CC BY
60
раздел БИОЛОГИЯ и ЗООЛОГИЯ
УДК 581.143.5.
ББК28.4
ЦИТО-ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ФОРМИРОВАНИЯ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ОЧАГОВ В КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ ПШЕНИЦЫ
Зайнутдинова Э.М., Катасонова А.А.*
Показана возможность стимуляции морфогенетических процессов в каллусной ткани пшеницы путем использования экзогенных добавок и в зависимости от продолжительности культивирования.
Широкое применение методо в клеточных технологий в растениеводстве зависит от возможности осуществления конечного этапа - получения из культи вируемых клеток и тканей in vitro полноценных фертильных растений-регенерантов через соматический эмбриогенез на основе использования свойства тотипотент-ности растительных клеток. Однако регенерационная способность культи вируемых клеток очень низка, поэтому поиск путей акти вации морфогенеза является актуальной задачей, от решения которой зависит результативность работ по биотехнологии растений, связанных с процессами органогенеза и регенерации растений.
Регенерации растений из культи вируемых in vitro клеток и тканей в значительной степени определяется балансом фитогормонов. Предполагается, что одним из ведущих фитогормоно в, участвующих в соматическом эмбриогенезе из культи вируемых клеток растений, является абс-цизо вая кислота (АБК). Например, в культуре каллусной ткани ели [1], ячменя [2] и пшеницы [3] экзогенная АБК акти визирует образо вание рас-тений-регенеранто в. Значительная флюктуация содержания эндогенной АБК в растительной ткани в зависимости от морфофизиологического состояния культуры in vitro также с видетельст ву-ет о ее акти вной роли в процессе дифференциации клеток [4,5].
Таким образом, участие АБК в акти вации соматического эмбриогенеза оче видно. Однако клеточные механизмы влияния этого фитогормона на индукцию и процесс морфогенеза в культуре in vitro мало изучены. Особый интерес вы-зы вает изучение цито-гистологических аспекто в формиро в ания в каллусной ткани морфогенетических очаго в, дающих начало растениям-регенерантам, при различных концентрациях АБК. В этой связи задачей наших исследо ваний являлся цито-гистологический анализ каллусной ткани пшеницы с целью выявления влияния экзогенной АБК на индукцию морфогенетических очаго в в культи вируемых in vitro тканях.
Maтеpиaпы и мєт oды иccледoвaния
^льтуру каллусной ткани получали из незрелых зародышей яро вой мягкой пшеницы ((Triticum aestivum L.) сорта Симбирка на среде Мурасиге и Скуга [б], содержащей 0,7 C агара «Serva» (ФРГ), 3 C сахарозы, 2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), 0,2 мг/л кинетина согласно описанию [7]. Для индукции морфогенеза каллусную ткань переносили на исходную среду с экзогенной AБK в концентрации с 1 до 2 мг/л. Фиксацию каллуса и пригото в-ление постоянных цитологических препарато в про водили согласно методике, изложенной в работе [8]. Полученные постоянные препараты каллусов просматривали с применением свето-в ого микроскопа Jenamed 2 (Carl Zeiss, Jena) при различном увеличении объектива с использованием зеленого светофильтра. Препараты фото-графиро вали при помощи цифровой камеры «Olympus C-ЗОЗО» (Nicon Corporation, Japan).
Рєзульт aт ы и oбcyждение
При культи виро вании незрелых зародышей яро вой мягкой пшеницы на среде для каллусо-образования через 5-7 сут получена каллусная ткань, которая предста вляет собой плотное желтоватое образование. Цитологический анализ такого каллуса показал, что его клетки достаточно однородны, вакуолизиро ваны, имеют плотную стенку.
В опытных вариантах такую каллусную ткань переносили на питательные среды с добавлением AБK в различной концентрации. ^н-тролем служили каллусы, перенесенные на исходную питательную среду.
Обнаружено, что во всех вариантах эксперимента и в контроле отмечено образование морфогенетических очагов в каллусе. Результаты цито-гистологического исследо вания каллусо в в динамике раз вития in vitro на питательных средах с различной концентрацией AБK представ-ленны в таблице №1. ^к видно, количест в о образо ва вшихся морфогенетических очагов в каллусах за висит как от концентрации AБK в культуральной среде, так и от продолжительности культивирования.
*Зaйнyтдинoвa Эльвиpa Mypaтoвнa- acпиpaнт биoлoгичеcкoгo фэкультетг БгшГУ Kaтacoнoвa Аннг Aлекcaндpoвнa-cтyденткa 5 xypca биoлoгичеcкoгo фaкyльтетa БaшГУ.
Вестник Башкирского уни в ерситета. 2004. №2.
65
Таблица №1
Число морфогенетических очаго в в каллусах пшеницы при культи виро вании in vitro на питательных средах с различной концентрацией АБК
Продолжительность культивирования, сут Юэнцентрация AБK в питательной среде, мг/л
0,0 контроль 1,0 2,0 З,0
1 - - 1 -
5 1 З 6 1
10 2 4 6 1
15 2 4 7 1
20 2 5 8 1
По данным цито-гистологического анализа, морфогенетический очаг предста влен тремя зонами клеток (рис.1). I зона клеток располагается по периферии очага, состоит из крупных рыхлых клеток с крупными вакуолями; ядра достаточно крупные, занимают пристенное положение. II зона клеток занимает основной объем очага, состоит из более мелких меристематических клеток с крупными ядрами, хорошо связы вающими краситель; вакуоли отсутствуют. III зона располагается в центре очага и также предста влена ме-ристематическими клетками, в которых отмечено появление в акуолей.
Таким образом, морфогенетический очаг состоит гла вным образом из недифференциро в ан-ных меристематических клеток, способных к дальнейшему раз витию. В контрольном в арианте появление первого морфогенетического очага отмечено на 5 сут культи виро вания. На 10 сут культивирования формируется дополнительный морфогенетический очаг (рис.2). Далее, вплоть до окончания культи виро вания, новых морфогенетических очаго в не обнаружено.
В опытном в арианте с концентрацией АБК в 1,0 мг/л поя вление морфогенетических очаго в отмечено также на 5 сут культи виро в ания, однако их обнаружено не более трех. На 10 сут культи виро в ания количест в о морфогенетических очаго в у в еличи в ается до 4 , на 20 сут - до 5.
При культи виро вании эмбриогенных каллу-со в на такой питательной среде с концентрацией АБК в 2,0 мг/л появление морфогенетических очаго в отмечено уже на 1 сут. Далее, в процессе культи виро вания, количество морфогенетических очаго в резко возрастает: на 5 сут - до 6 очаго в , на 15 сут - до 7 очаго в, на 20 сут - до 8 очаго в (рис. 3).
При концентрации АБК 3,0 мг/л поя вление единичных морфогенетических очаго в отмечено на 5 сут. В ходе дальнейшего культи вирования их количест в о не в озрастает.
На основании анализа полученных данных по изучению влияния экзогенной АБК на особенности формиро в ания морфогенетических
очаго в в эмбриогенном каллусе пшеницы in vitro можно сделать следующие вы в оды:
1. Экзогенная АБК при относительно низких концентрациях оказы в ает стимулирующее влияние на формиро в ание морфогенетических очаго в в каллусе.
2. Морфогенетический очаг представлен
главным образом недифференциро ванными ме-ристематическими клетками, способными к
дальнейшему раз витию.
3. Количество морфогенетических очаго в в эмбриогенном каллусе за висит как от концентрации экзогенной АБК, так и от продолжительности культи виро в ания.
Таким образом, максимальное количест во морфогенетических очагов в эмбриогенном каллусе отмечено при использовании экзогенной АБК в концентрации 2,0 мг/л при культи виро вании в течение 20 сут. Такой режим культивирования оптимален для формиро вания большого количест ва морфогенетических очаго в в каллус-ной ткани данного сорта пшеницы; он способствует по вышению регенерационной способности культи вируемой каллусной ткани и может быть использован при различных технологиях, связанных с регенерацией растений, например, при клеточной селекции, соматической гибридизации и генно-инженерных экспериментах.
В литературе описаны различные предста в-ления о механизмах модифицирующего действия АБК на морфогенетические процессы. Одним из механизмо в повышения эмбриогенного статуса культи вируемых клеток и тканей в присутствии АБК является снижение содержания эндогенной ИУК [9], что при водит к изменению гормонального баланса, способствующего соматическому эмбриогенезу. Другие механизмы модифицирующего метаболизм действия АБК, заключаются в изменении синтеза аминокислот и ферменто в [10], изменение уро вня Са++ в цитоплазме [11], что, в озможно, при водит к событиям, стимулирующим созревание соматических эмбриоидов и по вышению выхода растений-регенеранто в.
Рис.1. Морфогенетический очаг в каллусной Рис.2. Морфогенетические очаги в кал-
ткани пшеницы. Световая микроскопия. б) лусной ткани пшеницы на 10 и 20 сут куль-
хбОО. тивирования в контрольном варианте. Све-
Рис.3. Морфогенетические очаги в каллусной ткани пшеницы на 5 сут культивирования на фоне абсцизовой кислоты (2 мг/л.). Световая микроскопия. х 80.
ЛИТЕРАТУРА
1. Arnold S., Hakman I. Regulation of somatic embrio development in Picea abies by Abscisic acid (ABA). J. Plant. Physiol. 1988. v. 132. N2. p. 164 - 169.
2. Rengel Z. Effect of abscisic acid on plant development from Hordeum vulgare L. embriogenetic callus. // Biochem. Physiol. Pflanzen. 1986. v. 181. N 9.p. 605 -611.
3. Qureshi J.A., Kartha K.K., Abrams S.R. et al. Modulation of somatic embryogenesis in early and late stage embryos of wheat (Triticum aestivum L& under the influence of ( ± ) abscisic acid and its analogs // Plant Cell, Tissue and Organ Cult.. 1989. V.18. N.1. P.55-69.
4. Tang G., Li W. The changes of several endogenous phytohormones during the formation of embryogenic callus and non-embryogenic callus in Angeluca polymorfa in vitro// Acta biol.exp.sin. 1995. V.28. N.2. P.203-208.
5. Trinchant J., Page-Degivry M. Dynamics of endogenous ABA during the growth cycle of cell suspension cultures of Amaranthus tricolor //Plant Physiol. 1994V.105. N.1 Suppl. P.143.
6. Murashige T., Skoog F. A revised medium for repid growth and bioassays with tobacco cultures// Physiol. Plant. 1962. V.15. N3. P. 473-497.
7. Суханов В.М., Папазян Н.Д. Условия получения каллуса и регенерантов в культуре незрелых зародышей пшеницы. В кн.: Апомиксис и цитоэмбриология растений. Саратов, 1983, вып.5. 124-128.
8. Паушева З.П.Практикум по цитологии растений. М., Колос, 1988, 380 с.
9. Шаяхметов И.Ф., Шакирова Ф.М. Формирование соматических эмбриоидов в суспензионной культуре клеток пшеницы в присутствии АБК//Физиология растений. 1996. Т.43. №1. С. 101 -103.
10. Fermin P., Lilian V., Milton A., et al. Regulation of acyltransferase activity in immature Maize embryos by ABA and the osmotic environment//Phlant Physiol. 1997. V.114. N.3. P.1095-1101.
11.Allen G.J., Kuchitsu K.,Chu S.P., et al. Arabidopsis abi1-1 and abi2-1 phosphatase mutations reduce ABA-induced cytoplasmic calcium rises in guard cells//The Plant Cell. 1999. V.11. N.9. P.1785-1798.
Поступила в редакцию 23.01.04 г.
