CC BY
97
ЦИТОФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ МЕМБРАНОТРОПНЫХ СРЕДСТВ
© Вислобоков А. И., Игнатов Ю.Д.
Государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова, Санкт-Петербург, 197022
Ключевые слова:_____________________________:______
цитофармакопогш, мембранотропное действие, местные анестетики, анальгетики, нейроны, противоаритмические средства, ионные токи •
Вислобоков А. И., Игнатов Ю.Д. Цитофармакологическое исследование механизмов действия мембранотропных средств // Обзоры по клин, фармакол. илек, терапии.— 2003.— Т. 2,— №1,— С. 14-22.
Обобщены результаты собственных исследований изменений электрофизиологических свойств и механизмов деятельности нейронов моллюсков под влиянием фармакологических средств разных групп. Показано, что местные анестетики и анальгетики преимущественно подавляют натриевые токи, а противоаритмические средства — кальциевые. Не обнаружено строгой избирательности действия всех исследованных веществ на ионные токи. Мембранотропное действие на нейронах может быть реализовано путем влияния на их состояние через изменение мембранного потенциала покоя и действия синаптических потенциалов; мембраностабилизирующие эффекты, выражающиеся в снижении или увеличении неспецифических токов утечки мембраны; изменения потенциала поверхностного заряда мембраны вблизи ионных каналов. Кроме того, препараты увеличивают или снижают ионные токи потенциалуправляемых каналов и взаимодействуют с воротными структурами ионных каналов, изменяя их кинетику активации или инактивации. Знание механизмов действия фармакологических препаратов способствует более эффективному управлению функционированием возбудимых клеток.
Изучение структурно-функциональной организации и механизмов функционирования нервной клетки в норме и при различных внешних воздействиях, направленное на обоснование возможностей управления ее деятельностью [3], представляет значительный интерес для многих научных направлений биологии, а также фармакологии и медицины. Такое изучение стало возможным после появления электрофизиологических и биофизических методик регистрации внутриклеточных биоэлектрических потенциалов [37] и ионных токов интакт-ных и изолированных клеток [21] и их мембранных
фрагментов [34]. Многолетние интенсивные исследования привели к современному пониманию механизмов деятельности клеток в изменяющейся среде. Утвердилась ионная мембранная теория биоэлек-трогенеза [25], открыты различного рода ионные каналы и в последние 5-10 лет ведется расшифровка их молекулярной организации [29-31].
Многообещающим направлением в исследованиях механизмов функционирования возбудимых клеток является сочетание физиологических и биофизических методик с использованием фармакологических средств. Такой подход позволил доказать существование химических нейропередатчиков и избирательных для них синаптических (и внесинаптических) рецепторов, идентифицировать агонисты и антагонисты для многочисленных рецепторов хемоуправляемых ионных каналов [11], выявить модуляторы активности и специфические блокаторы для потенциалуправляемых ионных каналов. В большинстве работ именно фармакологические вещества, используемые в виде специфических блокаторов, модификаторов или модуляторов активности вновь открываемых рецепторов и каналов, являются средствами для выяснения их свойств.
Меньше работ, в которых изучено влияние лекарственных средств на возбудимые клетки, хотя потенциалуправляемые ионные каналы и хеморецепторы, встроенные в поверхностные мембраны клеток, обеспечивающие генерацию биоэлектрических импульсов в нервной системе, являются мишенью для многих лекарственных средств.
Известно,что среди фармакологических средств большое практическое значение имеют местные анестетики, анальгетики (опиатные и адренопози-тивные), противоаритмические и нейротропные средства, реализующие свое действие на целостный организм через возбудимые клетки нервной и мышечной системы. Возбудимость этих клеток определяется потенциалуправляемыми ионными каналами в их соматических мембранах. В этой связи углубленное изучение влияния перечисленных групп фармакологических препаратов на нервные клетки представляется весьма актуальным.
Влияние местных анестетиков на возбудимые мембраны изучалось главным образом на нервных волокнах и трактуется их способностью блокировать натриевые ионные каналы [25, 27, 35, 36]. Данных о действии анестетиков на кальциевые и
калиевые каналы очень мало и они получены на различных объектах. Функциональная роль кальциевых и калиевых ионных каналов в генерации биопотенциалов довольно велика, поэтому изучение влияния на них местных анестетиков становится необходимым.
Механизмы действия противоаритмических средств [12] изучались преимущественно на мышечных клетках и связывались с угнетением кальциевых ионных токов. Молекулярный механизм действия сопоставляют с аналогичным для местных анестетиков при действии на натриевые каналы (связывание блокатора в канале). Влияние противоаритмических средств на натриевые [22] и калиевые ионные каналы, на нервные клетки изучены в меньшей степени, хотя роль нейрогенных нарушений в происхождении аритмий сердца довольно велика. Таким образом, необходимость изучения влияния противоаритмических средств на нейроны, натриевые, кальциевые и калиевые ионные каналы также очевидна.
К настоящему времени детально изучены болеутоляющие эффекты опиатных и неопиатных анальгетиков, механизм действия которых связывают с влиянием на различные типы пре- и пост-синаптических мембранных рецепторов ноцицеп-тивных и антиноцицептивных структур головного и спинного мозга [14, 15, 32, 39, 43]. Известно, что воздействие фармакологических средств на соответствующие рецепторы реализуются в конечном счете через изменения проводимости хемо- и/или потенциалуправляемых ионных каналов нейронов. Существуют данные о сходном с опиатами характере влияния адренопозитивных средств на каль^ циевую проводимость нейрональной мембраны, причем уменьшение входа кальция в клетку при их действии объясняют влиянием на ее адреноре-цепторы [28]. Имеются фрагментарные данные о влиянии агонистов опиатных и адренорецепторов на кальциевые и калиевые каналы нейронов,об их взаимодействии с кальциевым механизмом возбудимости нервных клеток [33, 40-42]. Влияние болеутоляющих средств на мембрану нервной клетки и различные виды потенциалуправляемых ионных каналов исследованы недостаточно и, следовательно, не раскрыт важный компонент механизма действия центральных анальгетиков — их внесинаптическое действие, не связанное с влиянием на синаптические рецепторы и хемоуп-равляемые ионные каналы.
Доступным объектом биофизического и цито-фармакологического исследования за последние 30-40 лет стали, нейроны моллюсков. На таких нейронах были обнаружены многочисленные типы ионных каналов и рецепторов, описаны их свойства и реакции на различные воздействия [17,19]. Однако на таком удобном в методическом отношении объекте очень мало работ посвящено изучению механизмов действия лекарственных средств. Кроме того, они фрагментарны, проводятся с регистрацией отдельных токов (на отдельных каналах), с фармакологическими средствами в узком
диапазоне концентраций. ■Поэтому необходимы дальнейшие систематические исследования элект-рофизиологических свойств нейронов, ставших удобной экспериментальной моделью для изучения механизмов действия различных фармакологических средств: Подробное изучение изменений трансмембранных ионных токов через потенци-алуправляемы'е натриевые, кальциевые и калиевые ионные каналы, обеспечивающие генерацию потенциалов действия (ПД) нейронов, при действии мембраноактивных фармакологических препаратов, использующихся в медицинской практике или вновь синтезированных, имеет и большое практические значение.
Объектом исследования были выбраны нейроны брюхоногого моллюска — прудовика большого (/.утпаеа stagnalis). Ионные мембранные механизмы электрогенеза и закономерности функционирования нейронов моллюсков принципиально сходны с таковыми для нейронов млекопитающих [19]. Для работы использовали неидентифициро-ванные нейроны, выделенные по методике, разработанной М. А. Костенко [16]. Из тела моллюска вырезали окологлоточное кольцо нервных ганглиев, которое в течение 40-60 минут подвергалось ферментативной обработке путем его помещения в 0,25%-ный раствор трипсина на физиологическом растворе для-прудовиков. Выделенные нейроны являются жизнеспособными и сохраняют свои электрические характеристики в течение 1-3 суток.
В работе использовали методику внутриклеточного диализа и фиксации мембранного потенциала [19] на целой клетке, помещаемой на полиэтиленовую пипетку. Разделение суммарных ионных токов на отдельные кальциевые,натриевые и калиевые производили композицией ионных составов вне- и внутриклеточных растворов нейронов и поддержанием соответствующих мембранных потенциалов [2, 6].
Перфузирующий раствор подавался в камеру, где находился нейрон на полиэтиленовой микропипетке, а диализирующий — внутрь этой пипетки. Исследуемые вещества в различных концентрациях добавляли в перфузирующий раствор. Эффект развивался быстро и стабилизировался через 2-3 мин, отмывание велось 5-7 мин. Исходные величины ионных токов принимали за 100%,а установившиеся при действии всех веществ выражали в процентах к исходным и обрабатывали с использованием ^критерия Стьюдента.
На основании полученных данных были построены вольт-амперные характеристики мембраны для различных токов и зависимости «концентра-цйя-эффект» (по 5-6 измерений для каждой точки кривой зависимости «концентрация-эффект»). Оценку изменений амплитуды и кинетики ионных токов при действии исследованных соединений вели визуально с экрана осциллографа или после распечатки кривых токов, введенных в компьютер.
При общей характеристике гигантских нейронов моллюсков нами было установлено, что они
неоднородны по своим, электрофизиологическим параметрам [4], различия носят устойчивый характер. Нейроны отличаются друг от друга по содержанию в их мембране ионных каналов и рецепторов. Наиболее часто встречаются клетки с одновременным представительством натриевых и кальциевых ионных каналов. Из кальциевых каналов нейроны содержат в основном М-подобные кальциевые каналы. Р- или Н-реакция идентифицированных нейронов (большого париетального — БП-4 и висцерального — В-6) моллюсков на катехоламины, не снимаемая альфа- или бета-адреноблокаторами, указывает на наличие в данных нейронах дофаминовых рецепторов, связанных с различными механизмами, обеспечивающими специфические ответы [7]. Полученные данные об изменениях электрофи-зиологических параметров нейронов под влиянием ДОФА позволяют заключить, что катехоламины помимо рецепторов могут оказывать и неспецифическое действие на мембрану любых нейронов, т. е. непосредственно на потенциапуправляемые меха-; низмы генерации биопотенциалов.
. Установлено, что гиперполяризация нейронов, развивающаяся при действии гипертонических растворов сахарозы, глюкозы и мочевины или в последействии хлористого натрия при одновременном повышении сопротивления мембраны нейронов, снимающаяся .при пониженной температуре, обусловлена дегидратацией нейронов и активацией электрогенного натрий-калиевого насоса. Обращает на себя внимание активирующее действие гипертонических растворов и высокая функциональная устойчивость нейронов, сохраняющих свою активность при резких изменениях осмотического давления наружных растворов [1]. Важнейшим фактором окружающей среды нейронов является также уровень pH. Было показано, что нейроны моллюсков способны сохранять свою функциональную активность в широком диапазоне pH — от 4,5 до 10,5, при этом щелочные растворы оказывают активирующее действие [5]. Изменения параметров ПД скорее всего обусловлены их по-тенциалзависимостью и изменениями поверхностного потенцила (ПП). В кислых растворах помимо деполяризационной инактивации возможно блокирование проводимости ионных каналовиона-ми Н+.
Подробное исследование мембранотропных эффектов фармакологических средств разных групп на нейроны моллюсков позволило установить общие (неспецифические) и отдельные (специфические) их особенности. Например, исследованные анестетики (тетракаин и леокаин) обладают выраженным мембраноактивным действием, которое проявляется в дозозависимом и обратимом изменении ионных токов через потенциапуправляемые ионные каналы нейронов прудовика [6]. Зависимости «концентрация-эффект» свидетельствуют, что изменения ионных токов носят двухфазный характер. Первая фаза характеризуется увеличением ионных токов (особенно кальциевых) в диапазоне концентраций 10-12-г10'5 М. Во второй фазе проис-
ходит подавление всех ионных токов вплоть до полного их угнетения в миллимолярном диапазоне, пропорциональное концентрации тетракаина и ле-окаина. Регрессионный анализ с расчетом среднеэффективных концентраций показал, что наиболее чувствительными к ингибирующему действию лео-каина и тетракаина оказались натриевые каналы (ЕС50 в диапазоне десятков микромоль), тогда как угнетение кальциевых и калиевых каналов отмечалось в более высоких концентрациях (ЕС50 в 2-3 раза выше). Подавление ионных токов, а также влияние анестетиков на неспецифические токи утечки мембраны, вероятно, следует трактовать как важный электрофизиологический коррелят их мембраностабилизирующего эффекта.
Нами показано, что анестетики влияли и на кинетику ионных токов, вызывая ускорение инактивации калиевых медленных токов и сдвиг инакти-вационных характеристик каналов (кроме быстрых калиевых), свидетельствуя о зависимости блокирования каналов от мембранного потенциала. Кроме того, было показано, что под влиянием.анестетиков происходил сдвиг вольт-амперных характеристик мембраны для кальциевых токов, что указывает на влияние на потенциал поверхностного заряда мембраны вблизи кальциевых каналов.
Показано,что лидокаин и бупивакаин в концентрациях 62,5-1000 мкМ так же, как леокаин и тетракаин, обладают выраженным мембранотропным действием, которое проявляется в изменении ионных токов через потенциапуправляемые ионные каналы нейронов прудовика. Эти изменения характеризуются дозозависимым подавлением всех ионных токов вплоть до полного их угнетения в миллимолярном диапазоне. Регрессионный анализ с ■ расчетом среднеэффективных концентраций позволил расположить их в соответствующие ряды по степени подавления ионных каналов, что показывает тенденцию их определенной специфичности действия.
. В самых общих чертах элементы сходного с анестетиками мембранотропного действия на нейроны проявляли- и противоаритмические средства. Этацизин, метацизин, этмозин, верапамил и ИЭМ-815 в концентрациях 62,5-1 ООО мкМ обладают выраженным мембранотропным действием, которое проявляется изменением ионных токов через по-тенциалуправляемые ионные каналы нейронов прудовика. Новое соединение ИЭМ-815 оказалось приближающимся по активности к верапамилу (кроме более слабого подавления натриевых токов).
Изменения ионных токов характеризуются пропорциональным концентрации дозозависимым подавлением противоаритмическими средствами входящих натриевых, кальциевых и выходящих калиевых токов вплоть до полного их угнетения в миллимолярном диапазоне.
Регрессионный анализ с расчетом среднеэффективных концентраций показал, что наиболее чувствительными к ингибирующему действию этих препаратов оказались кальциевые каналы (ЕС50 в
диапазоне десятков микромоль — кроме этмози-на),тогда как угнетение калиевых и натриевых каналов отмечалось в более высоких концентрациях (ЕС50 в 2-3 раза выше). Подавление ионных токов следует трактовать как электрофизиологический коррелят мембраностабилизирующего эффекта исследованных противоаритмических средств.
Из данных литературы известно, что опиатные и адренопозитивные анальгетики могут модулировать функциональную активность кальциевых и калиевых потенциалуправляемых ионных каналов путем первичного взаимодействия с соответствующими синаптическими рецепторами (опиатными и адренергическими) через системы внутриклеточных посредников (системы обмена циклических мононуклеотидов, инозитолтрифосфата и др.), причем эти эффекты анальгетиков устраняются специфическими антагонистами опиатных (налок-сон) и адренорецепторов (идазоксан).
Нами показана принципиально новая возможность влияния ряда опиатных и центральных адре-нопозитивных средств на натриевые, кальциевые и калиевые ионные каналы нейрональной мембраны в результате их непосредственного взаимодействия со структурами этих каналов, поскольку в наших экспериментах эффекты подавления входящих и выходящих ионных токов не устранялись антагонистами соответствующих рецепторов (налок-соном и идазоксаном) [10, 23].
Многие из исследованных мембраноактивных
соединении проявляли тенденцию к изменению кинетики кальциевых, калиевых и натриевых токов, что может свидетельствовать в пользу непосредственного их взаимодействия с воротными частицами каналов. Вероятно, существует также и их неспецифическое липоидотропное действие за счет изменения жидкостно-мозаичных свойств би-липидного слоя нейрональной мембраны и неселективного снижения ее ионной проницаемости. В наших экспериментах это проявлялось увеличением стабильности мембраны, выражавшемся в уменьшении неспецифических токов утечки параллельно со снижением амплитуды всех ионных токов. В этих эффектах, скорее всего, имеет место как избирательное взаимодействие анальгетиков со структурами большинства потенциалзависимых ионных каналов, так и неспецифическое мембранотропное действие на функциональную активность потенциалуправляемых каналов через липиды мембраны. Данные литературы подтверждают, что потенциалозависимые каналы различных типов имеют в целом сходную молекулярную ультраструктуру в силу общности их эволюционно-генетического становления [20, 26, 30, 35, 38]. Таким образом, на основании полученных данных можно заключить,что мембранотропное влияние опиатных и центральных адренопозитивных средств на нейроны и потенциалуправляемые ионные каналы является одним из существенных механизмов их вне-синаптического действия на электровозбудимых
Таблица 1. Сравнительная характеристика (ряды активности) подавления ионных токов нейронов моллюсков (ЕС50 вмкМ) местными анестетиками, анальгетиками и противоаритмическими средствами
Кальциевые токи
Натриевые токи
Калиевые медленные
1. ИЭМ-815 16 1. Буторфанол 39 ■1. Верапамил 59
2. Верапамил . 24 • 2. Леокаин 55 2. Бупивакаин 102
3. Этацизин 35 3. Тетракаин 64 3. ИЭМ-815 110
4. Метацизин 42 . 4. Промедол 90 4. Тетракаин 116
5. Буторфанол 62 5. Верапамил 101 5. Леокаин 138
6. Тетракаин 169 6: Метацизин 144 6. Буторфанол 154
7. Леокаин 174 7. Этацизин 160 7. Метацизин 198
8. Промедол 224 8. Бупивакаин 173 8. Этацизин 199
. 9. Бупивакаин 272 9. ИЭМ-815 . 314 9. Промедол 229
10. Этмозин 584 10. Трамадол 315 10. Этмозин 420 .
11. Трамадол 933 11. Клофелин 724 11. Трамадол 511
12. Лидокаин 1177 12. Лидокаин 737 12. Клофелин 2015
13. Клофелин 1934 13. Этмозин 1100 13. Лидокаин 2512
14. Гуанфацин 5816 14. Гуанфацин 1386 14. Гуанфацин 15383
15. Морфин 21819 15. Морфин 16910 15. Морфин —
клетках. В этих эффектах анальгетические средства напоминают мембранотропное влияние, анестетиков и противоаритмических средств. Особенно наглядно это выступает при сравнении их величин ЕС50 (табл. 1).
Из представленных данных видно, что местные анестетики и анальгетики преимущественно подавляют натриевые токи, а противоаритмические средства — кальциевые. При этом строгой избирательности действия всех исследованных веществ на те или иные токи не обнаружено, все другие токи также подавляются. Нами не выявлено.что фармакологические средства определенной группы (анестетики, противоаритмические средства или анальгетики) обладают наибольшей способностью снижать ионные токи. Как,следует из таблицы, среди наиболее активных блокаторов ионных каналов находятся и анестетики (тетракаин,леокаин,бупи-вакаин), и противоаритмические средства (верапа-мил, этацизин, ИЭМ-815), и опиатные анальгетики (буторфанол, промедол). Наиболее слабыми блока-торами также являются некоторые анестетики (ли-докаин), противоаритмические средства (этмозин), и анальгетики (клофелин, гуанфацин, морфин и трамадол).
Если в мембранотропном действии на нервные клетки местноанестезирующих, противоаритмических и обезболивающих средств показано их мембраностабилизирующее действие (снижение неспецифических токов утечки, подавление токов всех ионных каналов), что можно назвать неизбирательным (неспецифическим) действием, то для других веществ (таурина, амтизола, 4-аминопиридина, этимизола и его производных) показано избирательное (специфическое) влияние на те или иные ионные каналы. Под влиянием таурина происходило нарушение инактивации натриевых токов [8], амтизола — инактивации калиевых медленных токов [18]. 4-аминопиридин при внутриклеточном приложении подавлял быстрые калиевые токи, а этимизол и его производные — преимущественно калиевые [13]. Из производных этимизола — про-пилнорантифеин подавлял в основном быстрые калиевые токи [13]. Понятно, что эффекты мембраноактивных соединений при действии на ионные каналы определяются помимо особенностей молекулярного строения ионных каналов также структурой молекул и физико-химическими свойствами этих соединений [24]. Подтверждением этого положения и демонстрацией зависимостей «структура-действие» для фармакологических средств могут служить результаты опытов по изучению влияния фенамина, этимизола и их производных на ионные каналы нейронов. Модификация молекулы фенамина приводит к изменению характера действия [9], а только увеличение длины радикала в молекуле этимизола усиливает его избирательность действия на быстрые калиевые каналы.
Наши данные, полученные на нервных клетках моллюсков, можно экстраполировать и на другие клетки, поскольку ионные мембранные механизмы электрогенеза и закономерности функционирова-
ния ионных каналов нейронов моллюсков принципиально сходны с таковыми для нейронов других животных, в том числе и млекопитающих. Проведенное исследование ионных механизмов деятельности нервных клеток на примере нейронов моллюсков вместе с анализом данных литературы позволяют сделать некоторые обобщения как о механизмах функционирования нейронов, так и о возможных путях управления состоянием нейронов и выдвинуть концепцию управления функциональным состоянием клеток.
Нервная клетка, находясь в адекватной ей окружающей среде как элементарная живая физиологическая система, может самостоятельно поддерживать на определенном уровне свое существование и функционирование. Функциональная разнородность нейронов, вероятно,отражает их специализацию к определенным функциям в нервной системе, осуществляемую путем формирования определенного набора ионных каналов и рецепторов в тех или иных нейронах,что может контролироваться на генетическом уровне. Все это сопряжено с внутриклеточными метаболическими процессами,деятельность которых обеспечивает биоэлектрическую активность нейронов, переработку информации в нервной системе, процессы онто- и филогенеза организма.
В структурно-функциональной организации клетки, как в целостной системе (см. рисунок), можно выделить неспецифические и специфические (специализированные) блоки. Неспецифические блоки — блок репродукции (пластического метаболизма) и энергетики (энергетического метаболизма). Блок репродукции (система ДНК-РНК-белок-синтезирующий аппарат) обеспечивает восстановление изношенных и создание новых структурных компонентов клетки, а блок энергетики (системы окислительного фосфорили-рования, гликолиза и т. д.) создает и обеспечивает структурные компоненты клетки необходимой энергией в виде различного рода макроэргов и ионных градиентов (в том числе метаболические ионные насосы, поддерживающие мембранный потенциал покоя). Прямые и обратные связи этих блоков между собой (между различными клеточными элементами) и с окружающей средой обеспечивают скоординированное взаимодействие нейрона со средой и между нейронами, т.е. их функционирование.
Среди специфических блоков нейрона можно выделить блок рецепторов, интеграторов и эффекторов. Основная функция рецепторов состоит в восприятии различного рода воздействий (изменений во внешней и внутренней среде, в том числе и различных сигналов — информационных воздействий). Такие рецепторы — различного рода хемо-или потенциалореактивные группы молекулярных синаптических или внесинаптических (прямо на поверхностной соматической мембране) структур. Интеграторы трансформируют или транслируют сигнал далее к эффектору — ионным каналам, формирующим через изменение состояния клетки внеш-
ний выходной сигнал — воздействие, как ответную специфическую реакцию в виде генерации потенциала действия и/или синаптического выброса медиатора. Интегратором могут быть вне- или внутриклеточные мембранные локусы — зона аксонного холмика, ритмоводящие и пейсмекерные участки клетки, а внутри клетки при химическом, а иногда и фармакологическом воздействии — различные посредники (мессенджеры), в том числе и ионы кальция, активирующие белки-мишени (различные киназы, в-белки), через цепочку которых воздействие может быть передано на ионные каналы. В потенциалуправляемом ионном канале внешнее электрическое поле после воздействия на сенсор напряжения через конформационные перестройки передается на ворота ионных каналов, переводя их в открытое (проводящее ионы) состояние канала. Эффекторы клеток — ионные'каналы возбудимой мембраны, секреторные аппараты ак-сосинаптических окончаний. Прямые и обратные связи в нейроне могут реализовываться физико-химическими изменениями (электрическими, ионными и межмолекулярными прямыми и опосредованными взаимодействиями).
В электрофизиологическом эксперименте исходный уровень функционального состояния (качественно — низкий, средний и высокий) нейрона и его функциональные возможности или уровень функциональной активности (качественно также — низкий, средний и высокий), определяемые состоянием и активностью тех или иных клеточных механизмов, можно - характеризовать некоторыми количественными параметрами (уровнем ПП, амплитудой, длительностью и частотой ПД и т.д.). Изучение реакций нейронов, на внешние воздействия с регистрацией изменения их параметров — общепринятый способ изучения механизмов их деятельности. При этом используются самые разнообразные воздействия, .но особая роль отводится фармакологическим агентам, как наиболее адекватным для клеток и как довольно широко распространенным лекарственным средствам.
Из общих положений, концепции управления функциональным состоянием, клеток вытекает частная концепция цитофармакологического (мембранофармакологического) управления состоянием. Например, при 1 регистрации ПП нейронов, как интегрированного показателя функционального состояния клетки, мы получаем сведения о деятельности неспецифических систем клетки
Рисунок. Блок-схема структурно-функциональной организации клетки
(результирующую' пассивных ионных проницаемостей мембрань! для отдельных ионов — калия, натрия, кальция :и др. и о деятельности ионных насосов). С помощью определенных методических приемов можно оценить вклад отдельных пассивных ионных проводимостей в величину ПП и вклад электрогенной компоненты ионных насосов. Так, под влиянием фармакологического воздействия может быть увеличение (гипер-) или снижение (деполяризация) ПП. При этом фармакологическое воздействие: может привести к изменениям как одного,так и 'нескольких компонетов механизмов поддержания ПП — проницаемости для каких-либо ионов и/илй к активации или ингибировании электрогенного транспорта ионов. В силу потен-циалзависимости:. механизмов инициации ПД (синаптических хемозависимых и пейсмекерных зон) или механизмов генерации ПД (потенциалзависимых ионных каналов) последние также могут претерпеть изменения, которые будут опосредованными. Если же фармакологическое воздействие будет направлено Прямо на механизмы инициации или генерации ПД, то тогда надо вычленять эти компоненты. Так, при регистрации отдельных ионных токов вклад данных каналов и роль этого ионного механизма в1 клеточных эффектах оценивается непосредственно. Если регистрировать синаптические токи, то можно оценить вклад синаптических рецепторов и связанных с ними каналов в эффектах препаратов на клетке. Таким образом, фармакологическое воздействие может быть направлено на многие компоненты ионных механизмов генерации потенциалов клеток и в различной степени. Выяснение всех этих составляющих клеточных ответов (ионных механизмов действия) является довольно трудной, но многообещающей работой.
Результаты проведенного исследования по изучению ионных механизмов действия и влияния на потенциалуправляемые ионные каналы фармакологических средств разных групп» позволяют выявить клеточные механизмы регуляции состояния на уровне организма. Известно, что местноанестезирующие средства должны обратимо снизить или прекратить восприятие и проведение импульсации болевых ощущений на определенное время. С точки зрения рассматриваемой концепции и с учетом клеточных механизмов функционирования прекратить проведение ПД можно изменением ПП — глубокой гиперполяризацией или деполяри^ зацией, но можно непосредственным блокированием ионных каналов. Все исследованные местные анестетики эффективно блокировали не только преимущественно" натриевые, но и кальциевые ионные каналы и, следовательно, могут обеспечить прекращение проведения ПД, т. е. местную анестезию. Влияние местных анестетиков на неспецифические токи утечки мембраны, на потенциал поверхностных фиксированных зарядов мембраны вблизи ионных каналов или кинетику ионных токов являются важными дополнениями для понимания мембранотропных механизмов их действия.
Противоаритмические средства в зависимости от природы нарушений сердечной деятельности на уровне возбудимого кардиомиоцита или нервных элементов, участвующих в генерации и проведении возбуждения, должны нормализовать нарушенные функции генерации или проведения ПД и сокращения, изменить возбудимость, чувствительность к естественным рецепторным кардиотроп-ным регуляторам, нормализовать ритм. С одной стороны, очень важен уровень ПП, определяющий в значительной степени все эти процессы, а с другой,— состояние ионных каналов, участвующих в генерации ритмоводящих потенциалов или ПД. Все исследованные противоаритмические средства обладали выраженным каналоблокирующим влиянием на кальциевые и натриевые каналы и, следовательно, способны регулировать состояние и деятельность кардиомиоцитов. Они же способны регулировать уровень ПП через влияние на ионную проницаемость (влияние на неспецифические токи утечки) и в некоторых случаях — на потенциал поверхностного заряда мембраны. Следует заметить, что оценка выбора и эффективности местноанестезирующего или противоаритмического действия исследованных средств на уровне организма выходит за рамки данной работы, хотя с учетом рассматриваемой концепции и конкретных полученных результатов об их мембранотропных эффектах такую работу можно будет проводить эффективнее.
Центральные адренопозитивные и опиатные болеутоляющие средства должны снижать или прекращать болевую чувствительность на уровне ЦНС организма, исходящую от тех или иных органов или участков тела организма. К сожалению, механизмы боли детально не изучены, но в самых общих чертах можно говорить о том, что для осуществления срочных антиноцицептивных лекарственных воздействий, с точки зрения клеточных механизмов деятельности, необходимо снижать межклеточные взаимодействия, возбудимость и проведение нервного импульса в клетках, обеспечивающих ноцицептивную чувствительность^ ЦНС. Для эффективного длительного устранения болевых ощущений необходимо нормализовать функции того или иного органа, ставшего источником болевых ощущений, для чего используются нетолько болеутоляющие средства. Все изученные болеутоляющие средства, механизм действия которых связывался прежде всего с их влиянием на соответствующие мембранные рецепторы, оказывали блокирующее действие на ионные каналы нейронов. В этом смысле они напоминали действие местноанестезирующих и противоарит-мических средств, хотя это действие было менее выраженным. Болеутоляющие средства морфин и кпофелин оказывали свое влияние на ионные каналы рецепторнезависимо; налоксон и идазоксан не снимал этих эффектов. Поэтому можно считать, что в механизмах действия болеутоляющих средств их прямое влияние на ионные каналы должно занимать существенное место. Кроме того, болеутоляющие средства влияли на неспецифи-
ческие токи утечки мембраны, потенциал поверхностного заряда мембраны и на кинетику развития некоторых ионных токов. Эти стороны их действия могут оказаться значимыми при осуществлении своих эффектов на уровне ЦНС. Это дополнение с точки зрения рассматриваемой концепции цито-фармакологической регуляции (управления) функциональным состоянием является новым для понимания механизмов действия центральных болеутоляющих средств.
Ионные механизмы действия нейротропных фармакологических веществ — фенамина и его производных, этимизола (с полимодальным действием на организм) или его производных, нейроак-тивной аминокислоты таурина и некоторых других веществ не обсуждаются с точки зрения их специфического лекарственного эффекта на уровне организма. Однако в данной работе показано, что они являются мембраноактивными соединениями; модификация молекул приводит к изменению характера их действия и убедительно демонстрирует зависимость «структура-действие». Чрезвычайно интересно также специфическое воздействие на кинетику ионных токов, избирательность в блокировании отдельных каналов и др.
Таким образом, проведенное исследование и анализ полученных новых фактов об ионных механизмах действия фармакологических средств разных групп, представляющие собою цитофармаколо-гическое направление исследований, позволили сформулировать концепцию мембранофармакологического управления функциональным состоянием клеток, которая, в свою очередь, дает возможность определить значимость этих новых фактов для понимания механизмов лекарственного эффекта изученных фармакологических веществ. В данной работе обращено внимание к новым данным об ионных механизмах действия на нейроны фармакологических соединений и на возможность управления состоянием клеток через воздействие на потенци-алуправляемые ионные каналы. Использование всей концепции цитофармакологического управления функциональным состоянием позволит использовать и другие возможные пути целенаправленной регуляции функционального состояния. Влияние факторов окружающей клетку внешней среды, важным компонетом которой в условиях организма становятся лекарственные вещества, направлено на всю клетку. При этом на разные ее элементы воздействие окажется неравнозначным. Те клеточные элементы или блоки структурно-функциональной организации клетки, которые реагируют в наибольшей степени, являются избирательно восприимчивыми к определенным лекарственным препаратам, а последние становятся целенаправленными факторами регуляции состояния. Использование целенаправленных воздействий на другие блоки схемы функциональной организации клеток — рецепторы, интеграторы, системы пластического и энергетического метаболизма существенно расширит возможности регулировать функциональное состояние клеток и организма.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вислобоков А. И. Изменения электрической активности нейронов катушки Р/апогЬапиэ сотеив под влиянием гипо- и гипертонических растворов // Журн. эвол. биох. и физиол.— 1984,— № 5,— С. 545-549.
2. Вислобоков А. И. Трансмембранные ионные токи нейронов моллюсков и их зависимость от исходного уровня фиксированного потенциала и потенциала покоя // Вестн. Ленингр. ун-та,—
1978.- № 15.- С. 68-74.
3. Вислобоков А. И. Физиологические процессы и состояния в живых системах // Вестн. Ленингр. ун-та,- 1980,- № 9,- С. 51-61.
4. Вислобоков А. И. Формы внутриклеточных потенциалов действия сомы идентифицируемых гигантских нейронов моллюска // Физиол. журн. СССР.- 1974,- Т. 60,- № 1,- С. 42-47.
5. Вислобоков А. И., Егорова Т. А., Сологуб М. И. Электрофизиологические параметры нейронов моллюска при изменениях pH среды // Вестн. Ленингр. ун-та.— 1979.— № 9,— С. 57-63.
6. Вислобоков А. И., Зайцев А. А., Игнатов Ю. Д.,
Савоськин А. Л. Мембранные механизмы действия на нервные клетки анестетиков, анальгетиков и противоаритмических средств // Мед. акад. вестник,- 2001,- Т. 1,- № 1,- С. 25-33.
7. Вислобоков А. И., Кокарев А. А., Сологуб М. И. Деполяризация и гиперполяризация идентифицированных нейронов прудовика под влиянием катехоламинов // Вестн. Ленингр. ун-та,—
1981,- № 3,- С. 72-79.
8. Вислобоков А. И., Копылов А. Г., Манцев В. В.,
Гуревич В. С. Влияние таурина на натриевые трансмембранные токи нейронов // Вестн. Ленингр. ун-та - 1991- Вып. 3.-№ 17,- С. 55-61.
9. Вислобоков А. И., Манцев В. В., Мареничев В. В., Думпис М. А., Кудряшова Н. И., Зайцев Ю. В. Сравнительная характеристика мембранных механизмов действия фенамина и его производных на ионные каналы изолированных нейронов моллюсков// Физиол. журн. СССР.— 1989,—
Т. 75,- № 8,- С. 1069-1074.
10. Вислобоков А. И., Савоськин А. Л. Влияние опиатных анальгетиков на потенциалуправляемые ионные каналы нейронов прудовика // Эксперим. и клин, фармакол,— 2000,— Т. 63.— № 4,— С. 7-12.
11. Говырин В. А., Жоров Б. С. Лиганд-рецепторные взаимодействия в молекулярной физиологии,—
Спб.: Наука, 1994,— 240 с.
12. Думпис М. А., Кудряшова Н. И. Антиаритмические средства: классификация, структура, механизмы действия // Хим.-фарм. журн1983.— № 10,—
С. 1159-1169.
13. Зайцев Ю. В., Вислобоков А. И. Влияние этимизола и некоторых производных антифеинов на ионные токи изолированных нейронов прудовика // Докл.
АН СССР,- 1982.- Т. 262.- № 2.- С. 489-491.
14. Игнатов Ю. Д., Зайцев А. А. Нейрофизиологические механизмы боли // Болевой синдром / Под ред.
В. А. Михайловича и Ю.Д. Игнатова.— Л., 1990,—
Гл. 1,— С. 7-44.
15. Игнатов Ю.Д, Зайцев А. А., Михайлович В. А., Страшное В. И. Адренергическая анальгезия,—
СПб.: Ант-М, 1994,- 215 с.
16. Костенко М. А. Выделение одиночных нервных клеток мозга моллюска Ьутпаеа з1адпаИз для дальнейшего культивирования их ¡п мКо // Цитология - 1972,- Т. 14,- №28,- С. 1274-1278.
17. Костюк П. Г. Кальций и клеточная возбудимость,— М.: Наука, 1986 - 255 с. -
18. Костюк П. Г., Вислобоков А. И., Дорошенко П. А., Лукьянец Е. А., Манцев В. В. Действие 3,5-диамино-
1-тиа-2,4-диазола на электровозбудимую мембрану нервных клеток моллюсков // Биол. мембраны,— 1988,- Т. 5- № 12.- С. 1297-1303.
19. Костюк П. Г., Крыштапь О. А. Механизмы электрической возбудимости нервной клетки,— М.: Наука, 1981,- 204 с.
20. Крутецкая 3. И,, Лонский А. В. Биофизика мембран,— СПб., 1994,—.288 с.
21. Крыштапь О. А., Пидопличко В. И. Анализ флуктуаций тока, отводимого от малых участков мембраны сомы нервной клетки // Нейрофизиология,— 1977,— Т. 9,— С. 644-646.
22. Розенштраух Л. В., Анюховский Е. П.,
Белошанко Г. Г., Дремин С. А., Чихарев В. Н., Лысковцев В. В.,Сенова 3. П. Уменьшение быстрого входящего натриевого тока — причина антиаритмического действия этмозина, диэтиламинового аналога этмозина, мекситила и лидокаина в поздней стадии экспериментального инфаркта миокарда // В кн.: Внезапная смерть / Под ред. Винхерта А. М., Лаука Б. — М.: Медицина,
1982.- С. 95-112.
23. Савоськин А. Л., Вислобоков А. И. Влияние клофелина, гуанфацина и соединения SHA-9 на трансмембранные ионные токи нейронов прудовика // Экспериментальная и клиническая фармакология,— 1999,— Т. 62.— № 6,— С. 20-22.
24. Сергеев П. В., Шимановский Н. Л. Рецепторы физиологически активных веществ. — М.: Медицина, 1987.- 400 с.
25. Ходоров Б. И. Проблема возбудимости.— Л.: Медицина, 1969,— 301 с.
26. Ходоров Б. И. Фармакологический анализ инактивации натриевых токов в мембране нервного волокна // Нейрофизиология,— 1980,—Т. 12,—
№ 3,- С. 317-331.
27. Ходоров Б. И. Функциональная архитектура потен-циалуправляемых натриевых каналов клеточной мембраны // Всесоюзная конференция по нейронаукам.— Тез. докл.— Киев, 1986.— С. 13-14.
28. Boehm S.,Huck S. Inhibition of N-type calcium channels: the only mechanism by which presynaptic alpha
2-adrenoceptors control sympathetic transmitter release // Eur. J. Neurosci.— 1996.— Vol. 8,— N 9,—
P. 1924-1931.
29. Caterall W. A. Cellular and molecular biology of voltage gated sodium channels // Physiol. Rev.— 1992.—
Vol. 72,- N4,-P. 15-347.
30. Caterall W. A. Molecular properties of Na* and Ca2+ channels // J. Bioenergetics and Biomembranes.— 1996 - Vol. 28- N 3 - P. 219-230.
31. Cribbs L. L., Gomora J. C., Daud A. N, Lee J.-H., Perez-Reyes E. Molecular cloning and functional exs-pression of Can3.1c, a T-type calcium channel from human brain // FEBS Lett.- 2000,- Vol. 466,- P. 54-58.
32. Duggan A. IV., North R. A. Electrophysiology of opioids //Pharmacol.— Rev. 1983,— Vol. 35.— P. 219-282.
33. Endoh Т., Suzuki T. The regulating manner of opioid receptors on distinct types of calcium channels in chamster submandibular ganglion cells // Archives of Oral Biology.- 1998.- Vol. 43,- N 3,- P. 221-233.
34. Hamill O. P., Marty A., Neher E. et al. Improved patch-damp techniques for high-resolution current recording from cell-free membrane patches // Pflug. Arch.- 1981,- Vol. 391.- N 1,- P. 85-100.
35. Hille B. Ionic channel of exitable membranes.— Masachusetts, 1992,— 594 p.
36. Hille B. The permeability of the sodium channel, to metal cations in myelinated nerve // J. Gen.— Physiol. 1972,- Vol. 59,- P.- 637-658.
37. Hodgkin A. L, Huxley A. F. Currents carried by sodium and potassium ions throagh the membrane of giant axon of Loligo // J. Physiol.— 1952.— Vol. 116.— N4.- P. 449-472.
38. Isom L. L, DeJongh K. S., Catterall W. A. Axiliary subunits of voltage-gated ion channels // Neuron.— 1994.- Vol. 12.- P. 1183-1194.
39. Martin W. R. Pharmacology of opioids // Pharmacol. Rev.- 1983. N 35. P. 283-323.
40. Parkis M. A., Berger A. J. Clonidine reduces hyperpolarisation-activated inward current (Ih) in rat hypoglossal motoneurons // Brain Res.— 1997.—
Vol. 769.- N 9,- P. 108-118.
41. Simmons M. L, Chavkin C. k-Opioid receptor activation of a dendrotoxin-sensitive potassium channel mediates presynaptic inhibition of mossy fiber neurotransmitter release // Molecular Pharmacology.— 1996.— Vol.
50- N 1- P. 80-85.
42. Su X., Wachtel R. £, Gebhart G. F. Inhibition of calcium currents in rat colon sensory neurons by kuppa- but not mu- or delta-opioids //
J. Neurophysiol.— 1998,— Vol. 80.— N6,— P. 3112-3119.
43. Takano Y., Yaksh T.L. Chronic spinal infusion of dexmedetomidine, St-91 and clonidine: spinal alpha-2 adrenoceptor subtypes and intrinsic activity // J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1993,- Vol. 264.- P. 327-335.
