CC BY
41
УДК 616-003.923-037.004
ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО РУБЦЕОБРАЗОВАНИЯ
П.М. Лаврешин, В.В. Гобеджишвили, О.В. Владимирова, А.В. Жабина, Х.М. Байчоров, П.И. Чумаков
ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России Ставрополь, Россия
Аннотация. Патологические рубцы образуются у 12—40% лиц, перенесших те или иные операции и травмы. До настоящего времени нет объяснения причины повышенной склонности к образованию у части больных гипертрофических рубцов. Несвоевременная диагностика развития патологического рубцевания, отсутствие эффективных мероприятий, направленных на прогнозирование и профилактику развития этой патологии определяют актуальность проблемы. Цель исследования — конструирование магноиммуносорбентной тест-системы для прогнозирования развития патологического рубцеобразования и определение ее диагностической ценности. В эксперименте и клинике доказана принципиальная возможность использования иммуноферментного анализа с применением антигенного аффинного сорбента с магнитными свойствами для оценки иммунологических сдвигов при развитии патологического рубцеобразования.
Ключевые слова: патологическое рубцеобразование, прогнозирование, тест-система.
По данным ВОЗ ежегодно в мире получают травмы более 50 млн человек, более 100 млн — подвергаются оперативным вмешательствам. Вследствие увеличения количества операций и травм, отсутствия надежных средств и способов профилактики патологическое рубцеобразование не имеет тенденции к снижению [1—3]. Патологические рубцы образуются у 12—40% лиц, перенесших те или иные операции и травмы [4—6]. Особенно часто они формируются у больных молодого, трудоспособного возраста и могут приводить к ограничению физической активности пациентов, тяжелому косметическому дефекту [7]. До настоящего времени нет объяснения причины повышенной склонности к образованию у части больных гипертрофических рубцов, практические врачи не располагают эффективными методами прогнозирования развития, профилактики и лечения этих пациентов. Несвоевременная диагностика развития патологического рубцевания, отсутствие эффективных мероприятий, направленных на прогнозирование и профилактику развития этой патологии определяют актуальность проблемы.
В течение последних десятилетий в медико-биологических исследованиях для избирательного концентрирования различных микроорганизмов и вирусов, их антигенов, иммуноглобулинов различных классов широко используется метод имму-номагнитной сепарации. Для иммунодиагностики диффузных болезней соединительной ткани, оценки динамики тяжести заболеваний, эффективности проводимой терапии предложены иммобилизиро-ванные гранулированные антигенные диагностические препараты с магнитными свойствами на основе полиакриламидного геля (ПААГ).
Цель исследования. Конструирование маг-ноиммуносорбентной тест-системы для прогнозирования развития патологического рубцеобразова-ния и определение ее диагностической ценности.
Материал и методы. Клинические исследования проводилось на базе хирургического отделения МБУЗ «2-я городская клиническая больница» г. Ставрополя у 48 больных, оперированных по поводу острого катарального аппендицита. Экспериментальные исследования на 18 свинках и конст-
----—-
руирование магноиммуносорбентной тест-системы осуществлены совместно с научно-производственной лабораторией препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций (зав. д.м.н., профессор И. С. Тюменцева) ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.
Результаты и обсуждение. Используя принципы получения композиционных органокремне-земных сорбентов, разработан аффинный магно-сорбент для диагностики аутоиммунного процесса при патологическом рубцевании в иммунофер-ментном анализе (ИФА) [4; 8]. В качестве сорбци-онного материала использовали кремнезем — алюмосиликат, химическое модифицирование поверхности которого с целью образования на ней функционально-активных групп, способных ковалентно связываться с белковым лигандом, осуществляли в присутствии полимера — декстрана (полиглюки-на) и поверхностно-активного вещества (ПАВ) — вторичного алкилсульфата натрия.
Процесс изготовления магнитного иммуно-сорбента можно разделить на две основные стадии: 1 стадия — получение магносорбента (МС); 2 стадия — получение магноиммуносорбента (МИС).
Для получения МС к 1,5 г алюмосиликатного наполнителя добавляли 30 мл 6% водного раствора полиглюкина и 3 г магнитного порошка (Fe2O3), перемешивали и проводили гелеобразование при температуре (22 ± 4) °С в течение 2 ч. Значение рН гелеобразования составляло 7,0. Полученный сорбент высушивали при 100—110 °С в течение 30 мин, измельчали и методом рассева выделяли фракции с размером частиц до 50 микрон. Полученный МС имел следующие структурные характеристики: удельная поверхность — 18,5 м2/г, объем пор — 1,19 см3/г, радиус пор — 132,2 нм. Маг-носорбенты были изучены на автоматическом счетчике частиц ТС 10™ («Bio-Rad», США) с применением одноразовых слайдов с камерами для суспензии частиц размером от 4 до 50 мкм в диаметре. Изображение частиц просматривали на экране. Результаты подсчетов экспортировали на внешний USB-носитель (флеш-карту) и просматривали в программе Microsoft Excel на компьютере, далее исследовали гистограмму распределения частиц в образце на основании их диаметра. Магнитные частицы имели однородную структуру без признаков слипания. Для химического активирования поверхности МС использован вторичный алкилсульфат натрия. Оно заключалось в следу-
ющем: к 1 г МС добавляли 7,5 мл дистиллированной воды (ДВ), содержащей 0,25 мл ПАВ. Смесь инкубировали 1—2 ч при температуре (37 ± 1) °С, затем сорбент отмывали 100 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 100 мл ДВ.
Для придания магносорбенту биоспецифических свойств и получения магноиммуносорбента на его поверхность иммобилизовали специфический лиганд, которым служил антигенный руб-цовый комплекс (АРК). Иммобилизацию лиганда проводили следующим образом: к 0,4 мл 10% взвеси МС добавляли 1 мл антигена с концентрацией белка 2,0 мг/мл, инкубировали 2 ч при значении рН раствора 6,0—7,0 и температуре от 22 до 37 °С. Полученный сорбент использован для проведения иммуномагнитной сепарации специфических ауто-антител (Ат) в сыворотках крови морских свинок с избыточным рубцеобразованием и детекции их в иммуноферментном анализе, при этом в качестве твердой фазы вместо полистироловых микропланшет, традиционно используемых при постановке (ИФА), применяли разработанные нами МИС при постановке «сэндвич»-варианта этого метода.
При проведении сочетанного метода МИС + ИФА аутоантитела, содержащиеся в исследуемых сыворотках крови больных, специфически взаимодействовали с АРК, иммобилизованным на МИС. Образовавшийся комплекс «антиген — антитело» выявляли с помощью конъюгата пероксидазного против иммуноглобулинов морских свинок в рабочем разведении (коммерческий препарат НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), который катализировал расщепление хромогена — ортофенилендиамина. Количество связавшегося конъюгата определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксида-зы — перекиси водорода и хромогена. При этом интенсивность окрашивания пропорциональна количеству содержащихся Ат в исследуемом образце сыворотки крови.
Модифицированный «сэндвич» — ИФА с использованием алюмосиликатных МИС проводили следующим образом. В опытные и контрольные флаконы вносили по 50 мкл 10% взвеси МИС. Затем в опытные флаконы вносили по 200 мкл сыворотки крови морских свинок в разведении 1 : 10 и более; во флакон с отрицательным контролем — 200 мкл фосфатносолевого буфера (ФСБ) с 0,05% твина-20. Инкубировали в термостате при температуре (37 ± 1) °С в течение (30 ± 3) мин. После удаления из флаконов жидкости МИС трижды промывали ФСБ с твин -20, придерживая посто-
----—
янным магнитом каждый флакон с сорбентом. Затем во все флаконы вносили по 200 мкл рабочего разведения иммунопероксидазного коньюгата, в который перед внесением добавляли 10 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) на 1 мл коньюгата, инкубировали при (22 ± 4) °С в течение 15 мин, промывали, как описано выше 5—6 раз. После чего во флакон с отрицательным контролем вносили 200 мкл субстрат — индикаторного раствора и наблюдали за реакцией. Как только содержимое флакона начинало желтеть, его в количестве 100 мкл вносили в лунку микропланшета, не захватывая сорбент, и останавливали реакцию внесением 50 мкл стоп-реагента. Аналогичную операцию проводили с опытными образцами. Время регистрации результатов — в течение 1—2 минуты. При положительном результате происходило оранжево-коричневое окрашивание, при отрицательном — раствор ингредиентов реакции оставался бесцветным. Учет результатов проводили на регистрирующем фотометре ИФА-ОЭП (Россия) при длине волны 492 нм. Положительными считали пробы, если их оптическая плотность (ОП) в 1,5 и более раз превышала ОП отрицательного контроля.
Результаты проведенных исследований показали, что равновесный процесс между Ат и МИС наступал через 30 мин, а между образовавшимся комплексом сорбент-Аг-Ат с коньюгатом — через 15 мин .
Для оценки специфичности разработанной тест-системы были получены сыворотки морских свинок с антителами против различных здоровых органов животных. Для чего из печени, легкого, брюшины, внутрибрюшных спаек морских свинок были изолированы водорастворимые антигенные комплексы, которыми иммунизировали животных путем 4-кратных внутримышечных введений с интервалом в 5 дней. При контроле наличия специфических антител в реакции преципитации по Оух-терлони было показано наличие полос преципитации сыворотки при постановке иммуноферментно-го анализа с применением МИС для диагностики избыточного рубцевания. В остальных случаях были получены отрицательные или диагностически недостоверные результаты, что свидетельствовало о достаточной специфичности разработанной тест-системы.
Таким образом, вышеизложенное показывает принципиальную возможность использования им-муноферментного анализа с применением антигенного аффинного сорбента с магнитными свойства-
ми для оценки иммунологических сдвигов при развитии патологического рубцеобразования. Эти опыты дали нам основание создать магноимму-носорбентную антигенную тест-систему для выявления предрасположенности к развитию избыточного рубцевания у человека. При этом в качестве лиганда, иммобилизуемого на поверхность магно-сорбента, использовали водорастворимый антигенный комплекс из патологических рубцов. Технология получения МИС была аналогична при разработке тест-системы для экспериментальных животных.
С целью изучения диагностических возможностей предложенной тест-системы (МТС) для прогнозирования предрасположенности к развитию патологического рубцеобразования, по сравнению с использовавшейся ранее (ТС), были исследованы сыворотки крови 48 больных, оперированных ранее (аппендэктомия), у которых через месяц стали формироваться гипертрофические рубцы. Изучения сывороток этих пациентов в им-муноферментном анализе с МИС с АРК, выделенными из обычного послеоперационного рубца, дали отрицательный результат в сроки от 30 до 60 суток.
МТС с антигенными комплексами из патологических рубцов в те же сроки исследования с сыворотками крови изучаемой группы больных дали положительную реакцию в разведениях последней 1 : 80—1 : 640. Обращает на себя динамика изменений титра антител сывороток крови больных в разные сроки исследования. На 30 сутки сыворотки крови всех исследуемых с избыточным рубцеобразованием давали реакцию с МТС в разведении 1 : 80, а в разведении 1 : 160 лишь в 22 (45,8%) случаях, в разведении 1 : 320 — только у 8 (16,7%) пациентов. С 30 до 45 суток эта динамика изменялась: увеличивалось число пациентов, сыворотки которых давали положительную реакцию в титрах 1 : 160 и 1 : 320 — 26 (54,2%) и 15 (31,3%) соответственно. У 6 (15,8%) больных реакция зафиксирована с титром сыворотки 1 : 640. Результаты иммуноферментного анализа сывороток больных с избыточным рубцеобразованием к 60 суткам показывали тенденцию к нарастанию положительных реакций сывороток крови пациентов с МИС в разведениях 1 : 160 — 1 : 640.
ТС с АРК из патологических рубцов в те же сроки исследования с сыворотками крови этой же группы больных дала положительную реакцию в разведениях последней 1 : 80 — 1 : 320 в значи-
тельно меньшем количестве случаев. Результаты проведенного исследования доказали более высокую диагностическую ценность МТС по сравнению с ТС. Следует отметить, что если число положительных реакций сыворотки крови больных с МТС в ИФА при разведении сыворотки 1 : 160 выше в 1,2 раза, то при титре сыворотки 1 : 640 — в 2,6 раза.
Кроме того, нами были приготовлены тест-системы, белковым лигандом которых служили различные типы коллагена (I, III, V и VII). Проведено сравнительное изучение реакций сыворотки крови 40 больных, у которых имелся патологический рубцовый процесс. Оказалось, что только тест-система, содержащая в качестве лиганда АРК, достоверно указывает на предрасположенность к развитию патологического рубцевания. Ближе всего по информативности к ним стоят тест-системы с коллагеном типа 5—7, но полученные с их помощью данные недостоверны для прогнозирования развития изучаемых патологических процессов (Р > 0,05). Это дает основание сделать вывод о более высокой диагностической ценности и информативности модифицированной нами магноим-мунносорбентной тест-системы для прогнозирования развития патологического рубцеобразования в иммуноферментном анализе.
Вывод. Сконструированная нами магноим-мунносорбентной тест-системы для прогнозирования развития патологического рубцеобразования в иммуноферментном анализе обладает высокой диагностической ценностью и информативностью.
ЛИТЕРАТУРА
1. Галлямова Ю.А., Кардашова З.З. Гипертрофические и келоидные рубцы // Лечащий врач. 2009. № 10. С. 20—23.
2. Кондратьева Ю.С., Неверова Е.Ю. Рубцы кожи: методическое пособие. М.: ЗАО «МираксФарма», 2010.
3. Адмакин А.Л., Санников М.В. Опыт применения комплексного подхода в системе реабилитации пострадавших с послеожоговыми рубцами и контрактурами // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. 2010. № 3. С. 40—44.
4. Прогнозирование и профилактика избыточного рубцеобразования после операций по поводу эпителиального копчикового хода / П. М. Лаврешин, В. К. Гобед-жишвили, В.И. Линченко, С.С. Кораблина, В.В. Гобед-жишвили, Х.М. Байчоров // Колопроктология. 2015. № 1 (51) (прил). С. 28—28.
5. Gupta S., Sharma V.K. Standard guidelines of care: Keloids and hypertrophic scars // Indian J. Dermatol. Ve-nereol. Leprol. 2011. Vol. 77. № 2. P. 94—100.
6. Профилактика избыточного рубцеобразования после иссечения эпителиального копчикового хода / П.М. Лаврешин, В.Я. Горбунков, И.Е. Вартанов, В.В. Го-беджишвили, О. В. Владимирова, С. С. Кораблина, Д.Ю. Никулин // Амбулаторная хирургия. 2012. № 3 (47). С. 20—23.
7. Hypertrophic Scarring and Keloids: Pathome-chanisms and Current and Emerging Treatment Strategies / G.G. Gauglitz, H.C. Korting, T. Pavicic [et al.] // Mol. Med. 2011. Vol. 17. № 1-2. P. 113—125.
8. Афанасьев Е. Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоо-нозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Ростов-на-Дону, 2000.
TEST-SYSTEM FOR PROGNOSIS OF PATHOLOGICAL SCARRING
P.M. Lavreshin, V. V. Gobedgishvili, O. V. Vladimirova, A. V. Zhabina, H.M. Baychorov, P.I. Chumakov
FSBEE HE "Stavropol State Medical University " of the Ministry of Health of the Russian Federation Stavropol, Russia
Annotation. Pathological scars are formed in 12—40% of individuals undergoing certain surgeries and injuries. There is no reasons explanation for an increased tendency to form in some patients hypertrophic scars, even in modern literature.
Late diagnosis of pathological scarring, lack of effective measures aimed at forecasting and prevention of this pathology development are determines the actuality of the problem. The purpose of research — to design magnoimmunosorbtion test-systems to predict the development of pathological scars and to determinate its diagnostic value.
It was proofed in the experiment and in clinical trial the possibility to use the enzyme immunoassay with antigen affinity sorbent with magnetic properties for the assessment of immunological changes during the development of pathological scars.
Key words: pathological scarring, prognosis, test-system.
—--—-
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
~ 49 ~
REFERENCES
1. Galljamova Ju.A., Kardashova Z.Z. Gipertrofi-cheskie i keloidnye rubcy. Lechashhij vrach, 2009, no. 10, pp. 20—23.
2. Kondrat'eva Ju.S., Neverova E.Ju. Rubcy kozhi: me-todicheskoe posobie. Moscow, ZAO "MiraksFarma", 2010.
3. Admakin A.L., Sannikov M.V. Opyt primenenija kompleksnogo podhoda v sisteme reabilitacii postradavshih s posleozhogovymi rubcami i kontrakturami. Mediko-bio-logicheskie i social'no-psihologicheskie problemy bezopas-nosti v chrezvychajnyh situacijah, 2010, no. 3, pp. 40—44.
4. Lavreshin P.M., Gobedzhishvili V.K., Linchen-ko V.I., Korablina S.S., Gobedzhishvili V.V., Bajcho-rov H.M. Prognozirovanie i profilaktika izbytochnogo rub-ceobrazovanija posle operacij po povodu jepitelial'nogo kop-chikovogo hoda. Koloproktologija, 2015, no. 1 (51) (pril),. pp. 28-28.
.5 Gupta S., Sharma V.K. Standard guidelines of care: Keloids and hypertrophic scars. Indian J. Dermatol. Vene-reol. Leprol, 2011, vol. 77, no. 2, pp. 94—100.
6. Lavreshin P.M., Gorbunkov V.Ja., Vartanov I.E., Gobedzhishvili V.V., Vladimirova O.V., Korablina S.S., Nikulin D.Ju. Profilaktika izbytochnogo rubceobrazovanija posle issechenija jepitelial'nogo kopchikovogo hoda. Am-bulatornaja hirurgija, 2012, no. 3 (47), pp. 20—23.
.7 Gauglitz G.G., Korting H.C., Pavicic T. et al. Hy-pertrophic Scarring and Keloids: Pathomechanisms and Current and Emerging Treatment Strategies. Mol. Med., 2011, vol. 17, no. 1-2, pp. 113—125.
8. Afanas'ev E.N. Nauchno-metodicheskie aspekty jekspress-diagnostiki vozbu-ditelej osobo opasnyh zoonoz-nyh infekcij (chuma, brucellez, sibirskaja jazva): avtoref. dis. d-ra med. nauk. Rostov-na-Donu, 2000.
