CC BY
88
ОСОБЕННОСТИ МОРФОГЕНЕЗА СТРУКТУРНЫХ
ЭЛЕМЕНТОВ НЕЗРЕЛЫХ ЗАРОДЫШЕЙ ЛИНИЙ ПШЕНИЦЫ, КУЛЬТИВИРУЕМЫХ IN VITRO
В. А. Спивак, К. И. Минликаева, Н. В. Евсеева*, О. В. Ткаченко**, Ю. В. Лобачев**
Саратовский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского, 410012, Саратов, Астраханская, 83 E-mail: [email protected]
*Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, 410049, Cаратов, пр. Энтузиастов, 13 E-mail: [email protected] **Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова, 410600, Саратов, Театральная пл., 1
В работе представлены результаты изучения морфогенеза структурных элементов незрелых зародышей двух сестринских линий пшеницы, культивированных in vitro на агаризованной питательной среде, содержащей липо-полисахарид.
Ключевые слова: незрелые зародыши, эмбриоиды, меристематическая активность, липополисахарид (ЛПС), сестринские линии пшеницы.
FEATURES OF MORPHOGENY OF STRUCTURAL ELEMENTS OF IMMATURE EMBRYOS OF LINES WHEAT, CULTIVATED IN VITRO
V. A. Spivak, K. I. Minlikayeva, N. V. Evseeva, O. V. Tkachenko, Yu. V. Lobachev
The paper presents the results of a study of the structural elements of morphogenesis of immature embryos of two nursing wheat lines cultured in vitro on agar medium containing lipopolysaccharide.
Key words: immature embryos, embryos, meristematic activity, lipopolysac-charide (LPS), wheat sister lines.
Успех культивирования растительных объектов in vitro определяется созданием условий для реализации эксплантами их морфогенетического
потенциала. Повышение эффективности культивирования растений, как правило, достигается с помощью различных физических и химических факторов. Введение в технологический процесс ассоциативных бактерий, метилотрофных и рода Azospirillum, способствовало активации роста и развития растений in vitro, более того, повышало адаптацию культу -ральных регенерантов к условиям in vivo (Каляева и др., 2001; Каляева и др., 2003; Волкогон и др., 2006).
Однако инокуляция растений целыми бактериальными клетками в условиях in vitro связана с методическими сложностями (Ильчуков, 2012). В связи с этим представляется целесообразным оценить реакцию эксплантов на отдельные компоненты бактериальной клетки, участвующие во взаимодействиях растений и бактерий. Ранее установили, что липополисахарид (ЛПС) наружной мембраны ассоциативных бактерий рода Azospirillum является одним из активных компонентов бактериальной клетки, определяющим контактные взаимодействия с корнями растений (Федоненко и др., 2001), принимающим участие в процессах, индуцирующих ответные реакции растений (Matora, 1995; Evseeva et al., 2011).
Целью данной работы являлось изучение морфогенеза структурных элементов незрелых зародышей двух сестринских линий пшеницы, культивируемых in vitro на питательной среде, содержащей ЛПС.
Материал и методика
Исследования проводили в 2010-2012 гг. на базе кафедры микробиологии и физиологии растений СГУ, лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН и кафедры растениеводства, селекции и генетики СГАУ
Объектом исследования являлись незрелые зародыши генетической модели, представленной двумя почти изогенными линиями сорта яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) Саратовская 29. Линии различались по высоте растений. Одна из них обладает аллелью гена редукции высоты побега (RhtB1c) и является высокоэмбриогенной, а другая - сла-боэмбриогенный высокорослый сиб (аллель RhtB1a). Данные изогенные линии получены Ю. В. Лобачевым методом возвратных скрещиваний (Лобачев, 2000).
Работа проводилась по классическому варианту клеточных превращений в культуре in vitro незрелых (14-суточных) зародышей пшеницы
путем непрямого соматического эмбриогенеза, когда регенерант возникает из каллуса (Тиссера, 1989). В чашки Петри на поверхность питательной среды помещали по 15 зародышей щитком вверх на агаризованную среду Линсмаэра и Скуга (ЛС), содержащей 2 мг/л 2,4-Д и 30 г/л сахарозы (контрольный вариант) для получения эмбриогенного каллуса. Культивирование осуществляли в факторостатных условиях при температуре 25-28 оС и отсутствии света. Опытные трансплантаты культивировали при тех же условиях, но с добавлением в среду ЛС, помимо прочего, препарат ЛПС бактерий А. Ьга^Ивтв 8р245 в концентрациях 1, 10 и 100 мг/л, который был выделен из наружной мембраны бактерий и любезно предоставлен нам старшим научным сотрудником лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН Г. Л. Бурыгиным. Через 30 суток культивирования методом визуального контроля оценивали количество всех образовавшихся каллусов и каллусов с очагами меристематической активности, а также определяли сырую массу разных типов каллусов в контрольных и опытных вариантах. Далее морфогенные каллусы переносили на ту же среду, но без 2,4-Д, а с 0,5 мг/л индолил-3-уксусной кислоты и 0,5 мг/л кинетина для регенерации органов растений, содержащей различные концентрации ЛПС. Морфологические параметры регенерантов определяли через 20 суток.
Результаты и их обсуждение
Первое анатомо-морфологическое описание культивируемых незрелых зародышей обеих линий и отбор объектов для гистологических исследований проводили на 7-е сутки культивирования. Анатомический анализ эксплантов показал, что важной особенностью состояния структурных элементов зародыша исследуемых линий в контрольном варианте являлось увеличение пролиферативной активности клеток и тканей узловой зоны первого листа, а также зоны перехода побег-корень, что хорошо просматривается на срезах регенерантов обеих линий (рис. 1). В основном каллусогенную активность проявляли клетки формирующихся проводящих пучков. Ткани верхней части колеоптиля и первого листового примордия в виду дифференциации клеточных структур не проявляли меристематическую активность. Исследование фиксированных зародышей, помещённых в раствор глицерина (рис. 2), позволило установить местоположение зон меристематической активности в средней части жилок колеоптиля и первого листа. Это объясняется тем, что клетки прово-
дящих пучков сохраняют меристематическую активность в зонах расположения интеркалярной меристемы, обеспечивая, таким образом, рост и развитие зародышевых структур. Не менее активны и клетки щитка.
а б
Рис. 1. Меристематическая активность тканей зародышей обеих линии пшеницы на 7-е сутки культивирования, контроль: а - низкорослая линия; б - высокорослая линия;
----границы зон
Рис. 2. Морфологическое состояние структурных компонентов зародыша низкорослой линии на 7-е сутки культивирования, контроль: 1 - промежуточные и 2 - большой проводящий пучок колеоптиля; 3 - колеориза; 4 - верхняя и 5 - нижняя часть щитка;
6 - эпибласт
4
2
5
3
Реакция паренхимных тканей изолированных зародышей исследуемой линии, находящихся в области узловой зоны перехода стебля в корень, колеоризы и эпибласта, заключалась в гипертрофии клеток, что указывало на отсутствия меристематической активности. Факт растяжения клеточных стенок свидетельствовал о ауксиновой зависимости этого процесса. Причем данная ответная реакция типична для полиплоидных и дифференцированных клеток. Аналогичная реакция тканей наблюдалась и у высокорослой линии с аллелью гена КЫШ.
Введение в питательную среду ЛПС оказывало положительное влияние на меристематическую активность клеток в узловой зоне первого листа, а также в зоне перехода побег-корень культивируемых в течение недели зародышей. Это обусловлено увеличением очагов или локусов меристематической активности в тех же самых зонах, что ранее наблюдались в контрольных вариантах исследуемых генотипов (рис. 3).
Рис. 3. Меристематическая активность недельных эксплантов опытных зародышей исследуемых линий пшеницы: а - низкорослая линия; б - высокорослая линия; мл - меристематический локус
Пролиферация клеток в периферической части щитка зародышей продолжалась и на 15-е сутки культивирования, что обусловлено наличием в проводящих тканях меристематически активных клеток. При этом на основании анализа плотности клеточных структур четко выделяются зоны с неравномерной пролиферацией. Так, на периферийных участках формировалась каллусная ткань, состоящая из конгломерата гипертрофи-
рованных клеток с большими межклеточными пространствами. Максимальной меристематической активностью обладали клетки, расположенные в зоне проводящих пучков. В результате неравномерного развития наружные клеточные структуры растягивались, а внутренние быстро переходили к дифференциации, что приводило к закручиванию тканей щитка (рис. 4, а).
Подобный эффект был установлен и в контрольном варианте сестринского высокорослого сиба. Отличие состояло лишь в том, что у высокорослой линии было больше рыхлых каллусных клеток в области колеоризы (рис. 4, б).
Рис. 4. Морфологическое состояние структурных компонентов целых зародышей исследуемых линий пшеницы на 15-е сутки культивирования, контроль: а - низкорослая линия; б - высокорослый сиб; 1 - верхняя часть щитка; 2 - нижняя часть щитка;
3 - главный корень; 4 - колеориза
Добавление ЛПС в питательную среду приводило к удлинению коле-оптиля и первого листа изолированных зародышей, независимо от генотипа. Причем у низкорослой линии колеоптиль увеличивался в размере, но при этом утрачивал пространственную ориентацию, выражавшуюся в его закручивании. Потеря пространственной ориентации колеоптилем линии высокорослой пшеницы была менее заметна, хотя и в этом случае не наблюдалось сохранение абсолютной ориентации полярности. В зоне щитка происходило уплотнение клеток, однако четких различий в закладке эмбриогенных структур не обнаруживалось (рис. 5).
а
б
а б
Рис. 5. Морфологическое состояние структурных компонентов зародышей обеих линий пшеницы на 15-е сутки культивирования, опыт: а - низкорослая линия; б - высокорослый сиб; 1 - колеоптиль; 2 - щиток
На 21-е сутки культивирования изолированных зародышей в области щитка и отходящих от него тяжей в контрольном варианте обеих линий наблюдался соматический эмбриогенез, в результате которого образовались зародышеподобные структуры, напоминающие аналогичные структуры, сформированные при нормальном зиготическом эмбриогенезе. Единственным отличием их являлось то, что образовавшиеся эмбриоиды имели почечную организацию, т.е. не формировали корней (рис. 6).
В вариантах с добавлением в питательную среду ЛПС также не происходил ризогенез. Однако зародышеподобных структур в опытном варианте было много, но они имели меньшие размеры. При этом четко выделялись две области их массового возникновения - зона щитка и сближенных узлов.
Выход регенерантов от количества высаженных эксплантов на питательной среде с ЛПС по сравнению с контролем достоверно увеличивался. В варианте с высокорослой линией - начиная с концентрации 1 мг/л, в то время как у низкорослой линии при концентрациях 1 и 10 мг/л наблюдалось снижение, и только при 100 мг/л этот показатель приближался к контролю (таблица).
Рис. 6. Морфологическое состояние структурных компонентов целых зародышей исследуемых линий пшеницы на 21 день культивирования, контроль: а - низкорослая линия; б - высокорослый сиб; э - эмбриоиды
Влияние ЛПС на морфогенез в культуре соматических тканей
Вариант среды Генотип Общий выход каллусов,% от эксплантов Выход морфоген-ных каллусов, % от эксплантов Выход регене-рантов, % от эксплантов
Контроль ЖМ-В1с 94,9 17,1 10,93
ЖМ-В1а 97,5 14,1 2,17
ЛПС, 1 мкг/мл ЖМ-В1с 98,0 26,5 6,60
ЖМ-В1а 94,1 26,7 4,00
ЛПС, 10 мкг/мл ЖМ-В1с 100,0 29,7 8,40
ЖМ-В1а 100,0 24,63 4,05
ЛПС, 100 мкг/мл ЖМ-В1с 95,4 26,10 10,77
ЖМ-В1а 100,0 20,3 7,53
р факт. 0,539 3,838* 5,185*
НСР05по вариантам 0,000 8,643 4,297
Примечание. Приведены средние значения анализируемых показателей и наименьшая существенная разница при уровне значимости < 0,05. Достоверность различий по критерию Фишера обозначено знаком «*».
Таким образом, было установлено, что концентрация ЛПС 10 мг/л являлась наиболее оптимальной, так как ЛПС в этом случае оказывает положительное влияние не только на количество морфогенных каллусов, но и на выход регенерантов, прежде всего высокорослой слабоэмбрио-генной линии пшеницы.
Выводы
Наличие ЛПС в питательной среде приводило к заметному повышению морфогенного потенциала соматических клеток на 21-е сутки культивирования двухнедельных зародышей.
ЛПС A. brasilense Sp245 стимулировал увеличение очагов меристе-матической активности в узловой зоне первого листа, а также в зоне перехода побег-корень зародышей исследуемых генотипов.
Наибольшей физиологической активностью в отношении каллусных клеток высокорослой слабоэмбриогенной линии пшеницы обладал ЛПС в концентрации 10 мг/л.
Список литературы
Каляева М. А. и др. Стимуляция роста и морфогенеза растений in vitro ассоциативными метилотрофными бактериями // Физиология растений. 2001. Т. 48, № 1. С. 596-599.
Каляева М. А. и др. Влияние аэробных метилотрофных бактерий на морфогенез пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.) in vitro // Физиология растений. 2003. Т. 48, № 4. С. 595-599.
Волкогон В. В., Димова С. Б., Мамчур А. Е. Особенности взаимоотношений бактерий рода Azospirillum с растениями картофеля, культивируемыми in vitro // Сельскохоз. микробиология. 2006. № 3. С. 19-25.
Ильчуков В. В. Культивирование каллусной ткани пшеницы с азотофиксиру-ющими бактериями рода Azospirillum // Вестн. СГАУ 2012. № 6, С. 28-29.
Федоненко Ю. П. и др. Участие липополисахаридов азоспирилл во взаимодействии с поверхностью корней пшеницы // Микробиология. 2001. Т. 70, № 3. С. 384-390.
Matora L. Yu. Immunological properties of Azospirillum cell surface : the structure ogcarbogydrate antigens and evaluation of their involvement in bacteria-plant contact interaction // Azospirillum VI and Related Microorganisms : Genetics, Physiology, Ecology / eds. I. Fendrik, M. del Gallo, M. De Zamaroczy, J. Vanderleyden. Berlin : Springer, 1995. P. 377-382.
Evseeva N. V. et al. Effect of Azospirillum brasilense Sp245 lipopolysaccharide on the functional activity of wheat root meristematic cells // Plant and Soil. 2011. Vol. 346. P. 181-188.
ЛобачевЮ. В. Проявление генов низкорослости у яровых пшениц в Нижнем Поволжье. Саратов : Изд-во СГАУ, 2000. 264 с.
Тиссера Б. Эмбриогенез, органогенез и регенерация растений // Биотехнология растений : культура клеток / пер. с англ. В. И. Негрука ; предисл. Р. Г. Бутенко. М. : Агропромиздат, 1989. 280 с.
