CC BY
29
Калибровочная кривая для количественного определения растворимого легионеллезного антигена в моче
белку (по методу Лоури). Полученный образец титровали по 50 мкл, начиная с разведения 1:40 до 1:2560, и результат определяли в реакции объемной агломерации с полученным диагностикумом. Для количественного определения растворимого легио-неллезного антигена построена калибровочная кривая (рисунок). Диапазон чувствительности составил от 50 до 1 мкг/мл легионеллезного антигена по белку. Предел чувствительности диагностикума составил 2 мкг/мл по белку. Отсекающее значение от неспецифических результатов (cut-off) составил 50 мкг/мл растворимого антигена по белку. Полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности иммуноглобулинового полимерного диагностикума.
Диагностикум в лиофильном состоянии сохранял активность при хранении в течение 3 лет (срок наблюдения).
Таким образом, полученный легионеллезный иммуноглобулиновый полимерный диагностикум обладает высокой чувствительностью и специфичностью и предназначен для количественного определения растворимого легионеллезного антигена в моче, объектах внешней среды, а также для идентификации возбудителя при бактериологических исследованиях.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Эпидемиология, профилактика легионеллеза и борьба с ним: меморандум совещания ВОЗ // Бюл. ВОЗ. - 1990. -Т. 68. - № 2. - С. 7-17. - 2. Berdal B.P., Farshy C.E., Feeley J.C. // J. Clin. Microbiol. - 1979. - Vol. 9, N 9. - P. 575578. - 3. Birtles R.J., Harrison T.G., Samuel D., Taylor A.G. // J. Clin. Pathol. - 1990. - Vol. 43, N 8. - P. 685-690. -4. Chen S., Hicks L., Yuen M., Mitchell D. // J. Clin. Microbiol. - 1994. - Vol. 32, N 12. - P. 3054-3055. - 5. Della F., Tort J., Morera M.A., Espaulella J., Armengol J. // Thorax. - 1993. - Vol. 18, N 12. - P. 1227-1229. - 6. Dommgu-ez J.A., GaH N., Pedroso P., Fargas et al. // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36, N 9. - P. 2718-2722. - 7. Formica N., Yates M., Beers M. et al. // Epidemiol. Infect. - 2001. -Vol. 127, N 2. - P. 275-280. - 8. Helbig J.H., Luck P.C., Witzleb W. // Z. Gesamte. Hyg. - 1989. - Vol. 35, N 10. -P. 591-593. - 9. Kashuba A.D., Ballow C.H. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. - 1996. - Vol. 24, N 3. - P. 129-139. -10. Kohler R.B. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. - 1986. -Vol. 4. - P. 47S-59S. - 11. Leland D.S., Kohler R.B. // J. Clin. Microbiol. - 1991. - Vol. 29. - N 10. - P. 2220-2223. -12. Plouffe J.F., File T.M., Breiman R.F. et al. // Clin. Infect. Dis. - 1995. - Vol. 20, N 5. - P. 1286-1291. - 13. Ramirez J.A., Summersgill J.T. // J. Med. Assoc. - 1994. - Vol. 92, N 2. - P. 62-65. - 14. Richardson I.R., Lightfoot N.F. // Med. Lab. Sci. - 1992. - Vol. 49, N 2. - P. 144-146. - 15. Ruf B., Schurmann D., Horbach I. et al // J. Infect. Dis. - 1990. -Vol. 162, N 6. - P. 1341-1348.
G.L.Karbyshev, A.N.Terentiev, L.M.Verkina, A.N.Narkevich, I.R.Simonova, A.P.Kochetkova, L.K.Lyssova
Construction of the Preparations for Legionellosis Serologic Diagnosis. Communication 3. Construction and Experimental Trials of Serogroup 1 Legionellosis Immunoglobulin Polymer Diagnosticum
Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute
Summarized are the results of investigations into constructing a serogroup 1 legionellosis immunoglobulin polymer diagnosticum designated to detect the soluble legionellosis antigen in urinal specimens, various environmental objects as well as to identify microbial cultures isolated from them. The diagnosticum sensitivity was measured to range from 1 to 50 |ig protein /ml with fairly good specificity. The preparation is recommended to diagnose the legionary‘s disease early at the onset.
Key words: legionellosis, diagnostics, immunoglobulin diagnosticum.
Поступила 26.05.05.
УДК 616.988.26
Е.В.Найденова1, И.Н.Шарова\ С.А-Щербакова1, Ю.И.Яшечкин1, Н.В.Хуторецкая2, В.Ф.Ларичев2, К.А.Саркисян3, М.С.Воробьева3, А.М.Бутенко2, А.Н.Куличенко1, Д.К.Львов2, В.В.Кутырев1
ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА КРЫМСКОЙ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ МЕТОДОМ ОТ-ПЦР
1Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов;
2НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, 3ГИСК им. Л.А.Тарасевича, Москва
В работе изложены материалы по разработке и апробации тест-системы «Г енКонго» для выявления РНК вируса ККГЛ методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. Эффективность тест-системы подтверждена при проведении государственных испытаний в ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
Ключевые слова: вирус КГГЛ, лабораторная диагностика, ПЦР.
Крымская геморрагическая лихорадка (КГЛ) - общей интоксикацией, наличием выраженного ге-
это острое вирусное природно-очаговое лихора- моррагического синдрома и высокой леталь-
дочное заболевание человека, характеризующееся ностью - от 10 до 50 % (в зависимости от пути пе-
редачи возбудителя) [7].
Инфекция передается через укусы иксодовых клещей, но возможны также контактный и аспира-ционный пути заражения. Заболеваемость в виде эпидемических вспышек и спорадических случаев регистрируется на юге Европейской части России в весенне-летние месяцы (преимущественно в апреле-июне). Чаще всего болеют лица, занятые сельскохозяйственной деятельностью, имеющие контакты с переносчиками инфекции [6].
Переносчиками вируса являются иксодовые клещи 30 видов и подвидов, относящиеся к родам Hyalomma, Haemaphysalis, Rhipicephalus, Dermacen-^г, Amblyomma и Boophilus. Из них основную роль во всех эндемичных районах играют клещи рода Hyalomma. У клещей осуществляется трансовариальная и трансфазовая передача вируса.
Ареал вируса включает многие страны Африки (за исключением регионов пустыни), Ближний Восток, Западный Китай, Балканские страны, Крым, Закавказье, Казахстан, Туркмению, Таджикистан, Узбекистан, Киргизию, южные регионы Европейской части России [1].
В Южном федеральном округе Российской Федерации в 2005 г. зарегистрировано 138 случаев КГЛ. Из них 38 - в Республике Калмыкия, 38 - в Ставропольском крае, 37 - в Астраханской, 16 - в Ростовской, 6 - в Волгоградской областях и 3 - в Республике Дагестан (по данным Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека). Общее количество заболеваний по сравнению с 2004 г., когда было выявлено 76 больных, возросло на 45 %. [4].
Активизация природных очагов КГЛ (Ставропольский край, Ростовская и Астраханская области), распространение инфекции на новые территории (Волгоградская область, Калмыкия, Дагестан и Ингушетия) [1, 2, 3] определяют необходимость разработки высокочувствительных и специфичных средств лабораторной диагностики данного заболевания.
Лабораторная диагностика КГЛ проводится с использованием вирусологических, серологических и молекулярно-генетических методов.
В последнее время для выявления вирусных геномов наиболее широко применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР). Данный метод позволяет выявлять нуклеиновые кислоты вирусов в клиническом материале в первые дни болезни, когда по причине отсутствия специфических антител серологические методы диагностики оказываются не эффективными. ПЦР можно применять также для идентификации выделенных вирусных штаммов и для выявления РНК вируса в полевом материале [5].
Сотрудниками ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» были подобраны праймеры, и на их основе разработана ПЦР-тест-система «ГенКонго» для выявления возбудителя КГЛ.
Целью работы являлась оценка чувствительности, специфичности и воспроизводимости разработанной тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ в клещах методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).
Материалы и методы
Специфичность и чувствительность тест-системы изучали с использованием 25 вирусных штаммов, относящихся к семействам Togaviridae, Flaviviridae Bunyaviridae, Reoviridae и Ortho-myxoviridae: вирус Восточного энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ), Синдбис, 3 штамма вируса Западного Нила, вирус клещевого энцефалита, вирус желтой лихорадки, вирусы Тягиня, Инко, Неаполитанской и Сицилийской москитных лихорадок, 10 штаммов вируса ККГЛ, вирус Дугбе, Бханджа, Кемерово и Дхори. Штаммы вирусов, использованные в работе, получены из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (Москва).
Исследовали 83 пробы клещей различных видов, собранных в эндемичных и неэндемичных по КГЛ регионах Российской Федерации, а также суспензии клещей, искусственно инфицированных вирусом ККГЛ. Для выделения РНК вируса ККГЛ из мозговых суспензий и материала от клещей использовали методы фенол-хлороформовой экстракции и нуклеосорбцию на поверхности силикагеля в присутствии 6 М гуанидинтиоционата.
После выделения РНК проводили реакцию обратной транскрипции с Random-праймерами («Pro-mega», США). Амплификацию осуществляли по следующей программе: предварительная денатурация при 95 °С в течение 15 мин; затем 35 циклов, включающих денатурацию при температуре 94 °С в течение 40 с; отжиг праймеров при температуре 56 °С в течение 40 с; синтез комплементарной цепи при температуре 72 °С в течение 40 с. На заключительном этапе в программу амплификации вводили 1 цикл, который проводили при температуре 72 °С в течение 5 мин. Продукты реакции анализировали методом электрофореза в 2 % агарозном геле с эти-дием бромида.
Положительный контрольный образец к тест-системе «ГенКонго» получен путем клонирования фрагмента ДНК размером 138 н.п., гомологичного нуклеотидной последовательности РНК вируса ККГЛ в вектор pGEM-T («Promega», США), с последующей трансформацией штамма E. coli TG1 реконструированной плазмидой. Полученный штамм E. coli TG1 (pCCHF) содержит рекомбинантную плазмиду pCCHF, которая определяет его устойчивость к ампициллину в концентрации 50 мкг/мл.
Результаты и обсуждение
Возбудитель КГЛ - РНК-содержащий вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки
(ККГЛ), который, согласно данным Международного Комитета по таксономии, относится к роду Nairo-virus семейству Bunyaviridae. Геном найровирусов состоит из трех односпиральных негативных или биполярных РНК-сегментов: большого L (молекулярный вес 4,1-4,9-106), среднего M (молекулярный вес 1,5-1,9-106) и малого S (молекулярный вес 0,60,7-106). В соответствии с классификацией патоген -ных для человека микроорганизмов по СП 1.3.128503 вирус включен во II группу патогенности [4].
Для подбора праймеров выбрали наиболее изученную и генетически расшифрованную область РНК вируса ККГЛ - S-сегмент [8]. В соответствии с требованиями, предъявляемыми к олигонуклео-тидным затравкам, с помощью компьютерной базы данных GenBank и компьютерной программы Gen Runner были подобраны праймеры Wkg1 и Wkg2, фланкирующие фрагмент размером 138 н.п. гена, отвечающего за синтез белка, входящего в состав нуклеопротеина, и локализованного в области консервативного участка S-сегмента РНК вируса ККГЛ. Используя компьютерную программу Vec-torNTI 9.0.0, праймеры протестировали на отсутствие внутри- и межпраймерной гомологии.
Для оценки чувствительности ПЦР с выбранными праймерами использовали разведения штамма IbAr 10200 вируса ККГЛ от 10- до 10-5 (исходная концентрация вируса составляла 106 LD^/мл). Положительный результат зарегистрирован с пробами, содержащими вирус ККГЛ в разведении 10-4, что соответствует 1-10 геномэквивалентов (ГЭ)/мл.
Проверку специфичности проводили с препаратами кДНК различных штаммов вируса ККГЛ, выделенных в Таджикистане (штаммы 8973, 8976, 8966), Узбекистане (10145), Китае (China C), Нигерии (IbAr 10200), Конго (3010), а также со штаммами гетерологичных вирусов, относящихся к семействам: Flaviviridae и Togaviridae - вирус Западного Нила (штаммы 1628 и 986), вирус клещевого энцефалита (штамм 7555), вирус Синдбис (штамм 574). Положительные результаты ПЦР получены только со штаммами вируса ККГЛ.
Данные по специфичности и чувствительности ПЦР с выбранными нами праймерами свидетельствовали о возможности их использования для разработки ПЦР-тест-системы.
В последующих экспериментах оптимизированы параметры ПЦР и состав реакционной смеси, определена методика выделения РНК. Метод нук-леосорбции в присутствии гуанидинтиоцианата, хорошо зарекомендовавший себя при выделении ДНК из бактериальных клеток, оказался приемлемым и для работы с РНК-содержащим материалом. По сравнению с методом фенол-хлороформовой экстракции этот способ отличается простотой выполнения и требует меньше времени при выполнении данного этапа работы. Использование ДНК-полиме-разы для горячего старта при постановке ПЦР позволило значительно повысить специфичность реакции. В работе также применяли различные виды буфера для Тад-полимеразы. В ходе исследования наиболее высокая чувствительность достигнута с 10-кратным буфером, pH которого 8,3.
В соответствии с данными компьютерного анализа расчетная температура отжига праймеров Wkg1 и Wkg2 составила 56 °С. В последующих экспериментах отжиг праймеров осуществляли в интервале температур от 50 до 60 °С с шагом в 1 °С. Визуально наибольший выход продукта амплификации наблюдали при расчетной температуре. При изменении содержания праймеров в рабочей смеси показано, что оптимальной является концентрация 12 пМ/мкл. Программу амплификации определяли эмпирически. Количество циклов изменяли от 30 до 40, продолжительность предварительной денатура-
ции - от 10 до 15 мин, время каждого цикла - от 30 до 60 с. Наилучшие результаты достигнуты при амплификации по программе, описанной в разделе «Материалы и методы».
Для обеспечения максимальной безопасности при работе с тест-системой разработан положительный контроль, представленный рекомбинантной плазмидой, содержащей специфичный фрагмент кДНК вируса ККГЛ. Использование такого контрольного препарата позволяет исключить вирусологическую часть работы при производстве тест-системы, повышает ее стабильность. На основе полученной рекомбинантной плазмиды pCCHF разработан стандартный образец предприятия (СОПК+), который применяется для контроля чувствительности и специфичности выпускаемого диагностического препарата в условиях производства.
В результате проделанной работы разработана тест-система «ГенКонго», состоящая из четырех комплектов: для выделения РНК; для постановки реакции обратной транскрипции, для постановки ПЦР; для электрофоретической детекции продуктов ПЦР. Тест-система предназначена для проведения 100 определений, включая контрольные образцы.
Диагностическую ценность тест-системы
«ГенКонго» определяли при исследовании полевого материала, собранного в Котельниковском районе Волгоградской области (территории, эндемичной по КГЛ). При исследовании методом ОТ-ПЦР 368 экземпляров клещей, объединенных в 49 проб, среди которых выявлено 14 положительных (28,6 %), содержащих специфическую РНК вируса ККГЛ. Тестирование этого же материала в ИФА с использованием тест-системы для выявления антигенов вируса ККГЛ (производства НИИ вирусологии) позволило выявить 11 образцов, содержащих антиген вируса ККГЛ (22,4 %). Всего методами ПЦР и ИФА выявлено 17 (34,7 %) позитивных проб. Антиген и РНК одновременно обнаружены в 8 образцах (16,3 % от общего количества проб). В 3 случаях (6,2 %) выявлен только антиген, а в 6 (12,5 %) - только РНК вируса.
Полученные результаты свидетельствуют об эффективности использования тест-системы для тестирования как штаммов вируса ККГЛ, так и суспензии клещей, собранных в природных очагах инфекции.
Три экспериментально-производственные серии разработанного диагностического препарата «Тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции» представлены в ГИСК им. Л.А.Та-расевича для проведения контроля и определения его диагностической ценности.
Государственные испытания и лабораторный контроль серий проводили в два этапа на базе лаборатории биологии и индикации арбовирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. Все исследуемые образцы перед началом опыта были зашифрованы сотрудниками ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
Контроль серий этого препарата проводили с использованием положительных контрольных образцов: СОПК+ в концентрациях от 5-102 до
5-10 ГЭ/мл и водного раствора кДНК вируса ККГЛ
(штамм IbAr 10200). Отрицательным контролем служили препараты ДНК плаценты человека, суспензия мозга здоровых мышей, суспензия клещей (H. marginatum), не содержащие антигена и РНК вируса ККГЛ.
При лабораторном контроле установили, что аналитическая чувствительность представленных серий препарата с использованием СОПк+ составляла 5-10 ГЭ/мл и соответствовала заявленным показателям.
Для проведения первого этапа испытаний готовили суспензии мозга белых беспородных мышей, инфицированных таджикским штаммом 8973 вируса ККГЛ. В качестве среды разведения использовали физиологический раствор и суспензию клещей H. marginatum. Тестировали различные разведения вируса ККГЛ от 10-1 до 10- . Методом ОТ-ПЦр в тест-системе «ГенКонго» специфический фрагмент кДНК вируса ККГЛ (штамм Тадж. 8973) выявлялся при разведении вируса 10-5 и 10-6, в зависимости от среды разведения, что составило 1 • 102 и 1-101 ГЭ/мл соответственно. Все пробы, используемые в качестве отрицательных контролей в ПЦР, были негативными. Результаты исследований приведены в табл. 1.
Для определения специфичности тест-системы использовали суспензии мозга белых мышей, инфицированных штаммами ККГЛ, выделенными в различных регионах мира, включая территорию Российской Федерации, а также суспензии мозга мышей, зараженных гетерологичными вирусами.
Полученные результаты свидетельствовали о том, что тест-система «ГенКонго» выявляет РНК всех штаммов вируса ККГЛ, использованных в данной работе (табл. 2). Кроме того, положительный результат был получен с РНК вируса Дугбе (штамм
Таблица 1
Изучение чувствительности тест-системы «Г енКонго»
Разведения вируса ККГЛ Среда разведения
Физиологический раствор Суспензия клещей на физ. растворе
10-1 + +
10-2 + +
10-3 + +
10-4 + +
10-5 + +
10-6 - +
10-7 - -
10-8 - -
Примечание: «+» - положительный результат в ПЦР; «-» - отрицательный.
Ar 1792), который, как и вирус ККГЛ, является представителем сем. Bunyaviridae рода Nairovirus и имеет с ним антигенное родство [8]. В остальных случаях получены отрицательные результаты ПЦР.
Для оценки воспроизводимости результатов при применении разработанной тест-системы использовали три отрицательных образца и три пробы, заведомо содержащие РНК вируса ККГЛ (штамм Тадж. 8973) в разведениях 10- , 10-4 и 10-5, которые исследовали в десяти повторах. Воспроизводимость результатов составила 100 %.
На втором этапе испытаний исследованы 34 пула клещей H. marginatum и I. persulcatus (по 10 экз. в каждой пробе), собранных на территории эндемичных (32 пула) и неэндемичных (2 пула) по КГЛ областей России. Из 32 проб - 15 сформированы из клещей вида H. marginatum, собранных на территории Астраханской области в 2003 г., а 17 пулов - из клещей H. marginatum, собранных на территории
Изучение специфичности тест-системы «Г енКонго»
Таблица 2
Семейство, род
Вирусы, штаммы
Год выделения
Место выделения
Результат ПЦР
TogaviridaeAlphavirus
Flaviviridae Flavivirus Bunyaviridae Bunyavirus
Bunyaviridae Phlebovirus
Bunyaviridae Nairovirus
Bunyaviridae Nairovirus комплекс Бханджа
Reoviridae Orbivirus
Orthomyxoviridae комплекс Тогото
Синдбис (Аз. 574)
ВЭЛ (230)
Западного Нила (Аст. 901)
Тягиня (Бардош 92)
Инко (KN 3641)
Москитной лихорадки,
Неаполь (Сэбин) Москитной лихорадки,
Сицилия (Сэбин)
ККГЛ
ККГЛ
ККГЛ
ККГЛ
ККГЛ
ККГЛ
ККГЛ
ККГЛ
ККГЛ
Дугбе
(3010)
(IbAr 10200)
(Уз.10145)
(Аст.22261)
(Аст.22265)
(Тадж.8976)
(Тадж.8973)
(517)
(C68031 China C) (Ar 1792)
Бханджа (Ig 690)
Кемерово (К-10) Дхори (Ig 611313)
1967 Нет данных
2001
1958
1984
1944
1943
1956 1966 1983 1990 1990 1990 1990 Нет данных
1968 1964
1954
1964
1961
Азербайджан нет данных
Астраханская обл.
Чехословакия
Финляндия
Италия
Италия
Конго Нигерия Узбекистан Астраханская обл. Астраханская обл. Таджикистан Таджикистан Болгария Китай Нигерия
Индия
Кемеровская обл. Индия
Ростовской области весной 2004 г. Эктопаразиты, собранные на территории, неэндемичной по КГЛ, представлены клещами вида Ixodes persulcatus.
Проведенные на втором этапе исследования показали, что испытуемая тест-система выявляла 7 (20,6 %) положительных проб клещей. При исследовании этого же материала методом иммунофер-ментного анализа (ИФА) специфический антиген выявлен в 6 случаях (17,6 %). Все положительные в ПЦР пробы были положительными в ИФА и сформированы из клещей, собранных на территории Астраханской области.
Таким образом, показано, что сконструированная тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР обеспечивает высокую точность анализа и может быть использована для проведения эпизоотологического мониторинга природных очагов КГЛ. Отчет о проведенных государственных испытаниях одобрен Ученым советом ГИСК им. Л.А.Тарасевича и утвержден Комитетом МИБП.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Аристова В.А., Колобухина Л.В., Щелканов М.Ю., Львов Д.К. // Вопр. вирусол. - 2001. - № 4. - С. 715. - 2. Бутепко А.М. // РЭТ-инфо. - 2005. - № 2. - С. 5256. - 3. Бутепко А.М., Ларичев В.Ф. //. Изменение климата и здоровья населения России в XXI веке: Матер. междунар.
симпоз. - М., 2004. - С. 134-138. - 4. Здоровье населения и среда обитания. - 2005. - № 4. - С. 56. - 5. Карань Л.С., Шипулин Г.А., Платонов А.Е. // Клин. лаб. диагностика. - 2003. - № 10 - С. 50-54. - 6. Колобухина Л.В., Щел-канов М.Ю., Львов Д.К. // Инфекционные болезни и антимикробные средства: Тез. докл. - М., 2005. - С. 19-20. -7. Черкасский Б. Л. Руководство по общей эпидемиологии. -М.: Медицина, 2001. - 8. Яшина Л.Н., Петров В.С., Вы-шемирский О.И. и др. // Вопр. вирусол. - 2002. - № 4. -С. 11-15.
E.V.Naidenova, I.N.Sharova, S.A.Scherbakova, Yu.I.Yashechkin, N.V.Khutoretskaya, V.F.Larichev, K.A.Sarkisyan, M.S.Vorobyova, A.M.Butenko, A.N.Kulichenko, D.K.L’vov, V.V.Kutyrev
A Test System to Reveal RNA of the Congo-Crimean Hemorrhagic Fever Virus Using RT-PCR Procedure
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov;
D.I.Ivanovsky Virology Research Institute,
L.A.Tarasevich State Institute of Control and Standardization, Moscow
Described in the paper is the development and approbation of a test-system, “GenCongo”, designed for the detection of CCHF virus RNA using the method of reverse transcription combined with polymerase chain reaction. The efficacy of the test-system was verified by the state trials realized at L.A.Tarasevich SICS.
Key words: CCHF virus, laboratory diagnosis, PCR testing.
Поступила 30.05.06.
БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 616.981.452+616.981.455:576.809.7
С.А.Еремин, О.А.Волох, И.А.Шепелев, С.М.Дальвадянц, И.А.Дятлов
РАЗРАБОТКА НОВЫХ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СХЕМ И МАСШТАБИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНОВ ЧУМНОГО И ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБОВ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Описаны различные способы культивирования микроорганизмов и рассмотрены их преимущества и недостатки. Представлены основные направления масштабирования процессов получения антигенов чумного и туля-ремийного микробов, включающие в себя поиск перспективных штаммов продуцентов, выбор способов культивирования, концентрирования, выделения и очистки антигенов.
Ключевые слова: масштабирование, культивирование, химическая вакцина.
С задачами масштабирования исследователи и практики, работающие с вакцинными штаммами, сталкиваются постоянно. Под масштабированием целесообразно понимать теоретически и экспериментально обоснованную совокупность приемов и методов, обеспечивающих создание оптимальных условий при переносе процесса культивирования вакцинных штаммов в пробирке к культивированию их в колбах, бутылях и далее в ферментерах. Для того чтобы процесс был использован в практике, необходимо также обеспечить соответствующий уровень выделения и очистки антигенов, их сушки и стерилизации.
При планировании производства вакцинных
препаратов существенную роль играет выбор процесса культивирования, который сразу должен быть нацелен на конечную цель и соответствовать будущим масштабам производства.
Известно множество способов культивирования. Они различаются по состоянию питательной среды - поверхностные и глубинные, наличию или отсутствию перемешивания - динамичные и статичные, способу действия - закрытые (чаще периодические) и открытые (чаще непрерывные), способу управления - хемостатные, турбидостатные, рН-статные и т. д.
Современный способ культивирования микроорганизмов - это управляемое глубинное культиви-
