varieties into culture are given. The importance of the impact on explants of temperature, electrostatic field defoliation and etiolation is represented. The selection methods of media salt composition are given, also the necessity of using gibberellins as growth regulators together with CCC; silicon organic compounds and sodium humate is shown.
