ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АНТИМИКРОБНЫХ СИСТЕМ НЕЙТРОФИЛОВ У МОРСКИХ СВИНОК, ИНФИЦИРОВАННЫХ ВЛКРС

Ксения Алексеевна Бармина; Евгений Алексеевич Вишневский; Василий Сергеевич Власенко

ЗООТЕХНИЯ И ВЕТЕРИНАРИЯ

Научная статья

УДК: 619: 578.76:578.828

doi: 10.47737/2307-2873_2024_45_59

ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АНТИМИКРОБНЫХ СИСТЕМ НЕЙТРОФИЛОВ У МОРСКИХ СВИНОК, ИНФИЦИРОВАННЫХ ВЛКРС

1,2,3Омский аграрный научный центр, Омск, Россия [email protected]

Аннотация. С целью изучения особенностей функционирования кислород-зависимой и кислород-независимой бактерицидных систем нейтрофилов при инфекционном процессе у морских свинок, вызванном вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), был проведен эксперимент на 10 лабораторных животных. Особи опытной группы (п=5) были инфицированы внутрибрюшинноклеточной взвесью лимфоцитов, выделенных от больной лейкозом коровы, остальные (п=5) служили в качестве контроля. Отбор проб крови для оценки функциональной активности нейтрофилов, а также диагностического исследования в реакции непрямой иммунофлюоресценции производили на 14-е, 30-е, 60-е, 90-е, 120-е и 180-е сутки после инфицирования. Установлено, что у морских свинок, инфицированных ВЛКРС, происходит закономерное усиление ферментной активности миелопероксидазы (МПО) и увеличение концентрации катионных белков (КБ) нейтрофилов, наблюдаемое нами с 14-х по 90-е сутки после инокуляции вируссодержащей взвеси, на что указывал подъем среднего цитохимического коэффициента (СЦК) МПО в 1,18-2 раза и СЦК КБ - в 1,16-1,87 раза относительно контрольной группы. К 180-м суткам от начала эксперимента, напротив, наблюдалось выраженное подавление активности антимикробных систем нейтрофилов. Учитывая схожий характер изменений, выявленный нами у морских свинок в динамике исследования бактерицидных систем нейтрофилов, с ранее установленной трансформацией цитохимических параметров при лейкозном процессе у крупного рогатого скота, можно прийти к заключению о пригодности этой лабораторной модели для изучения патогенеза ВЛКРС.

Ключевые слова: морская свинка, ВЛКРС, нейтрофилы, катионные белки, миелопероксидаза

Введение. Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) представляет собой ретровирус с онкогенным потенциалом и является этиологическим агентом энзоотического лейкоза крупного рогатого скота, который встречается во многих странах мира с высокими показателями распространённости, особенно в Северной и Южной Америке, и наносит значительный экономический ущерб [1]

Несмотря на то, что естественным хозяином вируса является крупный рогатый скот, этот патоген описан как универсальный

агент, способный инфицировать многие виды животных как в природных, так и в контролируемых условиях в лаборатории [2, 3]. Вирус имеет лимфоидную тропность, поражая преимущественно В-лимфоциты, встраивая промежуточное звено ДНК в виде провируса в геном клеток. Следовательно, воздействие биологических жидкостей, загрязнённых инфицированными

лимфоцитами, потенциально приводит к распространению инфекции [4].

Среди лабораторных животных формирование стойкого ответа антител

наблюдали после экспериментального инфицирования ВЛКРС кроликов, крыс и морских свинок [5]. Следует отметить, что если к изучению иммунных дисфункций у инфицированных кроликов и крыс обращались некоторые исследователи [6-8], то сведения о проявлении патологического процесса у морских свинок в доступной научной литературе нами не обнаружены.

Как показывают многочисленные исследования, лейкозная инфекция оказывает влияние на клеточную функцию как неспецифической, так и специфической иммунной защиты и даже на деятельность неинфицированных клеток, но в то же время учёные указывают на ограниченность экспериментальных сведений о воздействии ВЛКРС на функциональную активность нейтрофилов [9, 10]

В этой связи предметом нашего исследовательского интереса стало изучение патогенетических механизмов воздействия ВЛКРС на иммунную функцию нейтрофилов у морских свинок.

Методика. Объектом исследования являлись 10 морских свинок, отобранных по принципу аналогов и разделённых на 2 группы по 5 голов в каждой: опытная и контрольная. Животных опытной группы инфицировали ВЛКРС путем

внутрибрюшинного введения клеточной взвеси лимфоцитов (1 мл), выделенной на градиенте плотности тразографа от больной лейкозом коровы. Особям контрольной группы вводили физиологический раствор аналогичным способом.

Отбор проб крови для оценки функционального состояния нейтрофилов производили из ретроорбитального венозного сплетения с использованием микропипетки на 14-е, 30-е, 60-е, 90-е, 120-е и 180-е сутки после инфицирования. Вирусоносительство подтверждали с помощью реакции непрямой

иммунофлюоресценции (РНИФ).

Ферментную активность

миелопероксидазы (МПО) нейтрофилов оценивали цитохимическим методом Грэхема-Кнолля с обработкой мазков бензидином, содержание неферментных катионных белков (КБ) в нейтрофилах -пробой с бромфеноловым синим по методу М.Г. Шубича. При визуализации мазков дифференцировали различную степень активности МПО и КБ в нейтрофилах:

1-я (низкоактивные) с единичными гранулами в цитоплазме фагоцита;

2-я (среднеактивные) с клетками, у которых менее У пощади цитоплазмы заполнена гранулами;

3-я (высокоактивные) с наполненностью цитоплазмы фагоцита гранулами свыше У [11].

Статистический анализ включал вычисление по стандартным формулам средней арифметической вариационного ряда (М) и средней ошибки (т±) с последующим определением 1>критерия по Стьюденту для оценки достоверности между сравниваемыми величинами.

Результаты. Анализ

функционального состояния нейтрофилов показал, что на 14-е сутки после инокуляции вируссодержащей суспензии наблюдается усиление активности КБ и МПО (табл. 1), которое проявлялось увеличением относительно контрольной группы числа клеток с высокой плотностью гранул (3-я степень) соответственно в 2,35 и 2,4 раза (р<0,05), а также СЦК - в 1,87 и 2 раза (р<0,01). Помимо этого, отмечено достоверное повышение количества фагоцитов со 2-й степенью наполнения гранул миелопероксидазой.

На 30-е сутки от начала эксперимента изменения носили сходный характер, но в отличие от предыдущего срока исследования увеличение числа нейтрофилов с 3-й степенью активности гранул не достигало статистически достоверной разницы. Цитохимические коэффициенты КБ и МПО достоверно возрастали в 1,36 и 1,59 раза.

В последующем на 60-е и 90-е сутки после инфицирования морских свинок ВЛКРС цитохимические коэффициенты также были выше по сравнению с группой контроля, но с той разницей, что на 60-е сутки достоверному изменению был подвержен только СЦК КБ, а на 90-е - СЦК МПО. В частности, уровень СЦК КБ достигал 1,32±0,06 у.е. против 1,14±0,02 у.е. (р<0,05), а СЦК МПО - 1,29±0,01 у.е. против 0,99±0,05 (р<0,01) в контроле.

Статистически достоверной разницы между цитохимическими параметрами у морских свинок опытной и контрольной групп на 120-е сутки после инфицирования ВЛКРС не выявлено.

Таблица 1

Цитохимические показатели фагоцитов морских свинок в разные сроки __после инфицирования ВЛКРС, _

Цитохимические параметры Группа животных

контрольная опытная

КБ 1 МПО КБ 1 МПО

14-е сутки после инфицирования

1 степень,% 14,66±4,81 16,0±4,16 15,20±2,48 17,40±2,71

2 степень,% 7,66±1,33 7,00±1,00 9,20±3,02 13,20±1,02**

3 степень,% 16,00±2,00 14,00±2,31 37,60±5,77* 33,60±6,34*

СЦК, у.е. 0,78±0,03 0,72±0,05 1,46±0,11** 1,44±0,18**

30-е сутки после инфицирования

1 степень,% 14,66±5,78 16,66±3,18 16,8±1,71 15,60±2,66

2 степень,% 11,33±2,90 14,0±0,58 12,40±2,98 19,80±1,77*

3 степень,% 24,66±3,84 17,33±3,18 36,60±5,82 32,80±6,74

СЦК, у.е. 1,11±0,02 0,96±0,13 1,51±0,13* 1,53±0,19*

60-е сутки после инфицирования

1 степень,% 11,33±2,40 7,66±2,18 19,25±5,79 17,75±1,93*

2 степень,% 15,00±0,58 12,0±1,15 10,50±2,53 13,50±2,87

3 степень,% 24,33±1,20 26,0±1,15 30,50±4,55 28,25±1,65

СЦК, у.е. 1,14±0,02 1,09±0,01 1,32±0,06* 1,29±0,08

90-е сутки после инфицирования

1 степень,% 15,33±2,33 12,33±5,24 13,50±4,57 16,00±2,58

2 степень,% 10,33±1,45 11,00±2,89 12,75±1,49 15,50±2,22

3 степень,% 25,33±3,71 21,66±2,18 35,50±2,63 27,50±2,22

СЦК, у.е. 1,12±0,09 0,99±0,05 1,45±0,10 1,29±0,01**

120-е сутки после инфицирования

1 степень,% 13,00±1,00 11,66±1,85 15,25±2,17 13,75±2,29

2 степень,% 11,33±2,90 13,00±1,73 14,00±2,97 15,75±1,31

3 степень,% 26,33±6,98 20,33±2,18 32,25±9,19 26,50±4,25

СЦК, у.е. 1,16±0,16 0,98±0,08 1,40±0,20 1,25±0,11

180-е сутки после инфицирования

1 степень,% 16,00±1,73 3,33±1,76 17,66±3,38 6,00±1,15

2 степень,% 8,66±2,18 7,00±0,58 11,00±3,51 8,66±2,66

3 степень,% 25,66±4,91 29,66±3,28 16,66±4,80 13,66±0,33**

СЦК, у.е. 1,10±0,11 1,06±0,12 0,89±0,14 0,69±0,05*

Примечание: *р<0,05; **р<0,01.

Противоположная траектория

изменений наблюдалась на 180-е сутки от начала эксперимента, которая

сопровождалась уменьшением числа высокоактивных нейтрофилов с КБ в 1,54 раза и особенно с МПО в 2,17 раза (р<0,01). Вследствие такой трансформации также происходило снижение цитохимических коэффициентов. Наиболее выраженным было понижение СЦК МПО до 0,69±0,05 у.е. против 1,06±0,12 у.е. (р<0,05) в контрольной группе. Идентичная закономерность функционирования аэробных и анаэробных противомикробных компонентов фагоцитов нами была выявлена ранее в динамике

цитохимических исследований крупного рогатого скота разных возрастных групп [12]. Следует также отметить, что ещё одним сходством являлось тесное

функционирование двух бактерицидных систем нейтрофилов у инфицированных животных (рис.1).

На рисунке 1 отчетливо прослеживается идентичность изменений СЦК у морских свинок, инфицированных ВЛКРС, в динамике исследования КБ и МПО нейтрофилов, что свидетельствовало об интенсивном взаимодействии анаэробной и аэробной антибактериальных систем нейтрофилов.

сутки

Рис 1. Динамика изменений СЦК у морских свинок, инфицированных ВЛКРС Fig. 1. Dynamics of changes in ACC in guinea pigs infected with BLV

Выводы. На основании полученных результатов можно прийти к заключению о том, что инфицирование морских свинок ВЛКРС индуцирует выраженную гиперреактивность бактерицидных систем нейтрофилов, наблюдаемую в течение 90 суток после инокуляции вируссодержащей взвеси, и последующее подавление деятельности внутриклеточных

противомикробных компонентов к 180-м суткам.

Выявленная динамика

цитохимических параметров нейтрофилов у морских свинок сходна с изменениями, свойственными для лейкозной инфекции у крупного рогатого скота, что позволяет их рассматривать как подходящую

лабораторную модель для изучения патогенеза ВЛКРС.

Список источников

1. Polat M., Takeshima S.N., Aida Y. Epidemiology and genetic diversity of bovine leukemia virus // Virol. J. 2017. Vol. 14. Article number 209. doi: 10.1186/s12985-017-0876-4.

2. Gillet N., Florins A., Boxus M. et al. Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti-retroviral therapies in human // Retrovirology. 2007. Vol. 4. Article number 18. doi: 10.1186/1742-4690-4-18.

3. Olaya-Galán N.N., Corredor-Figueroa A.P., Velandia-Álvarez S. et al. Evidence of bovine leukemia virus circulating in sheep and buffaloes in Colombia: insights into multispecies infection // Arch. Virol. 2022. Vol. 167(3). P. 807-817. doi: 10.1007/s00705-021-05285-7.

4. Schwartz I., Bensaid A., Polack B. et al. In vivo leukocyte tropism of bovine leukemia virus in sheep and cattle // J. Virol. 1994. Vol. 68. P. 4589-4596.

5. OIE Terrestrial Manual. Chapter 3.4.9 Enzootic bovine leukosis. 2018.https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.04.09_EBL.pdf

6. Wyatt C.R., Wingett D., White J.S. et al. Persistent infection of rabbits with bovine leukemia virus associated with development of immune dysfunction // J. Virol. 1989. Vol. 63. P. 4498-4506.

7. Dimitrov P., Simeonov K., Todorova K. et al. Pathological features of experimental bovine leukaemia viral (BLV) infection in rats and rabbits // Bull. Vet. Inst. Pulawy. 2012. Vol. 56. P. 115-120.

8. Krasnikova E.S., Bouchemla F., Krasnikov A.V. et al. The hematobiochemical status of Wistar rat line under the bovine leukemia virus experimental infection // Vet. World. 2019. Vol. 12(3). P. 382-388. doi: 10.14202/vetworld.2019.382-388.

9. Souza F.N., Blagitz M.G., Latorre A.O. et al. Intracellular reactive oxygen species production by polymorphonuclear leukocytes in bovine leukemia virus-infected dairy cows // J. Vet. Med. Sci. 2012. Vol. 74(2). P. 221-225. doi: 10.1292/jvms.11-0246.

10. Lv G., Wang H., Wang J., Lian S., Wu R. Effect of BLV infection on the immune function of polymorphonuclear neutrophil in dairy cows // Front. Vet. Sci. 2021. Vol. 8. Article number 737608. doi: 10.3389/fvets.2021.737608.

11. Власенко В.С., Вишневский Е.А., Новикова Н.Н., Борисов Е.С. Методы диагностики и оценки предрасположенности молодняка крупного рогатого скота к инфицированию вирусом лейкоза: методические рекомендации. ФГБНУ Омский АНЦ. Омск, 2021. 22 с.

12. Власенко В.С., Вишневский Е.А., Дудоладова Т.С. Катионные белки лизосом и миелопероксидаза в нейтрофилах молодняка крупного рогатого скота разного возраста при лейкозной инфекции // Достижения науки и техники АПК. 2021. Т. 35. №5. С. 65-69.

THE FEATURES OF THE FUNCTIONING OF ANTIMICROBIAL SYSTEMS OF NEUTROPHILS IN GUINEA PIGS INFECTED WITH BLV

1,2,3Omsk Agrarian Scientific Center, Omsk, Russia [email protected]

Abstract. The experiment was conducted on 10 laboratory animals in order to study the peculiarities of the functioning of the oxygen-dependent and oxygen-independent bactericidal systems of neutrophils during the infectious process in guinea pigs caused by the bovine leukemia virus (BLV). The animal units from the experimental group (n=5) were infected intraperitoneally with a cell suspension of lymphocytes isolated from a cow with leukemia; the remaining animal units (n=5) were in the control group. Blood samples were collected to assess the functional activity of neutrophils and for diagnostic testing in the indirect immunofluorescence reaction on the 14th, 30th, 60th, 90th, 120th and 180th days after infection. It was determined that in guinea pigs infected with BLV, there was a natural increase in the enzymatic activity of myeloperoxidase (MPO) and an increase in the concentration of cationic proteins (CP) of neutrophils, which were seen from the 14th to the 90th days after inoculation of the virus-containing suspension, these facts were indicated by an increase in the average cytochemical coefficient (ACC) of MPO by 1.18 - 2 times and ACC CP by 1.16 - 1.87 times relative to the control group. On the contrary, there was a pronounced suppression of the activity of the antimicrobial systems of neutrophils by the 180th day from the start of the experiment. Taking into account the similar nature of the changes that we identified in guinea pigs in the dynamics of studying the bactericidal systems of neutrophils with the previously established transformation of cytochemical parameters during the leukemic process in cattle, we come to a conclusion about the suitability of this laboratory model for studying the pathogenesis of BLV.

Keywords: guinea pig, BLV, neutrophils, cationic proteins, myeloperoxidase

References

1. Polat M., Takeshima S.N., Aida Y. Epidemiology and genetic diversity of bovine leukemia virus // Virol. J. 2017. Vol. 14. Article number 209. doi: 10.1186/s12985-017-0876-4.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.