Аффинитет различных форм липополисахаридов Yersinia pestis к LBP и рецептору CD14 моноцитов человека Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Эпидемиология, экология, специфическая диагностика, профилактика

т

УДК 579.842.23:612.017.4:577.1

АФФИНИТЕТ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ YERSINIA PESTIS К LBP И РЕЦЕПТОРУ CD14 МОНОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

Е. П. Соколова, Г. В. Демидова, В. П. Зюзина, И. А. Иванова, И. А. Беспалова, В.И. Тынянова ФКУЗ «Ростовский-на Дону противочумный институт» Роспотребнадзор г. Ростов-на-Дону 344002, Ростовская обл, Ростов-на-Дону г, Максима Горького, 117/40. Тел.: +7 (863) 2425011

При сравнении аффинитета исходных форм ЛПС28 и ЛПС37 Yersinia pestis и их комплексов со специфическим белком возбудителя чумы - «мышиным» токсином (ЛПС28-МТ и ЛПС37-МТ) обнаружено, что ЛПС вакцинного и вирулентного штаммов Y. pestis связывают LBP сыворотки крови полностью, в то время как аффинитет к нему комплексов ЛПС-МТ для всех изученных вариантов достоверно ниже и равен 80-83 %. Более существенные различия выявлены при изучении связи указанных форм ЛПС с рецепторами CD14 моноцитов человека. Конформационно изменённые формы ЛПС вакцинного штамма Y. pestis EV 76 активнее связываются с CD14 по сравнению с исходными формами ЛПС. Модификация же ЛПС-МТ вирулентного штамма Y. pestis 231, напротив, снижает аффинитет к CD14 до 15 % по сравнению с 50% у исходных вариантов ЛПС28 и ЛПС37.

Ключевые слова: Yersinia pestis EV 76, липополисахариды, модифицированные формы ЛПС, CD14, LBP, моноциты

AFFINITY OF DIFFERENT YERSINIA PESTIS LIPOPOLYSACCHARIDE FORMS TO LBP AND CD14

RECEPTORS OF HUMAN MONOCYTES

SokolovaE.P., Demidova G.V., Ziuzina V.P., IvanovaI.A.,BespalovaI.A., Tynianova V.I.

The Rostov Institute for Plague Control, Federal Agency on Consumer Rights Protection and Human

Welfare Supervision, Rostov-on-Don

When comparing affinity of the initial LPS28 and LPS37 Yersinia pestis and their complexes with the specific protein of plague microbe - the "murine" toxin (LPS28-MT and LPS37-MT) - it was found that LPS of the vaccine and virulent Y. pestis strains bound LBP in blood serum completely, whereas the affinity of LPS-MT complexes to LBP for all the variants tested was significantly lower and amounted to 80-83 %. More substantial differences were detected when investigating the link of the above mentioned LPS forms with CD14 receptors of human monocytes. The conformationally modified LPS forms from vaccine strain Y. pestis EV76 were found to bind with CD14 more actively in comparison with the initial LPS forms. On the contrary, the modified LPS-MT from the virulent Y. pestis strain 231 decreased affinity to CD14 to 15 % versus 50 % for the initial LPS28 and LPS37 variants.

Keywords: Yersinia pestis EV76, lipopolysaccharides, modified LPS forms, CD14, LBP, monocytes.

Введение. По мнению специалистов-чумо-логов липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки бактерий является основным патогенетическим фактором Yersinia pestis [1]. Как известно, ЛПС Y. pestis относится к R-хемотипу. Он отличается высоким внутривидовым разнообразием химического строения. В силу биологических особенностей возбудителя, связанных со сменой пойкилотермного и теплокровного хозяина, синтез ЛПС чумного микроба регулируется температурой [2, 3]. При низких температурах выращивания бактерий (26 и 28 0С) липид А ЛПС

представлен в основном гексаацильной формой, обладает средней степенью токсичности для биопробных животных и выраженной цитоки-ниндуцирующей активностью. При повышении температуры инкубации до 37 0С наблюдаются существенные изменения в количественном и качественном составе сахаров, входящих в структурные блоки ЛПС и жирных кислот липи-да А [2, 3]. Модификация химического строения, которую претерпевают ЛПС Y. pestis, приводит к снижению их токсичности и цитокининдуци-рующей активности.

ISSN 2221-7711 Национальные приоритеты России. 2014. № 3 (13)

Ранее мы установили, что токсичность высоко- и низкотемпературных форм ЛПС в условиях in vitro может быть усилена в результате изменения конформации полимеров ЛПС без изменения их химической структуры. Модулятором конформационных перестроек ЛПС является специфический белок чумного микроба - «мышиный» токсин (МТ), который, соединяясь с ЛПС, образует высокотоксичный для биопробных животных комплекс ЛПС-МТ [4].

Аффинитет конформационно изменённых форм ЛПС к LBP и CD14 специально не изучался.

Цель. В настоящей работе проведены сравнительные исследования связи исходных форм ЛПС28 и ЛПС37 чумного микроба и их комплексов с МТ (ЛПС28-МТ и ЛПС37-МТ) с LBP нормальной человеческой сыворотки и CD14 моноцитов человека клеточной линии U-937.

Материалы и методы. Препараты ЛПС выделяли водно-фенольным методом из клеток вакцинного Y. pestis EV 76 и вирулентного Y. pestis 231 штаммов, выращенных при 280 и 37 0С. МТ выделяли по оригинальной методике В. И. Мар-ченкова с соавт. [5]. Для образования комплекса ЛПС-МТ исходные препараты ЛПС соединяли с препаратом МТ в соотношениях 100:1 и совместно инкубировали 30 мин при 37 0С. Моноциты человека линии U-937 (1x104 клеток в лунке) культивировали в 96-луночном планшете в среде PRMI 1640, содержащей 8 % FCS и 100 мкг/мл гентамицина. При постановке реакции связывания CD14 с ЛПС препараты предварительно выдерживали 1 час при 37 0С в 1 %-ной нормальной человеческой сыворотке (НЧС), а затем вносили их в культуру моноцитов, находящихся в среде PRMI 1640 с 1 % FCS. После инкубации в течение 1 часа при 37 0С клетки окрашивали согласно методике, рекомендуемой производителем моно-клональных антител (Сорбент, Москва) для им-мунофлуоресцентного теста. Количество клеток с CD14, связанных с ЛПС, регистрировалось лю-минесцентно-микроскопическим способом и выражалось в процентах относительно флуоресцирующих клеток со свободными CD14. Приведены крайние значения результатов пяти независимых определений. Содержание LBP в НЧС определяли согласно инструкции к тест-системе (Био-химмак, Москва). Количество LBP, связанного с ЛПС, выражали в процентах относительно свободного LBP (8,5 мкг/мл), содержащегося в НЧС. Приведены крайние значения результатов трех независимых определений.

Результаты. В результате проведенных исследований мы выяснили, что связь исходных (ЛПС 28 и ЛПС 37) и модифицированных (ЛПС28-МТ и ЛПС37-МТ) форм ЛПС с этими белками

различна. Исходные формы ЛПС28 и ЛПС37 вакцинного и вирулентного штаммов Y. pestis связывают LBP полностью (98-100 %). Аффинитет комплексов ЛПС-МТ для всех изученных видов ЛПС достоверно ниже и равен 80-83 %. При изучении связи ЛПС с CD14 выявлены различия не только между свободными и конформационно изменёнными формами ЛПС, но и между ЛПС вакцинного и вирулентного штаммов Y. pestis. Установлено, что ЛПС37 вакцинного штамма Y. pestis EV 76 обладает слабым аффинитетом к CD14 (связь обнаружена в 15 % случаев), а ЛПС28 вообще не образует связи с CD14. В то же время аффинитет комплексов ЛПС28-МТ и ЛПС37-МТ к CD14 достаточно высок и равен 68 и 24 % соответственно. Для ЛПС вирулентного штамма Y. pestis 231 характерна иная закономерность - исходные варианты ЛПС28 и ЛПС37 связывают приблизительно 50 % CD14, в то время как аффинитет модифицированных форм ЛПС28-МТ и ЛПС37-МТ снижается до 15 %. Таким образом, установлено, что исходные формы (ЛПС28 и ЛПС37) и их конформационно изменённые варианты (ЛПС28-МТ и ЛПС37-МТ) вакцинного и вирулентного штаммов Y. pestis обладают различным аффинитетом к LBP сыворотки крови и CD14 моноцитов человека.

Обсуждение. Известно, что токсичность бактериальных липополисахаридов обусловлена их способностью активировать клетки неспецифической иммунной системы макроорганизма, индуцируя синтез провоспалительных цитокинов различных классов. Специфическим рецептором, который узнает паттерную структуру ЛПС, является сигнальный комплекс toll-рецептора - TLR4/ MD2, экспрессируемый на поверхности клеток миелоидного ряда. Акцессорный блок TLR4/MD2 включает в себя липополисахарид-связывающий белок ^ВР) и две изоформы рецептора CD14, роль которых заключается в формировании кон-формационных эпитопов ЛПС, комплементарных сайтам связывания с апикальной частью рецептора. Степень участия акцессорных молекул в образовании комплекса ЛПС/LBP/CD14 зависит от химической структуры ЛПС [6]. Для S-ЛПС канонического строения характерна высокоаффинная связь с LBP и CD14, в то время как соединение R-формы ЛПС с рецептором может осуществляться и без CD14 [7]. Малейшие изменения химической структуры липида А, состава сахаров коровой области или полисахаридов «хвостовой» части ЛПС меняют константу связывания акцессорных белков с ЛПС, что отражается на активации внутреннего сигнального комплекса TLR4/MD2. Передаваемый сигнал адекватен конкретной форме ЛПС и индуцирует синтез цитокинов различного качественного и количественного состава [8].

Эпидемиология, экология, специфическая диагностика, профилактика

Результаты экспериментов, полученные в настоящей работе, предполагают различия иммуно-модулирующего действия исходных и конформа-

ционно-измененных форм ЛПС Y. pestis в условиях макроорганизма. Изучение этого вопроса является предметом дальнейших исследований.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1.

- Мол. генетика, микробиология и вирусология. 2002.

- М.: Медицина. - № 3.

2. Knirel Y.A., Anisimov A. P. Lipopolysaccharide of Yersinia pestis, the cause of Plage: structure, genetics, biological properties. Acta Nature. 2012, 4 (13): 45-58.

3. Kawahara K., Tsukano H., Watanabe H. et al. Modification of the structure and activity of lipid A in Yersinia pestis lipopolysaccharide by growth temperature. Infect. Immun. 2002, 70 (8): 4092-4098

4. Соколова Е.П., Марченков В.И., Демидова Г.В. и др. Комплексы "мышиного" токсина чумного микроба с модифицированными формами липополисахарида Yersinia pestis и с липополисахаридами других бакте-

рий // Биотехнология. - 2001, 4: 53-58.

5. Соколова Е.П. Механизмы активации токсических субстанций чумного микроба: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Ростов-н/Д., 2002.

6. Pupo E, Lindner B, Brade H., Schromm A.B. Intact rough- and smooth-form lipopolysaccharides from Escherichia coli separated by preparative gel electrophoresis exhibit differential biologic activity in human macrophages. FEBS J. 2013, 280 (4): 1095-111.

7. Huber M, Kalis C, Keck S. et al. R-form LPS, the master key to the activation of TLR4/MD-2-positive cells. Eur J Immunol. 2006, 36(3): 701-711

8. Волошина Е.В., Зубова С. В., Прохоренко С.В. и др. Сравнение эффектов разных хемотипов липопо-лисахаридов из Escherichia coli и Salmonella на синтез TNFa и IL-6 макрофаго-подобными клетками TNP-1

Елена Павловна Соколова, Галина Викторовна, демидова Вера Павловна Зюзина, иванова инна Александровна, Беспалова ирина александровна, тынянова Виктория ивановна - кандидаты биологических наук, старшие научные сотрудники Ростовского-на Дону противочумного института

© Коллектив авторов, 2014 Статья поступила в редакцию 22 сентября 2014 г.