CC BY
1
https://doi.org/10.17116/molgen2023410413
Цитотоксическая активность феназиновых соединений Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca в отношении культуры клеток HeLa
© А.А. ЖИЗНЕВСКАЯ, А.А. ЛУКАШЕВИЧ, Н.П. МАКСИМОВА, Е.Г. ВЕРЕМЕЕНКО
Белорусский государственный университет, Минск, Республика Беларусь РЕЗЮМЕ
Исследована цитотоксическая активность феназиновых соединений различных штаммов бактерий Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca в отношении линии клеток аденокарциномы шейки матки HeLa. Установлено, что цитотоксические концентрации феназинов в отношении клеток линии HeLa составляют 300 мкг/мл. Получены цитологические препараты клеток HeLa после обработки феназинами, которые демонстрируют наличие апоптотических телец. Показано, что действие феназинов на клетки линии HeLa приводит к изменению экспрессии в них генов ABC-транспортеров (abccl и abcg2) и tp53. Активность последнего увеличивается почти в 13 раз, тогда как экспрессия генов abcc1 и abcg2 снижается. Активация tp53, вероятно, является одной из причин апоптотической гибели клеток линии HeLa в присутствии феназиновых соединений бактерий P. chlororaphis subsp. aurantiaca.
Ключевые слова: феназины, цитотоксическая активность, HeLa, апоптоз, АВС-транспортеры. ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
Жизневская А.А. — https://orcid.org/0009-0003-5625-9812; e-mail: [email protected] Лукашевич А.А. — e-mail: [email protected] Максимова Н.П. — e-mail: [email protected] Веремеенко Е.Г. — e-mail: [email protected]
Автор, ответственный за переписку: Жизневская А.А. — e-mail: [email protected] КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Жизневская А.А., Лукашевич А.А., Максимова Н.П., Веремеенко Е.Г. Цитотоксическая активность феназиновых соединений Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca в отношении культуры клеток HeLa. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2023;41(4):3-9. https://doi.org/10.17116/molgen2023410413
Cytotoxic activity of phenazine compounds Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca in relation to HeLa cell culture
© A.A. ZHYZNEYSKAYA, A.A. LUKASHEVICH, N.P. MAKSIMOVA, E.G. VEREMEENKO
Belarusian State University, Minsk, Respublic of Belarus ABSTRACT
In this work, the cytotoxic activity of phenazine compounds of different strains of Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca against the cervical adenocarcinoma cell line HeLa was investigated. The cytotoxic concentrations of phenazines against HeLa cells were 300 mcg/ml. Cytological preparations of HeLa cells were obtained after incubation with phenazines, showing the presence of apoptotic bodies. It was shown that the effect of phenazines on HeLa cells leads to a change in the expression of their ABC transporter genes (abcc1 and abcg2) and of tp53. The activity of tp53 increases almost 13-fold, while the expression of the abcc1 and abcg2 genes decreases. Activation of tp53 is probably one of the causes of apoptotic death of HeLa cells in the presence of phenazine compounds from Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca.
Keywords: Phenazines, cytotoxic activity, HeLa, apoptotic death, ABC transporter. INFORMATION ABOUT THE AUTHORS:
Zhyzneyskaya A.A. — https://orcid.org/0009-0003-5625-9812; e-mail: [email protected] Lukashevich A.A. — e-mail: [email protected] Maksimova N.P. — e-mail: [email protected] Veremeenko E.G. — e-mail: [email protected]
Corresponding author: Zhyzneyskaya A.A. — e-mail: [email protected] TO CITE THIS ARTICLE:
Zhyzneyskaya AA, Lukashevich AA, Maksimova NP, Veremeenko EG. Cytotoxic activity of phenazine compounds Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca in relation to HeLa cell culture. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2023;41(4):3-9. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen2023410413
Введение
Вторичные метаболиты ряда микроорганизмов обладают выраженной биологической активностью, которая придает конкурентное преимущество их продуцентам. Многие из веществ микробного происхождения демонстрируют ценные для человека качества, такие как антибиотические и цитотоксические свойства. Такие соединения активно изучаются с целью их дальнейшего применения в качестве лекарственных препаратов.
Одной из основных проблем современной медицины являются онкологические заболевания. Высокая смертность пациентов обусловлена быстрым про-грессированием опухолей, низкой эффективностью препаратов наряду с их токсичностью в отношении нормальных клеток организма. Появление рецидивов заболевания связано в том числе с развитием лекарственной резистентности. В связи с этим по-прежнему актуальным является поиск и разработка новых высокоэффективных противоопухолевых препаратов.
Получение биологически активных молекул из таких природных источников, как микроорганизмы, позволяет существенно расширить спектр тестируемых соединений. Большой интерес в этом отношении вызывают ароматические гетероциклические соединения. Одной из групп таких веществ являются феназины. Они представляют собой вторичные метаболиты почвенных и глубоководных морских микроорганизмов родов Pseudomonas, Streptomyces, No-cardia, Sorangium, Brevibacterium, Burkholderia, Bacillus, Xanthomonas и др. [1]. Показано также наличие связанного с мембраной и используемого в качестве переносчика электронов в процессе метаногенеза производного феназина у архей рода Methanosarcina [2]. Для исследовательских и промышленных целей феназины чаще всего получают из грамположительных бактерий рода Streptomyces и грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas. Представители данных родов обладают наиболее высоким природным уровнем синтеза этих метаболитов и широким разнообразием их природных производных, что делает их более перспективными кандидатами на роль продуцентов феназиновых соединений [3].
Основу химической структуры феназинов составляет пиразиновое кольцо (1,4-диазабензол), которое представляет собой группировку из двух бензольных колец, соединенных с помощью двух атомов азота. К ядру могут присоединяться разнообразные заместители, что обусловливает многообразие фе-назиновых производных и их биологических активностей [1, 4].
Так, феназины демонстрируют антибиотические, цитотоксические, противогрибковые, инсектицидные и противопаразитарные эффекты [3. 4]. К примеру, феназин-1-карбоновая кислота (ФКК), 2-гидрок-сифеназин-1-карбоновая кислота и феназин-1-кар-
боксамид (ФКМ), продуцируемые бактериями родов Pseudomonas fluorescens и P. chlororaphis, выделяются в ризосферу, где ингибируют развитие почвенных фитопатогенных грибов [5]. ФКК, также известная как тубермицин B, обладает антибиотической активностью в отношении Mycobacterium tuberculosis [3]. Тубермицин В и хлорорафин (зеленый пигмент P. aeruginosa) эффективно ингибируют рост Bacillus cereus, вызывающей пищевые токсикоинфекции человека [3]. Феназиномицин проявляет как противоопухолевую, так и антибактериальную активность: показано, что он подавляет жизнедеятельность золотистого стафилококка, кроме того, он оказался эффективен в отношении саркомы у мышей in vivo. Для производного феназина, называемого NC-190, продемонстрирована противоопухолевая активность в отношении клеточной линии лейкемии человека HL-60, которая сопоставима с применяемым в клинической терапии этопозидом [6]. Также известно, что феназиномицин и лавандоцианин, выделенные из штаммов Streptomyces sp. CL190 и CL9659, проявляют ярко выраженную цитотоксическую активность в отношении андромицинустойчивой лейкозной клеточной линии P388 мышей и других опухолей грызунов in vivo [5]. ФКК и феназин-1,6-дикарбоновая кислота (ФДК) обладают цитотоксической активностью в отношении клеточных линий HeLa (карцинома шейки матки), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы), DU145 (рак простаты) и HT29 (аденокарцинома толстого кишечника) [7]. ФКК и некоторые феназино-вые производные ингибируют рост клеток меланомы линий SK-MEL-2 и B-16 [8, 9]. Исследована цито-токсичность пиоцианина в отношении клеток глиомы: при концентрации 200 мкг/мл гибель клеток этой культуры составляет 66,34% [10]. Противоопухолевые свойства феназиновых соединений как альтернативы современным медицинским препаратам активно исследуются зарубежными учеными в таких странах, как Китай, Япония, США, Великобритания [8, 11, 12]. Работы в этом направлении ведутся также в Республике Беларусь, на кафедре генетики биологического факультета Белорусского государственного университета [13].
Механизмы действия феназинов довольно разнообразны и зависят от химической структуры конкретного производного. Однако основным из них, присущим большинству изученных в этом отношении феназинов, является образование активных форм кислорода (АФК) [2]. За счет образования свободных радикалов феназины вызывают окислительный стресс в клетке, что ведет к ее гибели. Влияние активных форм кислорода наиболее выражено в отношении метаболически активных и интенсивно делящихся клеток, что характерно для большинства клеток опухолей. Кроме того, были идентифицированы производные феназина, которые блокируют действие топоизомераз I и II в эукариотических клетках. По-
скольку эти ферменты наиболее активны в клетке во время деления, их ингибирование особенно влияет на интенсивно пролиферирующие опухолевые клетки [1, 14]. Исследование противоопухолевой активности ФКМ продемонстрировало, что преобладающим типом гибели опухолевых клеток, по-видимому, является апоптоз. Это подтверждалось снижением мембранного потенциала митохондрий, повышенной экспрессией Bax, ингибированием антиапоптотиче-ских белков Вс12-семейства, выходом цитохрома C и индукцией каспазы-3 [15]. Все вышесказанное демонстрирует перспективность исследования феназиновых соединений бактериального происхождения как потенциальной субстанции для получения новых противоопухолевых препаратов.
Цель исследования — анализ цитотоксической активности феназиновых соединений, продуцируемых штаммами бактерий P. chlororaphis subsp. aurantiaca, в отношении культуры клеток HeLa и выяснение цитологических и молекулярно-генетических механизмов действия данных соединений.
Материал и методы
В работе были использованы бактерии P. chloro-raphis subsp. aurantiaca штаммов В-162 (дикий тип), а также В-162/255, В-162/15, В-162/55, В-162/2, В-162/17 и В-162/18 (мутантные штаммы) из коллекции кафедры генетики Белорусского государственного университета [16]. В качестве объекта для исследования цитотоксического эффекта феназинов была использована культура клеток линии HeLa (перевиваемая культура аденокарциномы шейки матки человека) из коллекции ГУ «РНПЦ эпидемиологии и микробиологии НАН Республики Беларусь».
Культивирование бактерий осуществляли в предложенной питательной среде для продукции антибиотиков ПСА [17] согласно стандартным протоколам [18]. Выделение и очистку феназиновых соединений проводили путем твердофазной экстракции по методике, предложенной в [19], на колонках фирмы Agilent SampliQ C18 (США), наполненных фенил-силикагелем Agilent (США). Высушивание препаратов осуществляли в роторном вакуумном концентраторе (Martin Christ, Германия). Полученные образцы феназиновых комплексов хранили при температуре —20°C. Определение концентрации феназинов проводили путем спектрофотометрирования при длине волны 369 нм [20] на приборе Cary 60 UV-Vis Agilent Technologies (США).
Клетки линии HeLa культивировали в Cüj-ин-кубаторе Binder (Германия) (5% СО2, 37°C) на вентилируемых стерильных матрасиках объемом 25 мл фирмы Corning (США) в питательной среде DMEM с L-глутамином Lonza (США) с содержанием бычьей фетальной сыворотки (10%) Capricorn scientific (Германия) и смеси антибиотиков и антимикотиков
(10 мкг/мл) Capricorn scientific (Германия). Пересев культур производили при достижении ими плотности 106 кл/мл в стерильных условиях в ламинар-бок-се HERA Safe, Heraeus (Германия) согласно протоколу [21].
Изучение цитотоксической активности феназинов проводили с использованием МТТ-теста согласно протоколу [22, 23]. Приготовление цитологических препаратов культур клеток HeLa происходило с использованием водно-солевого раствора акридинового оранжевого согласно [24].
Анализ изменения уровня экспрессии генов проводили с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Выделение тотальной РНК осуществляли реагентом ExtractRNA компании «Евроген» (Россия) согласно инструкциям производителя. Разработку праймеров осуществляли в программе Primer Blast на базе NCBI. Синтез прай-меров осуществлялся компанией «Праймтех» (Беларусь). Для амплификации гена abcc1 использовали праймеры Fabcc1 (5-AGA AGG AAT GCG CCA AGA CT-3) и Rabcc1 (5-GTC GTG GAT GGC CTT GAA GA-3), гена abcg2 — Fabcg2 (5-GCA CCT ATA ACC AGT CCC AGTA-3) и Rabcg2 (5-CAG ATG GGT TTC CAA GCG TTC-3 ), гена tp53 — Ftp53 (5-GTG GAT GGT GGT ACA GTC AGA-3) и Rtp53 (5-GGA AGG AAA TTT GCG TGT GGA-3 ), гена rps18 — Frps18 (5-CCC TGA AAA GTT CCA GCA TA-3 ) и Rrps18 (5-CAC CAC ATG AGC ATA TCT TCG-3 ).
ПЦР проводили с помощью реактива ArtMix-RT Color компании «АртБиоТех» (Беларусь) согласно инструкции производителя на программируемом ам-плификаторе C1000 Touch Thermal Cycler BIO-RAD (США). Параметры реакции и состав реакционной смеси подбирали согласно рекомендациям производителя. Изменение уровня экспрессии генов рассчитывали по методу [25].
Для визуализации результатов выделения тотальной РНК и проведения ПЦР в реальном времени использовался электрофорез в агарозном геле. Элек-трофоретический анализ проводили согласно стандартным протоколам [24], в качестве реперной ДНК использовали GeneRuler DNA LadderMix Thermo-Scientific (США).
Результаты и обсуждение
В предыдущих исследованиях было показано, что штаммы бактерий P. chlororaphis subsp. aurantiaca синтезируют ФКК и некоторые ее производные в различных соотношениях в зависимости от штамма [19]. В ходе данной работы были получены очищенные препараты феназиновых соединений различных штаммов бактерий для дальнейшего исследования их цитотоксической активности.
В связи с низкой растворимостью феназинов в большинстве полярных растворителей при нор-
Рис. 1. Зависимость лекарственно-индуцируемой гибели (%) клеток линии HeLa от концентрации фенази-нов бактерий Р. еЫогогарЬЬ subsp. аигап^аеа штамма B-162/255/15 при инкубации в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч.
мальном рН, а также высокой токсичностью для эука-риотических клеток ряда полярных растворителей на первом этапе работы была проведена серия предварительных экспериментов для подбора растворителя выделенных феназинов. В качестве растворителей были протестированы диметилсульфоксид (ДМСО), хлороформ, глицерин и этанол 70%. Показано, что ДМСО и хлороформ в объемах, соответствующих концентрации феназинов 100 мкг/мл, являются цитотоксичными для культуры клеток НеЬа. Дополнительно продемонстрирована ограниченная способность ДМСО растворять соединения фена-зинового ряда: при приготовлении раствора с концентрацией 150 мкг/мл образуется осадок, что свидетельствует о перенасыщенности раствора. Глицерин, так же как и ДМСО, ограниченно растворяет феназиновые соединения, а его вязкость затрудняет работу и влияет на воспроизводимость результатов. В отличие от предыдущих растворителей 70%
этиловый спирт продемонстрировал высокую способность растворять феназиновые соединения. Также было установлено, что используемые объемы 70% этанола (концентрация в экспериментальной лунке составляла не более 10%) не являлись токсичными для исследуемой культуры клеток в отличие от исследованных в этом отношении ДМСО и хлороформа. Исходя из полученных данных, в качестве растворителя для феназиновых комплексов был выбран этанол 70%. Можно было полагать, что зарегистрированная в ходе последующих экспериментов гибель опухолевых клеток является преимущественно следствием действия феназиновых соединений.
Для первичной оценки эффективных концентраций исследуемых соединений в серии экспериментов был использован препаративный комплекс феназинов, выделенных из одного из наиболее продуктивных штаммов — В-162/255/15. Исследуемые концентрации феназинов находились в диапазоне от 10 мкг/мл до 500 мкг/мл с шагом 10 мкг/мл. Инкубацию клеток с феназиновыми комплексами проводили в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч.
Установлено (рис. 1), что процент гибели клеток растет при увеличении концентрации фенази-нов от 10 до 50 мкг/мл при максимальном времени инкубации (72 ч). После достижения концентрации в 50 мкг/мл дальнейшее ее увеличение слабо меняет процент гибели клеток, который колеблется в пределах 80—95%. Максимальный процент гибели клеток регистрировался при концентрации в 100 мкг/мл. При инкубации в течение 24 ч процент гибели клеток не превышал 80% при максимальной исследуемой концентрации. Исходя из полученных результатов, в качестве тестируемой цитотоксической концентрацией феназинов для дальнейших экспериментов была выбрана концентрация 100 мкг/мл, LD50 составляет 10 мкг/мл. Микроскопический анализ подтверждает массовую гибель клеток культуры после обработки феназинами (рис. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/ medialibrary/ffles/Mol_genetika_2023_04_06_add.zip).
Полученные результаты соотносятся с литературными данными. Так, другими исследователями было показано, что феназиновые производные вызывают 80% гибель клеток в культуры линии Caco-2 при концентрации 69 мкг/мл в течение 72 ч [26]. 2,3,7-заме-щенные феназиновые производные, эффективные против клеток линии Mia PaCa-2, имеют значения LD50 от 20 до 75 мкг/мл. Одновременно с этим гем-зар — одобренный препарат для лечения онкологических заболеваний, содержащий в качестве активного компонента гемцитабин, приводит к 50% гибели культуры при концентрациях, превышающих 200 мкг/мл [12]. Это демонстрирует перспективность использования феназиновых производных, продуцируемых микроорганизмами, в том числе P. chloro-raphis subsp. aurantiaca, в качестве основы для разработки цитотоксических препаратов.
Рис. 3. Зависимость лекарственно-индуцируемой гибели клеток линии HeLa от штамма P. chlororaphis subsp. aurantiaca и времени инкубации.
На следующем этапе работы была проведена серия экспериментов по изучению цитотоксических свойств феназинов других штаммов P. chlororaphis subsp. aurantiaca в отношении клеток линии HeLa. Тестируемая концентрация феназиновых комплексов составляла 300 мкг/мл. Выбранное значение концентрации обусловлено тем, что в ранее проведенных в нашей лаборатории экспериментах было показано, что штамм В-162/255/15 обладает одним из самых высоких уровней антибиотической активности в отношении микроорганизмов и грибов родов Aspergillus, Trychophyton и Acremonium [27]. В связи с этим предполагалось, что действующие концентрации феназино-вых комплексов других штаммов в отношении эука-риотических клеток могут оказаться выше. Время инкубации — 24 ч, 48 ч и 72 ч. Показано, что феназины всех штаммов в концентрации 300 мкг/мл индуцируют гибель культуры клеток HeLa 70—80% (рис. 3). При этом зависимость процента гибели клеток от времени инкубации прослеживается не четко, что, вероятно, связано с тем, что при 300 мкг/мл достигается гибель, приближенная к максимально возможной вне зависимости от времени инкубации.
Полученные цитологические препараты отдельных клеток культуры HeLa после обработки фенази-новыми соединениями штаммов P. chlororaphis subsp. aurantiaca демонстрируют цитологические признаки индукции апоптоза. Так, было зарегистрировано образование апоптотических телец (рис. 4, см. https:// mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_geneti-ka_2023_04_07_add.zip).
Одним из ключевых белков, ответственных за инициацию апоптотической гибели малигнизиро-ванных клеток и осуществляющих таким образом защиту организма, является Р53. Белок P53 является транскрипционным фактором, который при наличии
геномных повреждений запускает экспрессию генов систем репарации или индукции апоптоза [28]. Активация соответствующего гена в культуре HeLa после обработки феназинами могла бы объяснить наблюдаемые цитологические эффекты. Для оценки уровня экспрессии гена tp53 была проведена ПЦР в реальном времени. В качестве контрольного гена был выбран ген домашнего хозяйства rps18, кодирующий рибосомный белок S18, входящий в состав малой (40S) субъединицы рибосомы. Для проведения анализа было осуществлено выделение тотальной РНК из образцов культур клеток HeLa, обработанных и не обработанных соединениями феназиново-го ряда штаммов B-162 и B-162/255/15 в концентрации 300 мкг/мл (72 ч). Примечательно, что в тотальной РНК из клеток, обработанных феназинами, отсутствуют бэнды рРНК, в то время как в контрольных образцах они имеются (рис. 5). Такая закономерность проявлялась во всех повторностях эксперимента. Это может указывать на потенциально возможный дополнительный механизм действия феназинов бактерий P. chlororaphis subsp. aurantiaca, заключающийся в подавлении синтеза рРНК в культуре клеток HeLa.
Установлено, что обработка культуры клеток HeLa феназиновыми соединениями бактерий P. chlororaphis subsp. aurantiaca приводит к увеличению экспрессии в них гена tp53 почти в 13 раз. Одновременно с этим в контрольных образцах уровень экспрессии tp53 был крайне низким или экспрессия вовсе не регистрировалась. Это согласуется с ранее полученными данными [29] о том, что во многих малигнизиро-ванных линиях уровень экспрессии данного ключевого гена является крайне низким, что, вероятно, и является одной из причин малигнизации. Таким образом, можно полагать, что соединения феназиново-го ряда способны индуцировать апоптотическую ги-
бель клеток линии HeLa, в том числе путем активации работы супрессора опухолей Р53.
На следующем этапе работы была проведена оценка уровня экспрессии генов ABC-транспортеров (abcc1, abcg2). Их продуктами являются белки MRP1 (от англ. multidrug resistance protein), или ABCC1, и BCRP (от англ. breast cancer resistance protein), или ABCG2. Известно, что продукты этих генов участвуют в формировании множественной лекарственной резистентности клеток опухолей, способствуя выведению лекарственных соединений из клеток [30]. Активация этих генов при обработке культуры HeLa феназинами может являться маркером того, что у опухолевых клеток достаточно быстро может сформироваться резистентность к феназиновым соединениям. Однако нами было зарегистрировано незначительное снижение уровня экспрессии генов ABC-транспортеров (abcc1 и abcg2). На основании полученных данных можно полагать, что ABC-транспортеры не используются клетками линии HeLa для экскреции феназинов.
Заключение
На основании полученных экспериментальных данных можно утверждать, что феназиновые соединения P. chlororaphis 8иЪ8р. aurantiaca проявляют выраженную цитотоксичность в отношении малигнизи-рованных клеточных линий НеЬа. Все исследуемые штаммы вызывают 70—80% гибель культуры при концентрации феназиновых соединений 300 мкг/мл. Преимущественным типом гибели клеток является апоптоз. Подтверждением этому служат цитологические препараты, на которых обнаружены клетки НеЬа с признаками апоптотической гибели после обработки феназиновыми соединениями. Более того, зафиксировано увеличение экспрессии гена tp53 в 13 раз, продукт которого является активатором группы генов, ответственных за остановку клеточного цикла, репликации ДНК и запуск апоптоза.
Финансирование работы
Данное исследование в финансовом отношении было поддержано Государственной программой на-
Рис. 5. Электрофореграмма тотальной РНК, выделенной из клеток линии HeLa.
1—3 — контроль; 4—5 — после 72 ч инкубации с феназинами штамма В-162; 6 — после инкубации с феназинами штамма В-162/255/15 (300 мкг/мл, 72 ч); а — зона рРНК; б — зона малых РНК.
учных исследований Республики Беларусь (проект №20211293).
Соблюдение этических стандартов
Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
Pierson LS, Pierson EA. Metabolism and function of phenazines in bacteria: impacts on the behavior of bacteria in the environment and biotechno-logical processes. Appl Microbiol Biotechnol. 2010;86(6):1659-1670. https://doi.org/10.1007/s00253-010-2509-3
Mavrodi DV, Blankenfeldt W, Thomashow LS. Phenazine compounds in fluorescent Pseudomonas spp. biosynthesis and regulation. Annu Rev Phyto-pathol. 2006;44:417-445.
https://doi.org/10.1146/annurev.phyto.44.013106.145710
Laursen JB, Nielsen J. Phenazine natural products: biosynthesis, synthetic
analogues, and biological activity. Chem Rev. 2004;104(3):1663-1685.
https://doi.org/10.1021/cr020473j
Guttenberger N, Blankenfeldt W, Breinbauer R. Recent developments in the isolation, biological function, biosynthesis, and synthesis of phenazine natural products. Bioorg Med Chem. 2017;25(22):6149-6166. https://doi.org/10.1016/j.bmc.2017.01.002
Mavrodi DV, Peever TL, Mavrodi OV, Parejko JA, Lemanceau RP, Mazuri-er S, et al. Diversity and evolution of the phenazine biosynthesis pathway. ApplEnvir Microbiology. 2010;76(3):866-879. https://doi.org/10.1128/AEM.02009-09
Huigens RW, Brummel BR, Tenneti S, Garrison AT, Xiao T. Pyrazine and phenazine heterocycles: platforms for total synthesis and drug discovery. Molecules. 2022;27(3):1112-1136. https://doi.org/10.3390/molecules27031112
4
5
7. Dasgupta D, Kumar A, Mukhopadhyay B. Isolation of phenazine 1,6-di-car-boxylic acid from Pseudomonas aeruginosa strain HRW.1-S3 and its role in biofilm-mediated crude oil degradation and cytotoxicity against bacterial and cancer cells. Appl Microbiol Biotechnol. 2015;99(20):8653-8665. https://doi.org/10.1007/s00253-015-6707-x
8. Cimmino A, Evidente A, Mathieu V, Andolfi A, Lefranc F, Kornienkod A, Kiss R. Phenazines and cancer. Nat Prod Rep. 2012;29(4):487-501. https://doi.org/10.1039/C2NP00079B
9. Patil S, Paradeshi J, Chaudhari B. Anti-melanoma and UV-B protective effect of microbial pigment produced by marine Pseudomonas aeruginosa GS-33. Nat Prod Res. 2016;30(24):2835-2839. https://doi.org/10.1080/14786419.2016.1154057
10. Vipin C, Ashwini P, Kavya AV, Rekha PD. Overproduction of Pyocyan-in in Pseudomonas aeruginosa by Supplementation of Pathway Precursor Shikimic acid and Evaluation of its Activity. Res Jour of Pharm and Techn. 2017;10(2):533-536.
https://doi.org/10.5958/0974-360X.2017.00106.8
11. Myhren LE, Nygaard G, Gausdal G, Sletta H, Teigen K, Degnes KF, et al. (1,6-Dihydroxyphenazine 5,10-Dioxide) from Streptosporangium sp. Induces Apoptosis Selectively in Myeloid Leukemia Cell Lines and Patient Cells. Mar Drugs. 2013;11(2):332-349. https://doi.org/10.3390/md11020332
12. Moris MA. 2,3-Dialkoxyphenazines as anticancer agents. Tetrahedron Lett. 2015;56(21):2695-2698. https://doi.org/10.1016/j.tetlet.2015.04.003
13. Веремеенко Е.Г. Анализ биологической активности антибиотиков фе-назинового ряда в отношении представителей рода Candida. Женщины-ученые Беларуси и Казахстана: сб. материалов Междунар. на-уч.-практ. конф., Минск, 2018. Мн: РИВШ; 2017:391-394. Ссылка активна на 30.10.23.
Veremeenko EG. Analysis oof The Biological Activity oof Phenazine Antibiotics in Relation to Representatives of The Genus Candida. Women scientists of Belarus and Kazakhstan: collection of materials of the Intern. Scien. and Pract. Conf., Minsk, 2018. Mn: RIHS; 2017:391-394. (In Russ.). Accessed October 30, 2023.
https://elib.bsu.by/handle/123456789/196016
14. Junjie Y, Liu W, Cai J, Wang Y, Li D, Hua H, Cao H. Advances in Phenazines over the Past Decade: Review of Their Pharmacological Activities, Mechanisms of Action, Biosynthetic Pathways and Synthetic Strategies. Mar Drugs. 2021;19(11):610.
https://doi.org/10.3390/md19110610
15. Kennedy RK, Veena V, Naik P.R, Lakshmi P, Krishna R, Sudharani S, Sakthivel N. Phenazine-1-carboxamide (PCN) from Pseudomonas sp. strain PUP6 selectively induced apoptosis in lung (A549) and breast (MDA MB-231) cancer cells by inhibition of antiapoptotic Bcl-2 family proteins. Apoptosis. 2015;20(6):858-868. https://doi.org/10.1007/s10495-015-1118-0
16. Веремеенко Е.Г., Лысак В.В., Максимова Н.П. Получение и характеристика мутантов Pseudomonas aurantiaca, способных к сверхсинтезу феназиновых антибиотиков при культивировании в минимальной среде. Вестник БГУ. Биология. Серия 2. 2010;2:47-53. Ссылка активна на 30.10.23.
Veremeenko EG, Lysak VV, Maksimova NP. Preparation and characterization of Pseudomonas aurantiaca mutants capable of super synthesis of phenazine antibiotics when cultured in a minimal medium. Vestnik BGU. Biologiya. Seriya 2. 2010;2:47-53. (In Russ.). Accessed October 30, 2023. https://elib.bsu.by/handle/123456789/2742
17. Levitch ME. Regulation of aromatic amino acid biosynthesis in phenazine-producing strains. J Bacteriol. 1970;103(1):16-19. https://doi.org/10.1128/jb.103.1.16-19.1970
18. Gallager SR, Wiley EA. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. Wiley-Blackwell; 2008. Accessed October 30, 2023. https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/journal/19483430
19. Shapira MA, Verameyenka KG, Liavonchyk KV, Dobysh AA, Yantsevich AV, Maksimova NP. Novel approach of phenazine derivatives isolation from Pseudomonas culture medium. Process Biochemistry. 2021;111(2):325-331. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2021.11.004
20. Taniguchi M, Lindsey JS. Database of Absorption and Fluorescence Spectra of >300 Common Compounds for use in PhotochemCAD. Photochem Photobiol. 2018;94(2):290-327. https://doi.org/10.1111/php.12860
21. Freshney RJ. Culture of animal cells: A manual oof basic technique and specialized applications. Wiley-Blackwell; 2018. Accessed October 30, 2023. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/book/10.1002/9780470649367
22. Зворыгин И.А. Статистический анализ лабораторных данных. Новости «Вектор-Бест». 2006;39(1):11-25. Ссылка активна на 30.10.23. Zvorygin IA. Statistical analysis of laboratory data. Vector-Best News. 2006; 39(1):11-25. (In Russ.). Accessed October 30, 2023. https://vector-best.ru/publ/nvb.php
23. Черепович В.С. Оптимизация критических параметров МТТ-теста для оценки клеточной и лекарственной цитотокстичности. Медицинский журнал БГМУ. 2006;2:106-108. Ссылка активна на 30.10.23. Cherepovich VS. Optimization of critical parameters of the MTT test to assess cellular and drug cytotoxicity. Medical Journal oof BSMU. 2006;2:106-108. (In Russ.). Accessed October 30, 2023. https://rep.bsmu.by/handle/BSMU/4509
24. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley & Sons, Inc.; 2003:1600. Accessed October 30, 2023. https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/journal/19343647
25. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25(4):402-408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262
26. Pachon OG, Azqueta A, Lavaggi ML, Lopez de Cerain A, Creppy E, Collins A, et al. Antitumoral Effect of Phenazine N5, N10-Dioxide Derivatives on Caco-2 Cells. Chem Res Toxicol 2008;21(8):1578-1585. https://doi.org/10.1021/tx800032k
27. Савонь Е.Л., Леончик Е.В., Пигуль П.Г., Веремеенко Е.Г., Максимова Н.П. Антифунгальная активность очищенных комплексов феназиновых соединений. Материалы межд. научн.-практич. конф. «Биотехнологии микроорганизмов». Минск. 2019:386-387. Ссылка активна на 30.10.23. Savon EL, Leonchik EV, Pigul PG, Veremeenko EG, Maksimova NP. An-tifungal activity of purified complexes of phenazine compounds. Materials of Intern. Scien. Res.-practical conf. "Biotechnologies of microorganisms". Minsk. 2019:386-387. (In Russ.). https://elib.bsu.by/handle/123456789/251769
28. Mantovani F, Collavin L, Del Sal G. Mutant p53 as a guardian of the cancer cell. Cel Death Differ. 2019;26(2):199-212. https://doi.org/10.1038/s41418-018-0246-9
29. Correa I, Cerbon MA, Salazar A, Solano JD, García-Carranca A, Quintero A. Differential p53 protein expression level in human cancer-derived cell lines after estradiol treatment. Arch Med Res. 2002;33(5):455-449. https://doi.org/10.1016/s0188-4409(02)00386-7
30. Ставровская AA, Рыбалкина Е.Ю. Новое о молекулярных механизмах регуляции множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Биохимия. 2018;83(7):963-971. Ссылка активна на 30.10.23. Stavrovskaya AA, Rybalkina EYu. New on The Molecular Mechanisms of Regulation Of Multidrug Resistance Of Tumor Cells. Biochemistry. 2018;83(7):963-971. (In Russ.). Accessed October 30, 2023. https://biochemistrymoscow.com/ru/archive/2018/83-07-0963
Поступила 30.10.2023 Received 30.10.2023 Принята к печати 13.11.2023 Accepted 13.11.2023
