CC BY
0
https://doi.org/10.31631/2073-3046-2024-23-1-5-41-50
Трансмиссионная электронная микроскопия биопленок Vibrio cholerae на хитин-содержащих субстратах
С. В. Титова*, И. Р. Симонова, Е. А. Меньшикова, В. С. Осадчая
ФКУЗ Ростовский-на-Дону Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, Ростов-на-Дону
Резюме
Актуальность. Эволюционно сложившаяся ассоциация Vibrio choIerae с хитином обеспечила устойчивость к стрессовым воздействиям и защиту от хищников. Образование биопленки служит важнейшим механизмом создания эффективной ассоциации холерного вибриона с хитином. Способность формировать биопленку у V. choIerae зависит от наличия токсин-коррегулируемых пилей адгезии (TCP), за синтез которых отвечают гены tcp A-F. Одним из ключевых методов исследования биопленок является микроскопия. Она позволяет визуализировать структурные элементы и изучать различные параметры биопленок и эффекты воздействия на них различных факторов. Цель. Определение эпидзначимости биопленкообразующей способности токсигенных штаммов по их морфологическим особенностям на хитин-содержащих субстратах. Изучение структурных различий биопленок холерных вибрионов tcpA+ и tcpA- штаммов на хитин-содержащих субстратах. Материалы и методы. В исследовании использованы штаммы холерных вибрионов, разные по токсигенности и происхождению. В своей работе мы применили трансмиссионную электронную микроскопию для оценки эпидзначимости процесса биопленкообра-зования V. choIerae на хитин-содержащих субстратах. Результаты. Показано, что холерные вибрионы tcpA+ и tcpA- штаммов способны образовывать биопленки на поверхности хитин-содержащих субстратов. Интенсивность образования биопленок более выражена у tcpA+ штаммов, т.к. клетки V. choIerae ctxA+tcpA+ в составе биопленки располагаются преимущественно одиночно и поверхность хитинового экзоскелета, с которой они контактируют, интактна, клетки V. choIerae ctxA-tcpA- в составе биопленки образуют цепочки, что указывает на процессы деления, а разрозненный хитин эндокутикулы свидетельствует об активности метаболических процессов. Заключение. Используемые в работе штаммы V. choIerae, независимо от наличия или отсутствия генов ctx и tcp, образуют биопленки на хитиновом субстрате. Показатель биопленкообразования по толщине матрикса биопленки выше у V. choIerae ctxA+tcpA+, по степени деградации хитинового субстрата выше у V. choIerae ctxAtcpA-. Холерные вибрионы, имеющие ген tcpA, обладают большей интенсивностью биопленкообразования, что, в свою очередь, указывает на эпидемическую значимость феномена биопленкообразования и свидетельствует о важной роли хитина для персистенции холерных вибрионов в условиях гидробиоценозов водоемов и возможности выживания и сохранения эпидемически значимых штаммов.
Ключевые слова: биопленка, Vibrio choIera, хитин, трансмиссионная электронная микроскопия Конфликт интересов не заявлен.
Для цитирования: Титова С. В., Симонова И. Р., Меньшикова Е. А. и др. Трансмиссионная электронная микроскопия биопленок Vibrio choIerae на хитин-содержащих субстратах. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2024;23(1):41-50. https:// doi:10.31631/2073-3046-2024-23-1-41-50_
Благодарность
Авторы выражают искреннюю благодарность научному сотруднику Головину Сергею Николаевичу, за непосредственное участие в подготовке проб для трансмиссионной электронной микроскопии.
Transmission Electronic Microscopy of Vibrio cholerae Biofilms on Chitin-Containing Substrates
SV Titova**, IR Simonova, EA Menshikova, VS Osadchaya
FKUZ Rostov-on-Don of the Order of the Red Banner of Labor Research Anti-PIague Institute of Rospotrebnadzor, Russia Abstract
Introduction. The evoIutionary association of Vibrio choIerae with chitin provided resistance to stress and protection from predators. The most important mechanism that provided V. choIerae with the effectiveness of association with chitin is biofiIm formation.
* Для переписки: Титова Светлана Викторовна, к. м. н., ведущий научный сотрудник лаборатории природно-очаговых и зоонозных инфекций, ФКУЗ Ростовский-на-Дону Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, д.117/40. +7 (863) 240-91-08, [email protected]. ©Титова С. В. и др.
** For correspondence: Titova Svetlana V., Cand. Sci. (Med.), leading researcher, laboratories of natural focal and zoonotic infections, FKUZ Rostov-on-Don of the Order of the Red Banner of Labor Research Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor, 117/40, st. M. Gorky, Rostov-on-Don, 344002, Russia. +7(863) 240-91-08, [email protected]. ©Titova SV, etal.
Practical Aspects of Epidemiology and Vaccine Prevention
The ability to form a biofilm in V. cholerae depends on the presence of a factor, toxin-corrected adhesion pili (TCP), which are synthesized by the tcp A-F genes. One of the key methods for studying biofilms is microscopy. It allows one to visualize the structural elements and study various parameters of biofilms and the effects of various factors on them. Aim. To determine the epidemiological significance of the biofilm-forming ability of toxigenic strains by their morphological characteristics on chitin-containing substrates. Study of structural differences in biofilms of Vibrio cholerae tcpA+- and tcpA- strains on chitin-containing substrates. Results. It has been shown that Vibrio cholerae tcpA+- and tcpA- strains are able to form biofilms on the surface of chitin-containing substrates. The intensity of biofilm formation is more pronounced in tcpA+ strains, because V. cholerae ctxA+ tcpA+ cells in the biofilm are predominantly singly located and the surface of the chitinous exoskeleton with which they are in contact is intact, V. cholerae ctxA-tcpA- cells form chains in the biofilm, which indicates division processes, and scattered chitin of the endocuticle indicates activity of metabolic processes. Conclusion. The strains of V. cholerae used in the work, regardless of the presence or absence of the ctx and tcp genes, form bioplecs on a chitin substrate. The indicator of biofilm formation in terms of the thickness of the biofilm matrix is higher in V. cholerae ctxA+tcpA+, in terms of the degree of degradation of the chitin substrate it is higher in V. cholerae ctxAtcpA-. Keywords: biofilms, Vibrio cholera, chitin, transmission electron microscopy No conflict of interest to declare.
For citation: Titova SV, Simonova IR, Menshikova EA, et al. Transmission electronic microscopy of Vibrio cholerae biofilms on chitin-containing substrates. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2024;23(1):41-50 (In Russ.). https://doi:10.31631/2073-3046-2024-23-1-41-50
Acknowledgement
The authors express their sincere gratitude to research fellow Sergei Nikolaevich Golovin for his direct participation in the preparation of samples for transmission electron microscopy.
Введение
Холерные вибрионы, являясь обитателями водной среды, неизменно сталкиваются с негативным воздействием многочисленных факторов: градиента питательных веществ, колебаний температуры, оксидативного стресса, вирулентных бактериофагов, хищных простейших и т.д. [1,2]. Однако эво-люционно сложившаяся ассоциация Vibrio cholerae с хитином - самым распространенным биополимером в водной среде, обеспечила им доступный источник азота и углерода, устойчивость к стрессовым воздействиям и защиту от хищников [3-5]. Важнейшим механизмом, обеспечившим холерным вибрионам эффективность ассоциации с хитином, является биопленкообразование [6,7]. Образование биопленки V. cholerae широко варьирует в зависимости от характеристик того или иного штамма, и одним из главных факторов, влияющих на этот процесс, является наличие токсин-коррегулируемых пилей адгезии (TCP), за синтез которых отвечают гены tcp A-F. Наличие пилей адгезии опосредует способность холерных вибрионов колонизировать поверхности различных субстратов, в частности - хитин-содержащих. Помимо TCP, в колонизации хитиновых субстратов играют роль маннозо-чувствительный гемагглютинин, хитин-ре-гулируемые пили [8,9] и два хитин-связывающих белка (36 и 53 кДа) [10]. TCP, помимо участия в адгезии, являются также рецепторами для умеренных фагов СТХф [11], опосредующих токсигенность холерных вибрионов, а связь с хитином, в свою очередь, индуцирует естественную компетентность клеток V. cholerae, способствуя горизонтальному переносу генов [12-14].
Значимым регулятором численности V. cholerae в водной среде являются простейшие [2,15]. При этом
холерные вибрионы в составе биопленок выработали стратегию защиты от хищников, которая заключается в Quorum sensing-регулируемом синтезе антипротозойных факторов и протеолитических ферментов, негативно воздействующих на простейших [16]. Биопленкообразование способствует персистенции холерных вибрионов в поверхностных водоемах.
Одним из ключевых методов исследования биопленок является микроскопия. Она позволяет визуализировать структурные элементы и изучать различные параметры биопленок и эффекты воздействия на них различных факторов. Для визуализации биопленок холерных вибрионов на хитине широко используются сканирующая электронная микроскопия и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия [17-20].
Цель работы - определить эпидзначимость биопленкообразующей способности токсигенных штаммов по морфологическим особенностям биопленок V. cholerae на хитин-содержащих субстратах, с выявлением структурных различий между биопленками ctxA+tcpA+ и ctxAtcpA- штаммов холерных вибрионов. Для достижения поставленной цели были поставлены задачи: методический подбор условий использования трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) для изучения биопленок холерных вибрионов на хитин-содержащих субстратах и подготовка биопленок на хитиновом субстрате для исследования с применением ТЭМ.
Материалы и методы
В исследовании использованы штаммы холерных вибрионов, разные по токсигенности и происхождению, полученные из лаборатории «Коллекция живых культур микроорганизмов»
ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. Токсигенные (ctxA+tcpA+); V. holerae О1 El Tor 18332, 19241, 19664, 19613, 5879. Нетоксигенные (ctxA-tcpAj; V. cholerae El Tor 20000, 19754; V. cholerae non O1/non O139 P-9741, 19860, 18141.
Холерные вибрионы культивировали на агаре Мартена (рН 7,6-7,8). Для экспериментов использовали 18-часовую агаровую культуру холерных вибрионов, которую суспендировали в стерильном натрий-фосфатном буфере (рН 7,2-7,4; до показателя мутности 0,5 ед. по шкале McFarland на приборе Densi-La-Meter II («ErbaLachema», Чехия).
Биопленки холерных вибрионов получали запатентованным способом [21]. В качестве субстрата для образования биопленок использовали фрагменты хитинового панциря толстопалого речного рака (Astacus pachypus) массой 100-110 мг, которые промывали проточной водопроводной водой и помещали во флаконы с 30 мл речной воды (р. Дон). Флаконы с содержимым автоклавировали при 0,11 МПа, 120 °С, 30 мин. Затем во флаконы вносили суспензию V. cholerae до конечной концентрации 104 м.к./мл и инкубировали при комнатной температуре в течение всего срока наблюдения (максимальный срок - 28 суток).
Контроль жизнеспособности микробных клеток определяли путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) в 0,1 мл микробной взвеси или в отпечатках биопленок на агаре Мартена (рН 7,6-7,8) после 24 часов инкубации при 37 оС.
На стадии зрелой биопленки (14 суток) производили пробоподготовку образцов для исследования методом трансмиссионной электронной микроскопии в соответствии с МУ 1.3.3103-13 «Организация работы лабораторий, использующих методы электронной и атомно-силовой микроскопии при исследовании культур микроорганизмов
1 — IV групп патогенности», запатентованным способом [22]. Фиксацию фрагментов хитиновых экзо-скелетов проводили в 2,5% растворе глутарового альдегида («AppliChem», Германия) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) в течение 2 часов при 4 °С и, после однократного отмывания в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4), проводили постфиксацию и контрастирование 1% раствором те-траоксида осмия (OsO4) («AcresOrganics», Бельгия) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) в течение
2 часов. Затем фрагменты хитина измельчали до размеров 2 х 2 мм и обезвоживали в растворах этанола восходящей концентрации (50°, 60°, 70°, 80°, абсолютный этанол) по 20 минут при 4 оС. Готовили эпоксидную смолу следующего состава: 1,12 мл Epon™812(«Sigma-Aldrich», США), 0,6 мл DDSA («Sigma-Aldrich», США), 0,65 мл MNA («Sigma-Aldrich», CIIIA), 0,03 мл DPM-30 («Sigma-Aldrich», США). Данной смолой производили пропитывание образцов (смесь смолы и ацетона 1:3-2 часа, смесь смолы и ацетона 1:1 - 12 часов, смесь смолы и ацетона 3:1-2 часа, чистая смола - 2 часа)
и последующую заливку в капсулы ВЕЕМ 1001В («StructureProbe, Inc.», США). Полимеризацию смолы проводили в термостате при 37 °С в течение 24 часов, затем при 60 °С в течение 48 часов.
Из полученных блоков с образцами при помощи ультратома LKB-III 8800 («LKBBromma», Швеция) изготавливали ультратонкие срезы толщиной 6070 нм, которые монтировали на медные сеточки («StructureProbe, Inc.№, США) в 0,3% водном растворе цитрата свинца («Sigma-Aldrich», США) с добавлением 0,01 М раствора гидроксида натрия.
После высушивания образцы исследовали методом ТЭМ в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-1011 («Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 100 кВ. Изображения получали при помощи CCD-камеры Olympus-SIS Veleta («Olympus Soft Imaging Solutions GmbH», Германия) с применением программного обеспечения Olympus ITEM ТЕМ Imaging Platfom («Olympus Soft Imaging Solutions GmbH», Германия). Все представленные ТЭМ-изображения являются репрезентативными для большого количества полученных изображений.
Результаты
Результаты исследования представлены в виде электронограмм на рисунках 1-6. Хитиновый экс-зоскелет состоит из трех слоев. На рисунке 1 представлены срезы хитинового экзоскелета Astacus pachiypus: 1a - срез нативного хитинового экзоскелета с отчетливо различимыми слоями: эпику-тикулой, экзокутикулой и эндокутикулой. Адгезия холерных вибрионов с последующим формированием биопленки происходит к верхнему слою хитинового экзоскелета. На рисунке 1б представлен срез хитинового экзоскелета с образовавшейся на его поверхности биопленкой холерных вибрионов. На этом изображении обращает внимание отсутствие верхних слоев хитинового экзоскелета, что свидетельствует об их лизисе холерными вибрионами, синтезирующими набор гидролитических ферментов [23,24]. Отсутствующие поверхностные слои хитинового экзоскелета способствовали лучшему заполнению смолой эндокутикулы при осуществлении пробоподготовки и ее контрастированию.
На рисунке 2 представлены ультратонкие срезы биопленок V. cholerae ctxA+tcpA+ штаммов (рис. 2а) и V. cholerae ctxAtcpA- штаммов (рис. 2б) на хитине. На изображении (рис. 2а) срез эндокутикулы имеет плотную однородную структуру темно серого цвета. Межклеточный матрикс расположен на поверхности хитина, в его толще распределены клетки холерных вибрионов. На рисунке 2б слой эндокутикулы тоже окрашен в темно-серый цвет и расположен выше слоя матрикса, но не имеет четкой границы, что хорошо видно при большем увеличении (х30000) на рисунке 3б, а клетки холерных вибрионов расположены цепочками, что указывает на процессы деления.
Рисунок 1. Хитиновые экзоскелеты Astacus pachypus Figure 1. Chitinous exoskeletons of Astacus pachypus
Примечание: а) ультратонкий срез нативного хитинового экзоскелета Astacus pachypus, увеличение х10000, маркер - 2 мкм; б) ультратонкий срез хитинового экзоскелета Astacus pachypus с биопленкой V. cholerae 19613 (показана стрелками), увеличение х 4000, маркер - 10 мкм. ТЭМ, контрастирование тетраокскдом осмия (VIII) и цитратом свинца. Обозначения: Эп - эпикутикула; Эк - экзокутикула; Эн - эндокутикула.
Note: a) ultrathin section of the native chitinous exoskeleton of Astacus pachypus, magnification х10000, marker - 2 ^m; b) ultrathin section of Astacus pachypus chitinous exoskeleton with V. cholerae 19613 biofilm (shown by arrows), magnification х 4000, marker - 10 ^m. TEM, staining with tetraoxide osmium (VIII) and lead citrate. Designations: Ep - epicuticle; Ek - exocuticle; En - endocuticle.
Рисунок 2. Ультратонкие срезы биопленок V. cholerae ctxA+tcpA+ и V. cholerae ctxA-tcpA- на хитиновом
экзоскелете
Figure 2. Ultra-thin sections of biofilms of V. cholerae ctxA+tcpA+ and V. cholerae ctxA-tcpA- on the chitinous exoskeleton
Примечание: а) биопленка V. cholerae Р-19613 ctxA+tcpA+ на хитиновом экзоскелете (стрелками показана мембраноподобная структура на поверхности матрикса), увеличение х10000, маркер - 2 мкм; б) биопленка V. cholerae 20000 ctxA'tcpA' на хитине, увеличение х10000, маркер - 2 мкм. ТЭМ, контрастирование тетраоксидом осмия (VIII) и цитратом свинца.
Note: a) biofilm of V. cholerae 19613 ctxA+tcpA+ on the chitinous exoskeleton (arrows show the membrane-like structure on the surface of the matrix, magnification -10000, marker 2 fjm; b) biofilm of V. cholerae 20000 ctxA-tcpA- on chitin, magnification x10000, marker - 2 ^m. TEM, staining with osmium (VIII) tetroxide and lead citrate.
Рисунок 3. Биопленки V. cholerae ctxA+tcpA+ и V. cholerae ctxA-tcpA- на хитиновом экзоскелете Figure 3. Biofilms of V. cholerae ctxA+tcpA+ and V. cholerae ctxA-tcpA- on the chitinous exoskeleton
Примечание: а) матрикс биопленки V. cholerae 19613 ctxA+tcpA+ (стрелками показана электроноплотная мембраноподобная структура на поверхности биопленки), увеличение 1x40000, маркер - 1 мкм; б) клетки в составе биопленки V. cholerae 20000 ctxA tcpA-, (матрикс биопленки не имеет четкой границы) увеличение Х30000, маркер - 1 мкм; в) биопленка V. cholerae 19241 ctxA tcpA- (стрелками показана объемная электроноплотная структура, сформировавшаяся на поверхности биопленки при длительном культивировании), увеличение Х6000, маркер - 5 мкм; г) деградация хитинового экзоскелета клетками V. cholerae 19754 ctxA tcpA- (матрикс биопленки не имеет четкой границы), увеличение Х12000, маркер - 2 мкм. ТЭМ, контрастирование тетраоксидом осмия (VSSS) и цитратом свинца.
Note: a) matrix of the biofilm V. cholerae 19613 ctxA+tcpA+, (arrows show an electron-dense membrane-like structure on the biofilm surface), marker - 1x40000; b) cells in the V. cholerae biofilm 20000 ctxA tcpA-, (the biofilm matrix does not have a clear border) x30000 magnification, marker - 1 ^m; c) biofilm V. cholerae 19241 ctxAtcpA-(arrows show the bulk electron-dense structure formed on the surface of the biofilm during long-term cultivation), magnification x6000, marker - 5 ^m; d) degradation of the chitinous exoskeleton by V. cholerae cells 19754 ctxA tcpA- (the biofilm matrix has no clear border), magnification x12000, marker - 2 ^m. TEM, staining with osmium (VSSS) tetroxide and lead citrate.
На основании этих данных нами определены следующие морфологические различия в структуре биопленок штаммов V. cholerae ctxA+tcpA+ и V. cholerae ctxA-tcpA-:
• Матрикс зрелой биопленки V. cholerae ctxA+tcpA+ штаммов более выражен на срезе, имеет
большую толщину и содержит большое количество электронноплотных складчатых структур по сравнению с биопленками нетоксигенных, апи-лированных штаммов, матрикс которых также представлен складчатыми структурами, но менее выраженными по электронной плотности;
Рисунок 4. Вторичные колонизаторы из состава биопленки V. cholerae 19241 Figure: 4. Secondary colonizers from the biofilm of V. cholerae 19241
Примечание:увеличениех 15000, маркер - 2 мкм. ТЭМ, контрастирование тетраоксидом осмия (VIII) и цитратом свинца.
Note: magnification х15000, marker - 2 ^m. TEM, staining with osmium (VIII) tetroxide and lead citrate.
• Холерные вибрионы в составе биопленки V. с1"ю1егае сОД^срА" штаммов активно делятся, на что указывает характерное расположение клеток в виде цепочек [25], в отличие от клеток токсигенных штаммов, которые располагаются одиночно.
• Поверхность матрикса биопленки токсигенных штаммов (рис. 3а), сообщающаяся с внешней средой (среда культивирования), представляет собой сплошной электронноплотный слой, образующий мембраноподобную структуру. Матрикс биопленки нетоксигенных, апилированных штаммов (рис. 3б) менее выражен и в некоторых местах не имеет четкой границы с внешней средой.
При дальнейшем культивировании биопленок V. ^о1егае до стадии дисперсии в биопленочных структурах происходят морфологические изменения, так толщина электронноплотной мембраноподоб-ной структуры, отделяющей биопленку V. ^о1егае ^хАЧсрА+ штаммов от внешней среды, значительно увеличивается (рис. 3в), в то время как препарат биопленки V. ^о1егае ^хА^срА- штаммов (рис. 3г) представлен отдельными фрагментами деградированного экзоскелета, между которыми располагаются бактериальные клетки, границы матрикса в образце не определяются. На поверхности хитинового экзоскелета, представленного на рисунке 4, наблюдаются клетки вторичных колонизаторов, отделившихся от первичной биопленки.
Эти клетки уже окружены электронноплотными фрагментами экстрацеллюлярного матрикса, образованного в составе первичной биопленки.
На рисунке 5 показано взаимодействие холерных вибрионов в составе биопленки с эндокути-кулой хитинового экзоскелета. Клетки V. cholerae ctxA-tcpA- штаммов (рис. 5б), помимо типичной для делящихся форм морфологии, активно деградируют хитин эндокутикулы, в то время как одиночные клетки V. cholerae ctxA+tcpA+ штаммов адгезирова-ны к поверхностным слоям хитина (рис. 5а, в, г).
На рисунке 6 представлены результаты измерения толщины биопленки V. cholerae ctxA+tcpA+ штаммов при помощи программного обеспечения ТЕМ imaging platform ITEM. Как показывает маркер на рисунках 6а, б и 6в толщина биопленок токсигенных штаммов составляет 5,6 и 7,9 мкм, при этом толщину биопленок V. cholerae ctxA-tcpA- штаммов точно измерить не удается ввиду отсутствия четких границ матрикса, однако по наличию неинтенсивных электронноплотных складчатых структур можно предположить, что толщина биопленки примерно равна 2,3 мкм, что соответственно меньше, чем у V. cholerae ctxA+tcpA+ штаммов (рис. 2б, 3б).
Обсуждение
В результате электронно-микроскопического исследования образцов биопленок холерных вибрионов ctxA+tcp+-- и ctxAtcpA- штаммов выявлены различия в биопленкообразовании взятых в эксперимент штаммов. Сравнительный анализ микрофотографий показывает, что образование биопленки на поверхности хитина у холерных вибрионов происходит независимо от наличия гена холерного токсина ctxA и токсин-коррегулируемых пилей адгезии tcpA, однако интенсивность био-пленкообразования у данных штаммов различна. Для оценки интенсивности биопленкообразования мы сравнивали следующие структурные особенности биопленок: толщину биопленки, электронно-плотность матрикса, морфологию клеток в составе биопленки и степень деградации хитинового субстрата. Исходя из полученных данных, токсигенные штаммы V. cholerae с наличием гена tcpA+ обладают большей интенсивностью биопленкообразования, чем нетоксигенные, у которых ген tcpA отсутствует. На это указывают большая толщина биопленки, объем и плотность матрикса. Активность холерных вибрионов в составе биопленок также различна. Если клетки в составе биопленки V. cholerae ctxA+tcpA+ располагаются преимущественно одиночно и поверхность хитинового экзоскелета, с которой они контактируют, интактна, то клетки в составе биопленки V. cholerae йхА^рАюбразуют цепочки, что указывает на процессы деления, а разрозненный хитин эндокутикулы свидетельствует об активности метаболических процессов.
Данный факт согласуется с результатами, опубликованными ранее авторами [3-5,16,17,26,27], показывающими, что холерные вибрионы, имеющие
Рисунок 5. Взаимодействие клеток V. cholerae в составе биопленок с поверхностью субстрата Figure 5. Interaction of V. cholerae cells in biofilms with the substrate surface
Примечание: а) адгезия клеток V. cholerae 19613 ctxA+tcpA+ к поверхности хитинового субстрата (стрелка указывает место прикрепления клетки к субстрату), увеличение Х80000, маркер - 500 нм; б) деградация хитина клетками V. cholerae 20000 ctxAtcpA-, увеличение Х60000, маркер - 500 нм; в) адгезия клеток V. cholerae 19241 ctxA+tcpA+ к поверхности хитинового субстрата на ранних стадиях культивирования биопленки, стрелки указывают на зоны лизиса эпикутикулы, увеличение Х30000, маркер - 1 мкм; г) зрелая биопленка V. cholerae 19241 ctxA+tcpA+ (стрелками показаны отсутствующие поверхностные слои хитинового экзоскелета в области формирования биопленки, маркер красного цвета), увеличение Х30000, маркер - 1 мкм. ТЭМ, контрастирование тетраоксидом осмия (VSSS) и цитратом свинца.
Note: a) adhesion of V. cholerae 19613 ctxA+tcpA+ cells to the chitin substrate surface (the arrow indicates the place of cell attachment to the substrate), magnification x 80000, marker - 500 nm; b) degradation of chitin by V. cholerae cells 20000 ctxA tcpA-, magnification x 60000, marker - 500 nm; c) adhesion of V. cholerae 19241 ctxA+tcpA+ cells to the surface of the chitin substrate at the early stages of biofilm cultivation, arrows indicate the epicuticle lysis zones, magnification x 30000, marker -1 ^m; d) mature biofilm of V. cholerae 19241 ctxA+tcpA+ (arrows indicate the missing surface layers of the chitinous exoskeleton in the region of biofilm formation, red marker), magnification x 30000, marker - 1 ^m. TEM, staining with osmium (VSSS) tetroxide and lead citrate.
ген ХсрА, обладают большей интенсивностью биопленкообразования, что, в свою очередь, указывает на эпидемическую значимость феномена биопленкообразования и свидетельствует
о важной роли хитина для персистенции холерных вибрионов в условиях гидробиоценозов водоемов и возможности выживания и сохранения эпидемически значимых штаммов. Интенсивность
Practical Aspects of Epidemiology and Vaccine Prevention
Рисунок 6. Биопленки V. cholerae ctxA+tcpA+ Figure 6. Biofilms V. cholerae ctxA+tcpA+
Примечание: а) биопленка V. cholerae 19613 ctxA+tcpA+ (толщина биопленки 5,6 мкм), увеличениех10000, маркер - 2 мкм; б) биопленка V cholerae 19241 (толщина биопленки 7,9 мкм), увеличение х8000, маркер - 5мкм; в) биопленка V. cholerae 20000 ctxAtcpA- (толщина биопленки 2,3 мкм), увеличение х12000, маркер -2 мкм. ТЭМ, контрастирование тетраоксидом осмия (VIII) и цитратом свинца.
Note: a) biofilm V. cholerae 19613 ctxA+tcpA+ (biofilm thickness 5,6 ^m), magnification х10000, marker - 2 ^m; b) biofilm V cholerae 19241 (biofilm thickness 7,9 ^m), magnification х8000, marker - 5 ^m; c) V. cholerae 20000 ctxA tcpA- biofilm (biofilm thickness 2,3 ^m), magnification х12000, marker - 2 ^m. TEM, staining with osmium (VIII) tetroxide and lead citrate.
биопленкообразования у нетоксигенных штаммов V. cholerae, не содержащих ген tcpA, менее выражена, однако биопленкообразующая способность у них сохранена, что, по некоторым данным, указывает на то, что TCP при биоплен-кообразовании принимают участие в межклеточном взаимодействии, усиливая quorum sensing, а адгезия к субстрату осуществляется в основном
за счет хитин-коррегулируемых пилей, маннозо-чувствительного гемагглютинина и хитин-связы-вающих белков. Более ранняя активация quorum sensing у tcpA+ штаммов способствует большей интенсивности биопленкообразования и раннему переходу клеток в покоящееся состояние по сравнению с tcpA- штаммами, что может приводить к искажению результатов эпидемиологических
Practical Aspects of Epidemiology and Vaccine Prevention
обследований и мониторинга состояния природных водоемов.
Заключение
Используемые в работе штаммы V. ^о1егае, независимо от наличия или отсутствия генов йх и ^р, образуют биопленки на хитиновом субстрате. Показатель биопленкообразования по толщине матрикса биопленки выше у V. ^о1егае ^хАЧсрА+,
по степени деградации хитинового субстрата выше у V. ^о1егае оМ^срА- Холерные вибрионы, имеющие ген 1:срА, обладают большей интенсивностью био-пленкообразования, что, в свою очередь, указывает на эпидемическую значимость феномена биопленко-образования и свидетельствует о важной роли хитина для персистенции холерных вибрионов в условиях гидробиоценозов водоемов и возможности выживания и сохранения эпидемически значимых штаммов.
Литература
1. Silva A.J., Benitez J.A. Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis //PLOS Neglected Tropical Diseases. 2016. Vol. 10, N2. DO!: https://doi.org/l0.l37l/journal. pntd.0004330
2. Rahman H., Mahbub K.R., Vergara G.E., et al. Protozoal food vacuoles enhance transformation in Vibrio cholerae through SOS-regulated DNA integration // The !SME Journal. 2022. Vol. 16. Р. 1993-2001. DO!: https://doi.org/10.1038/s41396-022-01249-0
3. Pruzzo C, Vezzulli L, Colwell R.R. Global impact Vibrio cholerae interactions with chitin //Environ. Microbiol. 2008. Vol. 10. P. 1400-1410. DO!: https://doi:10.1111/j.1462-2920.2007.01559.x
4. Vezzulli L, Guzman C.A., Colwell R.R., Pruzzo C. Dual role colonization factors connecting Vibrio cholerae's lifestyles in human and aquatic environments open new perspectives for combating infectious diseases//Curr. Opin. Biotechnol. 2008. Vol. 19. DO!: http://dx.doi.org/10.1016/j.copbio.2008.04.002
5. Vezzullia L., Grandea C, Reidb P.C., et al. Climate influence on Vibrio and associated human diseases during the past half-century in the coastal North Atlantic. Proc Natl Acad Sci USA. 2016. Vol. 23, N113(34). P 5062-5071. DO!: https://doi:10.1073/pnas.1609157113
6. Меньшикова Е. А, Курбатова Е. М., Титова С. В. Экологические особенности персистенции холерных вибрионов: ретроспективный анализ и современное состояние проблемы. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2020. T.97, №2. C. 165-173. DO!: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-2-165-173; !SSN0372-9311
7. Меньшикова Е. А, Курбатова Е. М., Водопьянов С. О. и др. Оценка способности холерных вибрионов формировать биопленку на поверхности хитинового панциря речного рака. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2021. Т. 98, №4. C. 434-439. DO!: https://doi.org/10.36233/0372-9311-99.
8. Meibom K.L., Li X.B., Nielsen AT, et al. The Vibrio cholerae chitin utilization program. Proc. Natl. Acad. ScL USA. 2004. Vol. 101. P. 2524-2529. DO!: https:// doi:10.1073/ pnas.0308707101
9. Sinha-Ray S., Ali A. Mutation in flrA and mshA genes of Vibrio cholerae inversely involved in vps - independent biofilm driving bacterium toward nutrients in lake water. Water. Front. Microbiol. 2017. Sec. Aquatic Microbiology. DO!: https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01770
10. Kirn T.J., Jude B.A., Taylor R.K. A colonization factor links Vibrio cholerae environmental survival and human infection. Nature. 2005. Vol. 438. P. 863-866. DO!: https://doi: 10.1038/ nature04249
11. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. Science. 1996. Vol. 272. P. 1910-1914. DO!: https:// doi: 10.1126/наука. 272.5270.1910
12. Meibom K.L, Blokesch M., Dolganov N.A., et al. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 2005. Vol. 310. P. 1824-1827. DO!: https:// doi: 10.1126/sci-ence.1120096
13. Mondal M., Chatterjee N.S. Role of Vibrio cholera exochitinase ChiA2 in horizontal gene transfer Can. J. Microbiol. 2016. Vol. 62, N3 P. 201-209. DO!: https://doi: 10.1139/ cjm-2015-0556
14. Metzger LC, Blokesch M. Regulation of competence-mediated horizontal gene transfer in the natural habitat of Vibrio cholera. Curr Open Microbiol. 2016. Vol. 30. P. 1-7. DO!: https:// doi: 10.1016/j.mib.2015.10.0070
15. Worden A.Z., Seidel M., Smriga S., et al. Trophic regulation of Vibrio cholerae in coastal marine waters. Environ. Microbiol. 2006. Vol. 8. P. 21-29. DO!: https://dx.doi. org/10.1111/j.1462-2920.2005.00863.x)
16. Sun S., Tay Q.X.M., Kjelleberg S., et.al. Quorum sensing- regulated chitin metabolism provides grazing resistance to Vibrio cholerae biofilms. The !SME Journal. 2015. Vol. 9, N8. P. 1812-1820. DO!:https://doi-.10.1038/ismej.2014.265
17. Reguera G., Kolter R. Virulence and the environment: a novel role of Vibrio cholerae toxin-coregulated pili in biofilm formation on chitin. Journal of bacteriology. 2005. Vol. 187, N10. P. 3551-3555. DO!:https://doi: 10.1128/ JB. 187. 10.3551-3555.2005
18. Chiavelli D.A., Marsh J. W., Taylor R.K. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to zooplankton. Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67, N7. P3220-3225. DO!:https://doi:10.1128/AEM.67.7.3220-3225.2001
19. Jude B.A., Taylor R.K. The physical basis of type 4 pilus-mediated microcolony formation by Vibrio cholerae O1. J. Struct. Biol. 2011. Vol. 175, N1. P. 1-9. DO!: https:// doi: 10.1016 / j. jsb. 2011. 04. 008
20. Окулич В. К., Кабанова А. А., Плотников Ф. В. Микробные биопленки в клинической микробиологии и антибактериальной терапии. Витебск: ВГМУ; 2017.300 с.: ил. !SBN 978-985-466-896-0
21. Водопьянов С. О., Водопьянов А. С, Меньшикова Е. А. и др. Способ моделирования биопленок, формируемых Vibrio cholerae O1 серогруппы на поверхности хитина. Патент РФ №2685878; 23.04.2019. Бюл. №12.
22. Головин С. Н., Титова С. В. Симонова И. Р. Способ получения образцов биопленок холерных вибрионов для исследования методом трансмиссионной электронной микроскопии. Патент РФ № 2662938; 30.07.2018, Бюл. №22
23. Марков Е. Ю., Куликалова B. C., Урбанович Л. Я. и др. Хитин и продукты его гидролиза в экологии Vibrio cholerae. Биохимия. 2015. Т.80, №9. P. 1334-1343. DO!: http://dx.doi.org/10.1134/S0006297915090023
24. Дуванова О. В., Мишанькин Б. Н., Водопьянов А. С, Сорокин В. М. N-ацетил-ß-D-глюкозаминидаза холерных вибрионов. Журн. микробиол., эпидемиол. ииммунобиол. 2016. Т. 2. С. 41-48. DO!:https://doi.org/10.36233/0372-9311-2016-2-41-48
25. Головин С. Н., Симонова И. Р., Титова С. В. и др. Изучение биопленок Vibrio cholerae методом трансмиссионной электронной микроскопии. Клиническая лабораторная диагностика. 2017. Т. 62, №9. С. 568-576. DO!:http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-63-9-568-576
26. Shahkarami M. Vibrio cholerae biofilm development on natural and artificial chitin substrates. 2005. Master's Theses. 2839. DO!: https://doi.org/10.31979/etd.5478-vxaj
27. Nahar S., Sultana M., Naser M.N., et.al. Role of shrimp chitin in the ecology of toxigenic Vibrio cholerae and cholera transmission. Frontiers in Microbiology. 2011. Vol. 2. DO!: https:// dx.doi.org/10.3389/fmicb.2011.00260
References
1. Silva AJ, Benitez JA. Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2016;10(2). DO!: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004330
2. Rahman H., Mahbub K.R., Vergara G.E., et al. Protozoal food vacuoles enhance transformation in Vibrio cholerae through SOS-regulated DNA integration. The !SME Journal. 2022;16:1993-2001. DO!:https://doi.org/10.1038/s41396-022-01249-0
3. Pruzzo C., Vezzulli L, Colwell R.R. Global impact Vibrio cholerae interactions with chitin. Environ. Microbiol. 2008;10:1400-1410. DO!: https://doi:10.1111/j.1462-2920.2007.01559.x
4. Vezzulli L, Guzman C.A., Colwell R.R., Pruzzo C. Dual role colonization factors connecting Vibrio cholerae's lifestyles in human and aquatic environments open new perspectives for combating infectious diseases. Curr. Opin. Biotechnol. 2008;19. DO!: http://dx.doi.org/10.1016/jxopbio.2008.04.002
5. Vezzullia L., Grandea C., Reidb P.C., et al. Climate influence on Vibrio and associated human diseases during the past half-century in the coastal North Atlantic. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;23;113(34): 5062-5071. DO!: https://doi:10.1073/pnas.1609157113
6. Men'shikova EA, Kurbatova EM, Titova SV Ecological features of the persistence of Vibrio cholerae: a retrospective analysis and the current state of the problem. Journal. microbiol., epidemiol. and immunobiol. 2020;97(2):165-173 (in Russ). DO!:https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-2-165-173; !SSN0372-9311.
7. Men'shikova EA., Kurbatova EM., Vodop'yanov SO., et al. Evaluation of the ability of cholera vibrios to form a biofilm on the surface of the chitin shell of crayfish. Journal of Microbiology, Epidemiology and !mmunobiology. 2021;98(4):434-439 (in Russ). DO!: https://doi.org/10.36233/0372-9311-99.
8. Meibom KL., LiXB., Nielsen AT, et al. The Vibrio cholerae chitin utilization program. Proc. Natl. Acad. ScL USA. 2004;101:2524-2529. DOI: https://doi:10.1073/pnas.0308707!01
9. Sinha-Ray S., Ali A. Mutation in flrA and mshA Genes of Vibrio cholerae Inversely Involved in vps-Independent Biofilm Driving Bacterium Toward Nutrients in Lake Water. Water. Front. Microbiol., 2017 Sec. Aquatic Microbiology. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01770
10. Kirn TJ., Jude BA., Taylor RK. A colonization factor links Vibrio cholerae environmental survival and human infection. Nature. 2005; 438:863-866. DOI: https://doi: 10.1038/ nature04249
11. Waldor MK., Mekalanos JJ. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. Science. 1996;272:1910-1914. DOI: https:// doi: 10.1126/наука. 272.5270.1910
12. Meibom KL, Blokesch M, Dolganov NA., et al. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 2005;310:1824-1827. DOI: https:// doi: 10.1126/science.1120096
13. Mondal M, Chatterjee NS. Role of Vibrio cholera exochitinase ChiA2 in horizontal gene transfer. Can J. Microbiol. 2016;62(3):201-209. DOI: https://doi: 10.1139/cjm-2015-0556
14. Metzger LC, Blokesch M. Regulation of competence-mediated horizontal gene transfer in the natural habitat of Vibrio cholera. Curr Open Microbiol. 2016;30:1-7. DOI: https:// doi: 10.1016/j.mib.2015.10.0070
15. Worden AZ., Seidel M, Smriga S, et al. Trophic regulation of Vibrio cholerae in coastal marine waters. Environ. Microbiol. 2006;8:21-29. DOI: https://dx.doi.org/10.1111/
J.1462-2920.2905.00063.X
16. Sun S, Tay QXM., Kjelleberg S, et al. Quorum sensing- regulated chitin metabolism provides grazing resistance to Vibrio cholerae biofilms. The ISME Journal. 2015;9(8):1812-1820. DOI:https://doi:10.1038/ismej.2014.265
17. Reguera G, Kolter R. Virulence and the environment: a novel role of Vibrio cholerae toxin-coregulated pili in biofilm formation on chitin. Journal of bacteriology 0005;187(10):3551-3555. DOI: https://doi: 10.1128/ JB. 187. 10.3551-3555.2005
18. Chiavelli DA., Marsh JW., Taylor RK. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to zooplankton. Appl. Environ. Microbiol. 2001;67(7):3220-3225. DOI: https://doi:10.1108/AEM.67.7.3000-3005.0001
19. Jude BA., Taylor RK. The physical basis of type 4 pilus-mediated microcolony formation by Vibrio cholerae O1. J. Struct. Biol. 2011;175(1):1-9. DOI: https:// doi: 10.1016 / j. jsb. 2011.04. 008
20. Okulich VK., Kabanova AA., Plotnikov FV. Microbial biofilms in clinical microbiology and antibiotic therapy Vitebsk: VSMU; 2017:300 (in Russ). ISBN 978-985-466-896-0
21. Vodop'yanov SO, Vodop'yanov AS, Men'shikova EA, Kurbatova EM, Titova SV. A method for modeling biofilms formed by Vibrio cholerae O1 serogroup on the surface of chitin. PatentRUS №2685878; 23.04.2019. Byul. №12 (in Russ).
22. Golovin SN, Titova SV, Simonova IR. Method for obtaining samples of biofilms of cholera vibrios for examination by transmission electron microscopy. Patent RUS №2662938; 30.07.2018, Byul. №22 (in Russ).23. Markov EJu, Kulikalova ES, Urbanovich LJa, et al. Chitin and its hydrolysis products in the ecology of Vibrio cholerae. Biocheimiistry. 2015;80(9):1334-1343 (in Russ). DOI:http://dx.doi.org/10.1134/S0006297915090023
24. Duvanova OV, Mishan'kin BN, Vodop'yanov AS, Sorokin VM. N - acetyl-ß-D-glucosaminidase of cholera vibrios. Journal. microbiol., epidemiol. immunobiol. 2016;2:41-48 (in Russ). DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2016-2-41-48.
25. Golovin SN, Simonova IR, Titova SV, et al. The study of Vibrio cholerae biofilms by transmission electron microscopy. Clinical Laboratory Diagnostics. 2017;62(9):568-576 (in Russ). DOI: http://dx.doi.org/10.18801/0869-0084-0017-63-9-568-576
26. Shahkarami M. Vibrio cholerae biofilm development on natural and artificial chitin substrates. 2005. Master's Theses. 2839. DOI: https://doi.org/10.31979/etd.5478-vxaj
27. Nahar S, Sultana M, Naser MN, et al. Role of shrimp chitin in the ecology of toxigenic Vibrio cholerae and cholera transmission. Frontiers in Microbiology. 2011;2. DOI: https:// dx.doi.org/10.3389/fmicb.2011.00260.
Об авторах
About the Authors
• Светлана Викторовна Титова - к. м. н., ведущий научный сотрудник лаборатории природно-очаговых и зоонозных инфекций, ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. +7 (863) 240-91-08, [email protected]. ОРСЮ https://orcid.org/0000-0002-7831-841X.
• Ирина Рафиковна Симонова - старший научный сотрудник лаборатории диагностических препаратов, ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. ОРСЮ https://orcid.org/0000-0001-8261-2294.
• Елена Аркадьевна Меньшикова - к. б. н., с. н. с. отдела микробиологии холеры и других острых кишечных инфекций, ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора. menshikova_ea@antiplague. ш. ОРСЮ https://orcid.org/0000-0002-6003-4283.
• Виктория Сергеевна Осадчая - лаборант-исследователь лаборатории природно-очаговых и зоонозных инфекций, ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора.
Поступила: 13.01.2023. Принята к печати: 06.05.2023.
Контент доступен под лицензией СС БУ 4.0.
• Svetlana V. Titova - Cand. Sci. (Med.), leading researcher, laboratories of natural focal and zoonotic infections, FKUZ Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor. +7 (863) 240-91-08, [email protected]. ORCID https://orcid.org/0000-0002-7831-841X.
• Irina R. Simonova - senior Researcher, laboratories of diagnostic preparations FKUZ Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor. ORCID https://orcid.org/0000-0001-8261-2294.
• Elena A. Menshikova - Cand. Sci. (Biol.), senior researcher Department of Microbiology of cholera and other acute intestinal infections, FKUZ Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor. [email protected]. ORCID https://orcid.org/0000-0002-6003-4283.Victoria S. Osad-chaya - laboratory assistant of the laboratories of natural focal and zoonotic infections, FKUZ Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor.
Received: 13.01.2023.Accepted: 06.05.2023.
Creative Commons Attribution CC BY 4.0.
