CC BY
4
Научная статья
УДК 619:612.017.1:616-006.446:636.22/28 doi: 10.47737/2307-2873_2023_43_68
ЦИТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ В ОЦЕНКЕ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ КОРОВ К ЛЕЙКОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
©2023. Евгений Алексеевич Вишневский1, Василий Сергеевич Власенко2Н, Евгений Степанович Борисов3, Татьяна Сергеевна Дудоладова4
1,2,3,4Омский аграрный научный центр, Омск, Россия 2ws-76@Пstm
Аннотация. По результатам диагностических исследований крупного рогатого скота из неблагополучного по лейкозу хозяйства в реакции иммунной диффузии (РИД) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) из 20 голов сформировали 3 группы: нереагирующие в РИД и ПЦР (п=3), реагирующие в РИД и ПЦР (п=10) и носители провирусной ДНК вируса лейкоза (п=7). У всех животных цитохимическим методом произвели оценку ферментной активности миелоперокси-дазы (МПО) и содержания катионных белков (КБ) нейтрофилов крови, учитывая процент клеток с высокой, средней и низкой активностью гранул с последующим подсчётом суммарного показателя - среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Установлено, что у коров, имеющих положительную реакцию в РИД и ПЦР, регистрировали наименьшее число нейтрофилов с высокой активностью гранул с КБ и МПО и, как следствие, низкий СЦК КБ и СЦК МПО, соответственно 0,81 и 1,51. У ПЦР-позитивных, напротив, в мазках крови обнаруживали преимущественно высокоактивные клетки, при этом у некоторых индивидумов их количество было выше, чем у интактных животных. Обработка цитохимических показателей, с помощью дискретно-динамического анализа позволила выявить значимые сочетания параметров, с помощью которых можно провести дифференциацию коров с нарушением иммунной функции нейтрофилов. В частности, среди животных, реагирующих одновременно в РИД и ПЦР, функциональная недостаточность нейтрофилов установлена во всех случаях, а у реагирующих только в ПЦР, - только у 71,4% голов крупного рогатого скота. Выявленную дисфункцию у 66,66% нереагирующих животных можно рассматривать как предрасположенность к лейкозной инфекции.
Ключевые слова: лейкоз, крупный рогатый скот, нейтрофилы, миелопероксидаза, катион-ные белки, дискретно-динамический анализ
Введение. Одной из наиболее экономически значимых инфекционных болезней в молочном скотоводстве многих государств мира является лейкоз крупного рогатого скота [1-4], который, как свидетельствуют многочисленные исследования разных ученых, сопровождается сбоями в работе иммунной системы, в том числе нарушениями деятельности нейтро-филов, первыми мигрирующими в очаг инфекции и являющимися важнейшим компонентом врождённой иммунной защиты [5-8].
Для выполнения эффекторных функций нейтрофилы в значительной степени снабжены арсеналом токсических антимикробных средств (антимикробные пептиды и литиче-ские ферменты), хранящихся в разных типах гранул, которые имеют различия, в зависимости от содержания в них белка и синтеза во время гранулопоэза [9]. Основные врождённые функции нейтрофилов включают деграну-ляцию, фагоцитоз и образование внеклеточной ловушки нейтрофильных клеток, главными
компонентами которой являются бактерицидные белки - миелопероксидаза, эластаза и де-фензины, именуемые также катионными белками [10].
Дефекты в работе антимикробных систем нейтрофилов приводят к резкому снижению резистентности организма. В содержании микробицидных компонентов нейтрофилов крови у молодняка крупного рогатого скота разного возраста при лейкозной инфекции характерны существенные различия, характеризующиеся их активизацией на начальном этапе заражения и дальнейшим подавлением при прогрессировании болезни [11]. Учитывая неодинаковую реакцию организма животных, у которых в период от момента инфицирования до появления противовирусных антител происходит выраженная активизация бактерицидных систем нейтрофилов, а с развитием болезни, напротив, угасание их деятельности, весьма полезным инструментом для прогнозирования предрасположенности к заболеванию, а также дифференциации инфицированных от здоровых животных может служить математическое моделирование.
В связи с этим целью настоящей работы стало исследование показателей ферментной (миелопероксидаза) и неферментной (катион-ные белки) активности крупного рогатого скота из неблагополучного по лейкозу стада с помощью дискретно-динамического анализа.
Методика. Выявление носителей вируса лейкоза осуществляли с помощью реакции им-мунодиффузии (РИД), обнаружение провирус-ной ДНК вируса лейкоза - полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием коммерческих наборов российского производства (ФКП «Курская биофабрика - фирма «Биок»; ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребна-дзора) согласно инструкции по применению комплектов реагентов.
Амплификацию осуществляли на анали-заторе-термоциклере для детекции нуклеиновых кислот методом ПЦР в реальном времени 1Сус1ег iQ5 (BioRad, США).
Объектом исследования являлся клинически здоровый крупный рогатый скот чёрно-
пёстрой породы в возрасте от 3-х до 5-и лет, массой от 510 до 530 кг, принадлежащий сельскохозяйственному формированию Омской области с широким распространением лейкоз-ной инфекции в стаде (более 50% вирусоноси-телей). На первом этапе исследований было отобрано 20 голов, из числа которых 10 реагировали в РИД, остальные 10 были РИД-негативными. По результатам последующего тестирования крови с помощью ПЦР было установлено 3 категории крупного рогатого скота с разным статусом: реагирующие одновременно в РИД и ПЦР (п=10); реагирующие только в ПЦР (п=7) и нереагирующие в РИД и ПЦР (п=3).
У всех животных оценено функциональное состояние бактерицидных систем нейтро-филов посредством цитохимического анализа катионных белков (КБ) и миелопероксидазы (МПО) в нейтрофилах крови: пробами с бром-феноловым синим по М.Г. Шубичу [12] и с бензидином по Грэхем-Кноллю [13]. При микроскопии мазков учитывали процент фагоцитов по степени активности гранул: малоактивные (единичные гранулы); среднеактивные (не более 50% цитоплазмы заполнено гранулами) и высокоактивные (от 50 до 100% площади цитоплазмы занята гранулами). Итоговый результат выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК) в соответствии со стандартной методикой.
Обработку цифрового материала проводили с помощью дискретно-динамического анализа, автоматизированного разработанной нами компьютерной программой [14].
Результаты. Анализ цитохимических параметров показал, что у коров, реагирующих на оба диагностических теста, число фагоцитов с низкой активностью катионных белков в гранулах варьировало от 5 до 21%, со средней - от 0 до 13%, с высокой - от 9 до 25%, а общий показатель, выраженный в виде СЦК, находился в пределах от 0,47 до 1,08, что в среднем составило 0,81. Параметры ферментной деятельности миелопероксидазы были следующими: клетки с низкой плотностью гранул - от
3 до 11%, средней - от 7 до 17%, высокой от 21 до 48%, СЦК - от 1,04 до 1,90 (в среднем 1,51).
У коров, нереагирующих в РИД и ПЦР, отмечено преобладание клеток с высокой активностью КБ и МПО в гранулах (от 46% до 70%) и, как следствие, у них был значительно выше цитохимический коэффициент. Так, СЦК КБ в среднем составил 1,98, а СЦК МПО - 2,03.
Аналогичная закономерность была характерна и для животных, реагирующих только в ПЦР. У отдельных индивидуумов количество нейтрофилов с высокой активностью
гранул было даже выше (от 71% и выше), чем у РИД-, ПЦР-негативных коров. Высоких значений также достигал СЦК КБ и МПО - 2,09 и 2,03. Полученные результаты могут свидетельствовать о начальной стадии заболевания, которая, как показали наши предыдущие исследования, сопровождается гиперреактивностью антимикробных систем фагоцитов [11].
Результаты оценки функционирования антимикробных компонентов, выраженных в виде СЦК, представлены на рисунке 1.
2-5 Т 2.31
миелопероксидаза
Ш РИД , ПЦР- Ш РИД+, ПЦР+ = РИД-, ПЦР+
Рис 1. Средние цитохимические коэффициенты у коров с разным статусом по результатам диагностических исследований в РИД и ПЦР Fig. 1. Average cytochemical coefficients in cows with different status according to the results of diagnostic
studies in IDR and PCR
Таким образом, у коров, являющихся одновременными носителями провируса и вируса ВЛКРС, по сравнению с животными, нереагиру-ющими или реагирующими только в ПЦР, отмечено угнетение в нейтрофилах ферментной активности МПО, а также значительное снижение содержания КБ.
На следующем этапе исследований цитохимические показатели (процент мало-, средне-, высокоактивных нейтрофилов и СЦК) подвергли статистической обработке с помощью дискретно-динамического анализа, сущность которого состояла в сортировке по одному из параметров, взятого в качестве базисного, на 3 группы (с минимальными, средними и максимальными значениями), затем - в расчёте сред-
них значений остальных (вариабельных) параметров в группах с минимальными и максимальными величинами и изучении достоверности их различий. При р<0,05 между средними вариабельного параметра в этих группах констатировали наличие взаимосвязи между данными базисного и вариабельного параметров. При этом каждый изучаемый цитохимический параметр брали в качестве базисного. В общей сложности нам удалось выявить из 56 возможных сочетаний 22 достоверных взаимосвязи, из которых наибольшей долей участия обладали КБ-, МПО-высокоактивные клетки, а также СЦК КБ и МПО (табл. 1). Например, СЦК КБ в качестве базисного параметра, имеющего пределы колебаний от 0,47 до 0,88, взаимосвязан с вариабельным вы-
сокоактивным КБ, который варьирует в преде- нии иммунной функции нейтрофилов, соответ-лах от 4 до 22%. Установленным величинам ствовали индивидуальные значения 6-и коров, этого сочетания, свидетельствующих о наруше- одновременно реагирующих в РИД и ПЦР.
Таблица 1
Интервалы значений значимых сочетаний базисного и вариабельного параметров, характеризующих нарушение иммунной функции нейтрофильных гранулоцитов
№ Сочетание: базис Интервалы значений Количество животных с функцио-
п/п (вариабельный параметр) базис вариабельный нальным нарушением нейтрофилов
1 СЦК КБ (в/а КБ) 4-22
2 СЦК КБ (СЦК МПО) 1,04-1,90
3 СЦК КБ (с/а КБ) 0,47-0,88 2-12
4 СЦК КБ (в/а МПО) 21-55
5 СЦК КБ (м/а КБ) 5-21
6 в/а КБ (СЦК КБ) 0,47-0,91
7 в/а КБ (СЦК МПО) 4-19 1,04-1,90
8 в/а КБ (в/а МПО) 21-55
9 в/а КБ (м/а КБ) 5-21
10 с/а КБ (СЦК КБ) 0,47-2,35 П=17:
11 с/а КБ (в/а КБ) 0-6 9-63 РИД+, ПЦР+ (П=10);
12 с/а КБ (СЦК МПО) 1,04-2,14 РИД-, ПЦР+ (П=5);
13 СЦК МПО (СЦК КБ) 0,47-1,07 РИД-, ПЦР- (П=2)
14 СЦК МПО (в/а МПО) 1,04-1,65 21-45
15 СЦК МПО (в/а КБ) 9-22
16 СЦК МПО (с/а КБ) 2-10
17 в/а МПО (СЦК МПО) 1,04-1,76
18 в/а МПО (СЦК КБ) 21-44 0,47-2,37
19 в/а МПО (в/а КБ) 9-67
20 в/а МПО (с/а КБ) 2-13
21 с/а МПО (м/а КБ) 16-24 10-21
22 с/а МПО (в/а МПО) 21-49
Примечание: в/а - высокоактивные; с/а - среднеактивные; м/а - малоактивные.
Проанализировав аналогичным способом остальные (21) значимы сочетания параметров таблицы 1, нами было установлено функциональное нарушение нейтрофилов у 17 голов крупного рогатого скота, из которых 10 (100%) являлись носителями вируса и прови-русной ДНК, 5 (71,4%) - реагировали только в ПЦР и 2 (66,66%) были интактными. Следовательно, статистическая обработка цитохимических показателей с помощью дискретно-динамического анализа позволяет с высокой точностью дифференцировать животных с функциональной напряженностью бактерицидной активности нейтрофилов крови.
Выводы. На основании цитохимических исследований установлено, что в крови ин-тактного крупного рогатого скота от 46 до 70% нейтрофилов имеют высокую активность КБ и МПО в гранулах. У животных, реагирующих в
РИД и ПЦР, наблюдается ослабление деятельности ферментной и неферментной систем нейтрофилов, сопровождающееся снижением числа высокоактивных клеток с КБ до 9% и с МПО до 21%, тогда как у некоторых коров, являющихся только носителями провирусной ДНК вируса лейкоза, их количество поднималось выше 71%.
Дискретно-динамический анализ цитохимических показателей коров неблагополучного по лейкозу стада выявил 22 значимых сочетания, характеризующих нарушение функционального состояния бактерицидных систем нейтрофилов. Функциональная недостаточность нейтрофилов выявлена у 100% инфицированных вирусом лейкоза, 71,4% - носители провирусной ДНК и 66,66% - интактные коровы.
Список источников
1. Гулюкин М.И., Гулюкин А.М., Донченко А.С., Донченко Н.А. и др. Анализ эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в Сибирском федеральном округе // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2021. Т.51. №4. С. 67-75.
2. Донник И.М., Гулюкин М.И., Бусол В.А. и др. Лейкоз крупного рогатого скота - диагностика, оздоровление, антро-позоонозный потенциал (история вопроса) (обзор) // Сельскохозяйственная биология. 2021. Т. 56. №2. С. 230-244.
3. Bartlett P.C., Ruggiero V.J., Hutchinson H.C., Droscha C.J. et al. Current developments in the epidemiology and control of enzootic bovine leukosis as caused by bovine leukemia virus // Pathogens. 2020. Vol. 9(12). P. 1058.
4. John E.E., Keefe G., Cameron M., Stryhn H., McClure J.T. Development and implementation of a risk assessment and management program for enzootic bovine leukosis in Atlantic Canada // J. Dairy Sci. 2020. Vol. 103(9). P. 8398-8406.
5. Иванов А.И., Власенко В.С. Применение теста с нитросиним тетразолием для выявления животных с повышенной чувствительностью к лейкозной инфекции // Достижения науки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 4. С. 61-62.
6. Azedo M.R., Massoco C.O., Blagitz M.G., Souza F.N. et al. Metabolismo oxidativo de leucócitos em animais infectados pelo virus da leucemia bovina // Brazilian Journal of Veterinary Research. 2012. Vol. 49. P. 93-101.
7. Ferronatto J.A., Blagitz M.G., Souza F.N., Batista C.F. et al. Avaliaja of uncional de neutrófilos sanguíneos em vacas leiteiras infectadas pelo virus da leucemia bovina // In: XII Congresso Brasileiro de Buiatria (Foz do Iguaju, Brazil). Revista Académica Ciencia Animal. 2017. Vol. 15(2). P. 669-670.
8. Lv G., Wang H., Wang J., Lian S., Wu R. Effect of BLV infection on the immune function of polymorphonuclear neutrophil in dairy cows // Front Vet Sci. 2021. Vol. 8. Article number 737608.
9. Rawat K., Syeda S., Shrivastava A. Neutrophil-derived granule cargoes: paving the way for tumor growth and progression // Cancer Metastasis Rev. 2021. Vol. 40(1). P. 221-244.
10. Kolaczkowska E., Kubes P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation // Nature Reviews Immunology. 2013. Vol. 13(3). P. 159-175.
11. Власенко В.С., Вишневский Е.А., Дудоладова Т.С. Катионные белки лизосом и миелопероксидаза в нейтрофилах молодняка крупного рогатого скота разного возраста при лейкозной инфекции // Достижения науки и техники АПК. 2021. Т.35. №5. С. 65-69.
12. Шубич М.Г. Выявление катионного белка в цитоплазме лейкоцитов с помощью бромфенолового синего // Цитология. 1974. №10. С. 1321-1322.
13. Hrycek A. Functional characterization of peripheral blood neutrophils in patients with primary hypothyroidism // Folia Biologica (Praha). 1993. Vol. 39(6). S. 304-310.
14. Борисов Е.С., Власенко В.С. Оценка иммунного статуса при бактериальных и вирусных инфекциях // Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2021660320 от 24.06.2021.
CYTOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF BLOOD NEUTROPHILS IN ASSESSING OF COWS PREDISPOSED TO LEUKEMIC INFECTION
©2023 Evgeny A. Vishnevsky1, Vasily S. Vlasenko2H, Evgeny S. Borisov3, Tatyana S. Dudoladova4
u'3'4Omsk Agrarian Scientific Center, Omsk, Russia [email protected]
Abstract. Based on the results of cattle diagnostic studies from unfavorable for leukemia farm in the immune diffusion reaction (IDR) and polymerase chain reaction (PCR), 3 groups of 20 heads of cattle were formed: unresponsive in IDR and PCR (n=3), responsive in IDR and PCR (n=10), and carriers of proviral DNA of the leukemia virus (n=7). In all animals, the enzyme activity of myeloperoxidase (MPO) and the content of cationic proteins (CP) of blood neutrophils were assessed by the cytochemical method, taking into account the percentage of cells with high, medium and low granule activity, followed by calculation of the total indicator - the average cytochemical coefficient (ACC). It was found out that cows that were positive in IDR and PCR had the lowest number of neutrophils with high granule activity with CP and MPO and, as a consequence, low ACC CP and ACC MPO, 0.81 and 1.51, respectively. In contrast, in PCR-positive animals, predominantly highly active cells were found in blood smears, and in some individuals their number was higher than in intact animals. The processing of cytochemical parameters using discrete-dynamic analysis made it possible to identify significant combinations of parameters that can be used to differentiate cows with impaired immune function of neutrophils. In particular, among animals reacting simultaneously in IDR and PCR, functional deficiency of neutrophils was found in all cases, and in those reacting only in PCR only in 71.4% of cattle. Identified dysfunction in 66.66% of non-responding animals can be considered as a predisposition to leukemic infection.
Key words: leukemia, cattle, neutrophils, myeloperoxidase, cationic proteins, discrete-dynamic analysis
Refere^es
1. Gulyukin M.I., Gulyukin A.M., Donchenko A.S., Donchenko N.A. i dr. Analiz epizooticheskojsituacii po lejkozukrupno-gorogatogoskota v Sibirskomfederal'nomokruge (Analysis of the epizootic situation of cattle leukemia in the Siberian federal district), Sibirskijvestniksel'-skohozyajstvennojnauki. 2021. T.51. No. 4. S. 67-75.
2. Donnik I.M., Gulyukin M.I., Busol V.A. i dr. Lejkozkrupnogorogatogoskota - diagnostika, ozdorovlenie, antropozoon-oznyjpotencial (istoriyavoprosa) (obzor) (Bovine leukemia virus infection - diagnostics, eradication, and anthropozoonotic potential (background) (review)), Sel'skohozyajstvennayabiologiya. 2021. T. 56. No. 2. S. 230-244.
3. Bartlett P.C., Ruggiero V.J., Hutchinson H.C., Droscha C.J. et al. Current developments in the epidemiology and control of enzootic bovine leukosis as caused by bovine leukemia virus // Pathogens. 2020. Vol. 9(12). P. 1058.
4. John E.E., Keefe G., Cameron M., Stryhn H., McClure J.T. Development and implementation of a risk assessment and management program for enzootic bovine leukosis in Atlantic Canada // J. Dairy Sci. 2020. Vol. 103(9). P. 8398-8406.
5. Ivanov A.I., Vlasenko V.S. Primenenietesta s nitrosinimtetrazoliemdlyavyyavleniyazhivotnyh s povyshennojchu-vstvitel'nost'yu k lejkoznojinfekcii (Application of test with nitroblue tetrazolium for detection of animals with hypersuscepti-bility to the leukemic infection), Dostizheniyanaukiitekhniki APK. 2015. T. 29. No. 4. S. 61-62.
6. Azedo M.R., Massoco C.O., Blagitz M.G., Souza F.N. et al. Metabolismooxidativo de leucocitosemanimaisinfectados-pelovlrus da leucemia bovina // Brazilian Journal of Veterinary Research. 2012. Vol. 49. P. 93-101.
7. Ferronatto J.A., Blagitz M.G., Souza F.N., Batista C.F. et al. Avaliaja of uncional de neutrofilossangulneosemvacaslei-teirasinfectadaspelovlrus da leucemia bovina // In: XII Congresso Brasileiro de Buiatria (Foz do Iguaju, Brazil). Re-vistaAcademicaCiencia Animal. 2017. Vol. 15(2). P. 669-670.
8. Lv G., Wang H., Wang J., Lian S., Wu R. Effect of BLV infection on the immune function of polymorphonuclear neutrophil in dairy cows // Front Vet Sci. 2021. Vol. 8. Article number 737608.
9. Rawat K., Syeda S., Shrivastava A. Neutrophil-derived granule cargoes: paving the way for tumor growth and progression // Cancer Metastasis Rev. 2021. Vol. 40(1). P. 221-244.
10. Kolaczkowska E., Kubes P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation // Nature Reviews Immunology. 2013. Vol. 13(3). P. 159-175.
11. Vlasenko V.S., Vishnevskij E.A., Dudoladova T.S. Kationnyebelkilizosomimieloperoksidaza v nejtrofilahmolod-nyakakrupnogorogatogoskotaraznogovozrastaprilejkoznojinfekcii (Cationic proteins of lysosomes and myeloperoxidase in neutrophils of young cattle of different ages infected with leukemia), Dostizheniyanaukiitekhniki APK. 2021. T.35. No. 5. S. 65-69.
12. Shubich M.G. Vyyavleniekationnogobelka v citoplazmelejkocitov s pomoshch'yubromfenolovogosinego (Detection of a cationic protein in the cytoplasm of leukocytes using bromophenol blue), Citologiya. 1974. No. 10. S. 1321-1322.
13. Hrycek A. Functional characterization of peripheral blood neutrophils in patients with primary hypothyroidism // Folia Biologica (Praha). 1993. Vol. 39(6). S. 304-310.
14. Borisov E.S., Vlasenko V.S. Ocenkaimmunnogostatusapribakterial'nyhivirusnyhinfekciyah (Assessment of the immune status in bacterial and viral infections), Svidetel'stvo o gosudarstvennojregistraciiprogrammydlya EVM № 2021660320 ot 24.06.2021.
Сведения об авторах
Е.А. Вишневский1- канд. ветеринар. наук; В.С. Власенко23- д-р биол. наук, доцент; Е.С. Борисов3 - специалист; Т.С. Дудоладова4-канд. биол. наук.
1,2,з,4Омский аграрный научный центр, Королёва пр., 26, Омск, Россия, 644012
'kirito [email protected]
Information about the authors
E.A. Vishnevsky-Cand. Vet. Sci;
V.S. Vlasenko- Dr. Biol. Sci., Assistant Professor;
E.S. Borisov - Expert;
T.S. Dudoladova- Cand.Biol. Sci.
1,2,3,4Omsk Agrarian Scientific Center, 26, Koroleva Prospekt St., Omsk, Russia, 644012
1kirito [email protected]
Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest: the authors declare that they have no conflicts of interest.
Статья поступила в редакцию 15.05.2023; одобрена после рецензирования 29.05.2023; принята к публикации 04.09.2023 The article was submitted 15.05.2023; approved after reviewing 29.05.2023; acceptedfor publication 04.09.2023
