CC BY
14
краткие сообщения
УДК 616.98:579.842.23
Г.В.Демидова, В.П.Зюзина, Е.П.Соколова, Н.И.Пасюкова, И.А.Беспалова, Т.Н.Бородина,
В.И.Тынянова
токсичность различных форм липополисахаридов yersinia pestis для белых мышей, сенсибилизированных d-галактозамином
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт», Ростов-на-Дону,
Российская Федерация
Определена токсичность высокотемпературных ЛПС37 и комплексов ЛПС с мышиным токсином (ЛПС37-МТ) вакцинного и вирулентного штаммов Yersinia pestis для белых мышей, сенсибилизированных D-галактозамином (D-GalN). LD50 ЛПС37 и ЛПС37-МТ Y. pestis 231 для интактных мышей составляла соответственно 310^500 и 110^250 мкг/мышь. ЛПС37 Y. pestis EV76 нетоксичен для биопробных животных в дозе 3 мг. В то же время ЛПС37-МТ токсически активен и его LD50 равна 520^610 мкг/мышь. На фоне D-GalN чувствительность животных к действию указанных форм ЛПС вакцинного штамма повышалась на два порядка, а для ЛПС вирулентного штамма - на три. При этом различия токсических свойств между исходными (ЛПС37) и конформационно измененными (ЛПС37-МТ) формами ЛПС обоих исследованных штаммов Y. pestis полностью нивелируются.
Ключевые слова: Yersinia pestis, эндотоксиновая толерантность, липополисахарид (ЛПС), комплекс ЛПС с мышиным токсином (МТ), D-галактозамином (D-GalN).
G.V.Demidova, V.P.Zyuzina, E.P.Sokolova, N.I.Pasyukova, I.A.Bespalova, T.N.Borodina, V.I.Tynyanova
Toxicity of Various Forms of Yersinia pestis Lipopolysaccharides to D-Galactosamine Sensitized White Mice
Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute, Rostov-on-Don, Russian Federation
Determined has been toxicity to D-galactosamine (D-GalN) sensitized white mice of high-temperature LPS37 and LPS complexes with murine toxin (LPS37-MT) contained in vaccine and virulent Yersinia pestis strains. Y. pestis 231 LPS37 and LPS37-MT LD50 for intact mice is 310^500 and 110^250 mcg/mouse, respectively. Y. pestis EV76 LPS37 is non-toxic for experimental animals if administered in a dose of 3 mcg. While Y. pestis EV76 LPS37-MT is toxically active and its LD50 equals 520^610 mcg/mouse. Sensitivity of the animals to the stated above LPS forms' effect when affected by D-GalN is by two orders greater, and as for LPS of the virulent strain is by three orders. Concurrently, differences in toxicity properties in the original (LPS37) and conformationally altered (LPS37-MT) LPS-forms in both of the tested Y. pestis strains drop out of the equation completely.
Key words: Yersiniapestis, endotoxin resistance, lipopolysaccharide (LPS), LPS-complex with murine toxin (MT), D-galactosamine (D-GalN).
В настоящее время известно, что токсические (350-800 мкг/мышь), что характерно для R-ЛПС, до свойства бактериальных липополисахаридов (ЛПС) полного отсутствия эффекта токсичности. Как прави-можно усиливать в условиях in vivo посредством ло, низкотемпературные ЛПС (ЛПС28) чумного ми-снижения порога чувствительности макроорганизма кроба токсичны для биопробных животных, в то вре-к действию ЛПС. С этой целью обычно используют мя как высокотемпературные ЛПС (ЛПС37) являются вещества, обладающие иммуносупрессивным дей- слабыми индукторами синтеза провоспалительных ствием. Иной способ, широко применяемый в ла- цитокинов, а в некоторых случаях вообще не облада-бораторной практике, заключается в обработке жи- ют токсическими свойствами [3]. вотных аминосахаром D-галактозамином (D-GalN). Известно, что в условиях in vitro токсичность Сенсибилизация животных этим веществом увели- препаратов ЛПС Y. pestis можно усилить путем фор-чивает токсичность бактериальных ЛПС в сотни и мирования токсически активной конформации политысячи раз [5]. Возможность применения D-GalN меров. Модулятором конформационных изменений для повышения токсичности ЛПС чумного микроба ЛПС является специфический белок чумного микрона модели белых мышей описана нами ранее [1]. ба - мышиный токсин (МТ), который образует ком-ЛПС Yersinia pestis относится к R-хемотипу. Био- плекс ЛПС-МТ, специфичный и высокотоксичный логическое своеобразие его заключается в высокой для биопробных животных [2].
внутривидовой вариабельности химической структу- Представляло интерес сравнить токсические
ры и температурозависимом характере синтеза ЛПС. свойства исходных и конформационно измененных
В соответствии с химическим строением полимеров форм ЛПС вакцинного и вирулентного штаммов
токсичность препаратов ЛПС возбудителя чумы весь- чумного микроба для белых мышей, сенсибилизиро-
ма различна и колеблется от средних значений LD50 ванных D-GalN.
Проблемы особо опасных инфекций, вып. 4, 2014
В работе использовали высокотемпературные ЛПС, полученные из клеток вакцинного (EV76) и вирулентного (231) штаммов Y pestis. Культуры выращивали при 37 °С на агаре LB (Difco, США) в течение 48 ч. ЛПС выделяли фенольным методом.
Мышиный токсин выделяли по оригинальной методике В.И.Марченкова из вакцинного штамма Y. pestis EV76. LD50 препарата МТ равнялась 5,6 (4,0^7,9) мкг/мышь. Для активации токсических свойств ЛПС Y pestis препараты ЛПС соединяли с МТ и инкубировали 30 мин при 37 °С с целью образования комплекса ЛПС-МТ [2].
Обработку белых мышей D-GalN проводили по методу C.Galanos et al. в нашей модификации [1]. Максимальная концентрация D-GalN (Merck, Германия) составляла 30 мг на белую мышь. Доза не была токсичной для лабораторных животных. D-GalN растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно экспериментальным животным одновременно с препаратами ЛПС Y pestis, исследуемыми на токсичность. Значение LD50 рассчитывали по общепринятой формуле кербера. Статистическую обработку полученных результатов проводили по критерию знаков для вероятности 0,95.
Использованные в работе 37 °С ЛПС вакцинного и вирулентного штаммов чумного микроба существенно различаются по химическому строению [6] и, как показал эксперимент, проявляют различную токсичность для биопробных животных. Так, препарат ЛПС37 вирулентного штамма Y pestis 231 имеет достаточно высокий уровень токсичности, его LD50 равна 310^500 мкг/мышь. В то же время ЛПС37 вакцинного штамма Y pestis EV76 не токсичен для белых мышей в дозах более 3 мг.
При образовании комплекса ЛПС37-МТ токсические свойства ЛПС37 вирулентного штамма увеличиваются приблизительно в 2,5 раза (LD50 = 110^250 мкг/мышь). У вакцинного же штамма, в отличие от нетоксичной исходной формы ЛПС37, кон-формационно измененный комплекс ЛПС37-МТ токсичен и его LD50 равна 520^610 мкг/мышь.
Сенсибилизация белых мышей D-GalN способствует повышению чувствительности животных к действию всех указанных форм ЛПС чумного микроба. При этом выяснилось, что на фоне D-GalN различия в летальной токсичности исходных и кон-формационно измененных форм ЛПС как вакцинного, так и вирулентного штаммов Y. pestis полностью нивелируются. Доза ЛПС, вызывающая 100 % гибель животных, для препаратов всех форм (ЛПС37 и ЛПС37-МТ обоих штаммов) одинакова и равна 10 мкг/мышь. В то же время минимальные дозы препаратов ЛПС37 и ЛПС37-МТ, при которых наблюдается гибель 10-30 % животных, различны для вакцинного и вирулентного штаммов Y. pestis. Для препаратов ЛПС Y pestis EV76 она равна 5 мкг/мышь, а для препаратов ЛПС вирулентного штамма Y pestis 231 составляет 0,1 мкг/мышь. Таким образом, D-GalN усиливает токсичность ЛПС37 и ЛПС37-МТ ви-
рулентного штамма Т pestis 231 в 100-1000 раз, а ЛПС37-МТ вакцинного штамма Т pestis ЕУ76 в 100 раз. Нетоксичный в обычных условиях ЛПС37 Т pes-tis ЕУ76 на фоне D-GalN проявляет такую же токсичность, как и конформационно измененная форма
лпс37-мт.
По данным литературы известно, что действие аминосахара D-GalN на организм млекопитающих избирательно и направлено исключительно на клетки печени [5]. В паренхиме печени специфические рецепторы для ЛПС (ТЪЯ2/ТЪЯ4) экспрессиру-ют только звездчатые ретикулоэндотелиоциты -Купферовы клетки. Связывание ЛПС с То11-рецепто-рами приводит к передаче трансмембранного сигнала, направленного на активацию главного регулятора синтеза провоспалительных цитокинов - фактора ядерной транскрипции (ОТкЬ). Синтез ТОТ-а, инициированный ЛПС, может ограничиваться только купферовыми клетками, или может быть усилен путем передачи сигнала от ТОТ-а (уже синтезированного) на соответствующие рецепторы цитоки-нактивных клеток печени (нормальные киллеры и Т-лимфоциты). В свою очередь передача сигнала от ТОТ-а реализуется через два типа трансмембранных рецепторов, которые присутствуют на всех ядерных клетках организма млекопитающих - ТОТЯ и FasR. Взаимодействие ТОТ-а с внутриклеточными адап-торными белками FasR инициирует апоптоз клетки, а с ТОТЯ активирует NFkb, запуская тем самым вторичный цикл синтеза ТОТ-а [4].
Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что на фоне D-GalN исходные и конформационно измененные формы ЛПС чумного микроба, независимо от их исходной токсичности, в условиях макроорганизма обладают приблизительно одинаковой ТОТ-а индуцирующей активностью. Видимо, в присутствии D-GalN ЛПС каскадно активирует всю сеть цитокининдуцирующих клеток печени, при этом путь передачи сигнала от ТОТ-а на Fas-рецепторы является доминантным, что приводит к апоптозу гепатоцитов и гибели макроорганизма.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Демидова Г.В., Зюзина В.П., Соколова Е.П., Бородина Т.Н., Беспалова И.А., Пасюкова Н.И., Тынянова В.И. Токсичность липополисахаридов вакцинного штамма Yersinia pestis EV76 для белых мышей, сенсибилизированных D-галактозамином. Журн. микробиоя., эпидемиол. и иммунобиол. 2011; 1:74-6.
2. Соколова Е.П., Марченков В.И., Демидова Г.В., Зюзина В.П., Беспалова И.А., Павлович Н.В., Ерёменко Н.С., Веркина Л.М., Тынянова В.И. Комплексы «мышиного» токсина чумного микроба с модифицированными формами липополисаха-рида Yersinia pestis и с липополисахаридами других бактерий. Биотехнология. 2001; 4:53-8.
3. Тынянова В.И., Зюзина В.П., Демидова Г.В., Соколова Е.П., Писанов Р.В., Беспалова И.А., Бородина Т.Н., Анисимов Б.И., Мишанькин Б.Н. Токсичность препаратов липополисахаридов из культуры Yersinia pestis EV76, выращенной при 28 °C и 37 °С. Биотехнология. 2003; 6:10-6.
4. Хаитов Р.М., Игнатьева Г. А., Сидорова И.Г. Иммунология. М.: Медицина; 2000. 430 с.
5. Galanos C., Freudenberg M.A., Reuter W. Galactosamine-induced sensitization to the lethal effects of endotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979; 76:5939-43.
6. Knirel Y.A., Anisimov A.P. Lipopolysaccharide of Yersinia pestis, the cause of plage: structure, genetics, biological properties.
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Acta Nature. 2012, 4(13):45-58.
References
1. Demidova G.V., Zyuzina V.P., Sokolova E.P., Borodina T.N., Bespalova I.A., Pasyukova N.I., Tynyanova V.I. [Toxicity of Yersinia pestis EV76 to D-galactosamine sensitized LPSs white mice]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2011; 1:74-6.
2. Sokolova E.P., Marchenkov V.I., Demidova G.V., Zyuzina V.P., Bespalova I.A., Pavlovich N.V., Eremenko N.S., Verkina L.M., Tynyanova V.I. [Plague agent murine toxin complexes with modified Yersinia pestis LPS-forms and LPSs of other bacteria]. Biotekhnologiya. 2001, 4:53-8.
3. Tynyanova V.I., Zyuzina V.P., Demidova G.V., Sokolova E.P., Pisanov R.V., Bespalova I.A., Borodina T.N., Anisimov B.I., Mishan'kin B.N. [LPS preparations' toxicity, obtained from Yersinia pestis EV76 culture grown at 28 °C and 37 °C]. Biotekhnologiya. 2003, 6:10-6.
4. Khaitov R.M., Ignat'eva G.A., Sidorova I.G. [Immunology]. M.: "Meditsina", 2000. 430 p.
5. Galanos C., Freudenberg M.A., Reuter W. Galactosamine-induced sensitization to the lethal effects of endotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979; 76:5939-43.
6. Knirel Y.A., Anisimov A.P. Lipopolysaccharide of Yersinia pestis, the cause of plage: structure, genetics, biological properties. Acta Nature. 2012, 4(13):45-58.
Authors:
Demidova G.V., Zyuzina V.P., Sokolova E.P., Pasyukova N.I., Bespalova I.A., Borodina T.N., Tynyanova V.I. Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute. 117/40, M.Gor'kogo St., Rostov-on-Don, 344002, Russian Federation. E-mail: [email protected]
об авторах:
Демидова Г.В., Зюзина В.П., Соколова Е.П., Пасюкова Н.И., Беспалова И.А., Бородина Т.Н., Тынянова В.И. Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт. Российская Федерация, 344002, Ростов-на-Дону, ул. М.Горького, 117/40. E-mail: [email protected]
Поступила 05.03.14.
