CC BY
9
I
МАГНОИММУННОСОРБЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПОВЫШЕННОЙ НАКЛОННОСТИ К СПАЙКООБРАЗОВАНИЮ ПОСЛЕ АБДОМИНАЛЬНЫХ ОПЕРАЦИЙ
В.К. Гобеджишвили
MAGNOMMUNOSORBENT TEST-SYSTEM FOR THE PROGNOSTICATION OF HEIGHTENED INCLINATION TO COMMISSURE FORMATION AFTER ABDOMINAL OPERATIONS
Gobedzhishvily V.K.
On the account of experimental research upon guinea-pigs we can assume that surgical operation is a non-specific starting moment, and the cause of individual heightened inclination to abdominal commissure formation is autoimmune injury of peritoneum. The possibility to extract an autoantigen from abdominal commissures, to produce antibody for this antigen (anti-commissure serum) of experimental animals has been proved. The aggressiveness of the serum becomes apparent in guinea-pigs' pathological changes after its injection
На основании проведенных экспериментальных исследований на морских свинках можно полагать, что оперативное вмешательство является неспецифическим пусковым моментом, а причиной индивидуальной повышенной склонности к формированию внутрибрюшных спаек является аутоиммунное повреждение брюшины. Доказана возможность выделения аутоантигена из внутрибрюшных спаек, выработки антител на этот антиген у экспериментальных животных (антиспаечная сыворотка), агрессивность этой сыворотки - появление у них патологических изменений после ее введения.
УДК 617.55-089:616-079.2
«Страшным бичом полостной хирургии» называл Реме Лериш послеоперационные спаечные осложнения. Этот постулат сохраняет свою значимость и в настоящее время. Частота заболевания, трудности своевременного распознавания, во многом неудовлетворительные исходы лечения делают проблему спаечного синдрома постоянно актуальной. По данным Международного спаечного общества (International Adhesion Society) по поводу спаечной болезни ежегодно в хирургических отделениях лечится около 1% прооперированных ранее больных, у 50-75% этой категории больных развивается кишечная непроходимость, от которой, по данным большинства отечественных и зарубежных авторов, смертность составляет от 13% до 55%. D. Menzies et al. (1990) отметили, что в группе пациентов перенесших несколько лапаротомий, спаечный процесс развивается в 93% наблюдений, а после одной лапаротомии - только в 10,4%. Спаечная кишечная непроходимость составляет 60-90% всех случаев (6, 13, 15 и др.). Особенно высока она среди больных пожилого и старческого возраста (2).
До настоящего времени окончательно не выяснено, почему после одинаковых операций у некоторых больных развиваются спайки в брюшной полости, у а других нет? Почему у одного и того же пациента в одном участке повреждения брюшины спаечный процесс развивается, а в другом нет?
Для доказательства роли аутоиммунной агрессии в повышенной наклонности к
ы
ШГобеджишвили В.К.
«Магноиммунносорбентная тест-система для прогнозирования...»
спайкообразованию выполнена экспериментальная работа. В опытах были использованы морские свинки обоего пола породы весом 0,2-0,25 кг. При проведении опытов в этой группе необходимо было получить иммунную сыворотку, содержащую антитела к спайкам из брюшной полости морских свинок.
Для получения аутоантигена необходимо было получить спайки из брюшной полости животных. Для этого под наркозом 6 животным выполняли лапаротомию с соблюдением правил асептики. Десерози-ровали тонкую и толстую кишку марочным способом по 10-20 участков размерами 0,51,0. Операционную рану передней брюшной стенки ушивали 2-рядным шелковым швом. Одна свинка погибла на 6 сутки после операции. Остальные 5 животных умерщвлены через 70 дней после операции. После 30 суток спаечный процесс в брюшной полости выявлен у 2 животных. Для выделения аутоантигена из спаек, полученных от 2 морских свинок, брали материал, который гомогенизировали путем растирания с кварцевым песком и воздействием ультразвука. Извлечение белкового водорастворимого аутоантигена осуществляли водно-солевой экстракцией (3% хлоридом натрия) с последующей очисткой путем переосаждения сернокислым аммонием. Лиофилизированный антиген имел вид пористой таблетки светло-коричневого
Для получения гипериммунной сыворотки против спаечного аутоантигена нами была использована оригинальная схема иммунизации водорастворимыми антигенами с использованием иммуномодулятора-ферак-рила, разработанного И. С. Тюменцевой (1996). Свинкам вводили по 0,1 мл 3% водно-спиртового раствора феракрила в подушечки задних лап. На 5-7 день спаечный водорастворимый антиген смешивали с 10 мл 1% водно-спиртового раствора феракрила и по 0,1 мл вводили в подколенные лимфатические узлы. Через три дня такую же смесь вводили внутримышечно трехкратно с промежутками в 4 дня. На 30 день от животных получали по 4 мл иммунной сыворотки, добавляли половинную дозу антигена в каж-
дую сыворотку. Полученный комплекс антиген-антитело вводили четырехкратно по 1 мл с промежутками в 3-4 дня внутримышечно тому же животному, от которого получена иммунная сыворотка.
В процессе иммунизации при отработке указанной схемы 15 свинок были разделены на 3 группы по варьированию дозы аутоантигена. Животных первой группы иммунизировали по названной схеме, вводя по 1,5 мг антигена каждому кролику на одну инъекцию. Второй группе животных вводили по 2 мг, третьей - по 3 мг. Специфическую активность полученных гипериммунных сывороток оценивали в реакции имму-нодиффузии в агаровом геле по Оухтерлони.
У животных первой и второй групп развивалась ответная иммунологическая реакция, но титры специфических антител в сыворотках были невысокими и не превышали в РИД - 1:2,4+0,62 - 1:5,6+1,25. Титры специфических антител гипериммунной сыворотки у всех животных третьей группы повышались в течение всей гипериммунизации и достигали показателей 1:8,8+0,62 -1,48+0 в РИД после окончания основного цикла. Таким образом, оптимальная однократная доза водорастворимого спаечного аутоантигена составила 3 мг. Выбранная нами схема гипериммунизации позволила получить высокотитражные антисыворотки у 100% животных.
Через каждые 3 дня пятикратно 15 морским свинкам внутривенно вводилась гипериммунная сыворотка против спаечного аутоантигена в дозе 0,5 мл /кг массы.
В этой группе опытов от анафилактического шока погибло две свинки. На секции макроскопически у них отмечалась гиперемия брюшины, особенно висцеральной, полнокровие сосудов большого сальника. В брюшной полости у одного животного обнаружена гемморрагическая жидкость, а у второго, кроме того, имелись сгустки крови. При микроскопическом исследовании в брюшине отмечены циркуляторные нарушения в виде гиперемии и отека ее. В слизистой и подслизистой оболочках кишки имела место незначительная лимфоидная и эо-зинофильная инфильтрация.
Через 15 дней после введения иммуноагрессивной сыворотки 13 свинок были оперированы. При лапаротомии регистрировались результаты введения гипериммунной сыворотки против спаечного аутоантигена. У 8 из них обнаружен серозный перитонит. Отмечалась гиперемия брюшины и большого сальника, обильный серозный экссудат, который быстро свертывался при изъятии его из брюшной полости, что указывало на наличие в нем большого количества фибрина. У 2 животных имел место фибринозный осумковывающий перитонит. Кишечник у них был окутан слоем плотного фибрина толщиной до 0,3 см с многочисленными сращениями между кишечными петлями и кишечных петель с париетальной брюшиной. При гистологическом исследовании обнаружено, что висцеральная брюшина (1) отечна, диффузно инфильтрирована нейтрофильными лейкоцитами (2), пропитана фибрином (3) (рис. 1). Сероза утолщена (1) с формированием микроабсцессов
(2), парез кровеносных сосудов
(3), полнокровие (рис. 2).
Таким образом, у свинок уже после введения иммуноагрес-сивной сыворотки без оперативного вмешательства развился осумковывающий гнойно-фибринозный перитонит. На данном этапе эксперимента показано, что при возможном появлении в организме аутоантител к ткани измененной брюшины может возникать богатый фибрином зкссудативный и реже адгезивный перитонит.
После лапаротомии была произведена аппликация фиксированного спаечного антигена. С этой целью антиген иммобилизи-ровали на поверхности сорбента-аллюмоси-ликата в течение одного часа при комнатной температуре. Затем несвязанный антиген дважды отмывали в фосфатно-солевом бу-
Рис. 1. Микрофото. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 16х7х1,1.
Рис. 2. Микрофото. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 16х7х1,1.
фере центрифугированием при 4000 g 20+5 минут. Патологические изменения, возникшие в брюшной полости у животных после такой операции, регистрировались через 1530 дней или в первые дни после операции в связи с их гибелью.
На 4 сутки после операции погибла одна морская свинка. При вскрытии у нее выявлено склеивание кишечных петель между собой и с париетальной брюшиной, геморрагический экссудат и фибринозный налет на кишечных петлях, парез кишечника (рис. 3). Гистологически обнаружена картина гнойно-фибринозного перитонита. Еще 2
Гобеджишвили В.К.
«Магноиммунносорбентная тест-система для прогнозирования...»
свинки погибли при явлениях спаечной кишечной непроходимости через 6 дней после операции.
Через 15-30 дней после операции 10 свинок, у которых послеоперационный период протекал спокойно, были умерщвлены. На секции распространенные сращения в брюшной полости обнаружены у 7 животных. Серозный экссудат от 2 до 7 мл выявлен у 6 животных. Фибринозный налет и островки организующегося фибрина на петлях кишечника отмечались у двух свинок. Гистологически обнаружено, что в большинстве случаев висцеральная брюшина значительно утолщена с разрастанием фиб-
Рис. 3. Склеивание кишечных петель между собой и париетальной брюшиной.
1
, V-
V
щ
и ,
Г '< I " . ■ Е
Щ/*', V у?- ■■
* ? ч. Г __■
■ ' ' " г/ ■ '1 1 'V1 *■ ^
Рис. 4. Микрофото. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 16х7х1,1.
ринозных волокон (1) и юной грануляционной ткани (2) (рис. 4).
Таким образом, внутрибрюшные спайки выявлены у 7 морских свинок из 10 прооперированных, т.е. в 70% случаев. В то же время, при механической травме брюшины 6 свинок спайки развились только у 2 (33,3%).
На основании проведенных исследований, учитывая, что кроме мезотелия все остальные слои представлены коллагеновы-ми и эластическими волокнами, можно полагать, что наличие распространенного спаечного процесса в брюшной полости является проявлением системной патологии соединительной ткани с аутоиммунным компонентом. Оперативное вмешательство является неспецифическим пусковым моментом, а причиной индивидуальной повышенной склонности к формированию внутрибрюшных спаек является аутоиммунное повреждение брюшины. Проведенное нами экспериментальное исследование доказало возможность выделения ауто-антигена из внутрибрюшных спаек, выработки антител на этот антиген у экспериментальных животных (антиспаечная сыворотка), агрессивность этой сыворотки - появление у них патологических изменений после ее введения.
Диагностика спаечной болезни до настоящего времени остается одной из важных и недостаточно решенных проблем современной гастроэнтерологии. В основном она базируется на топических методах исследований: рентгенологических, ультразвуковых, жидкокристаллической цветной термографии, лапароскопии (4, 7, 8, 9, 10 и др.). Определенную информацию о протекающем спаечном процессе дают цитологическое исследование пе-ритонеального экссудата (3), а также некоторые биохимические показатели (например, определение концентрации сиаловых кислот в сыворотке крови больных (6, 12). Вышеназванные методы исследований не всегда дают
ясную картину развития спаечной болезни. В связи с чем, пополнение арсенала лабораторных методов исследований, позволяющих получить дополнительную информацию для установления диагноза, весьма своевременно и актуально.
В последние годы с целью повышения чувствительности и специфичности лабораторных методов, а также для создания новых диагностических тест-систем стали применять иммуносорбционные методы на основе иммобилизированных антигенов и антител. Магнитные свойства иммуносорбентов позволяют быстро и эффективно отделять твердую фазу с иммобилизованными лиган-дами из реакционной среды, избегая многократного процесса центрифугирования. Дополнительное преимущество применения магносорбента имеет место на этапах перемешивания. Наконец, процесс анализа с использованием магносорбента легко поддается автоматизации (5). Для придания сорбентам биоспецифических свойств в структуру или на их поверхности иммобилизуют различные лиганды (антигены, иммуноглобулины, ингибиторы, ферменты ганглиозиды и т.д.).
С целью разработки сорбционного материала, обладающего стандартностью состава и структурных характеристик, повышения специфической емкости и чувствительности, упрощения способа получения магноиммуносорбента Е.Н. Афанасьевым (2000) разработана биотехнология органок-ремнеземного магносорбента на основе алюмосиликата, модифицирование поверхности которого осуществляли в присутствии полисахаридного полимера декстрана и вторичного алкилсульфата натрия (1).
Используя принципы получения биотехнологических композиционных магно-иммуноросбентов на основе алюмосиликата, нами впервые изготовлена магноиммуно-сорбентная тест-система для диагностики спаечного процесса в иммуноферментном анализе. Белковым лигандом служил водорастворимый спаечный кроличий аутоанти-ген.
Способ получения магносорбента заключался в следующем: смесь, состоящую
из 2,5 г алюмосиликатного наполнителя и 0,5 г магнитного порошка, суспендировали в 40 мл 0,2-0,4 % водного раствора полиглю-кина и далее выдерживали при комнатной температуре один час. Полученный сорбент высушивали при температуре 100-110°С в течение 30 мин. К одному грамму полученного препарата добавляли 12 мл 23% раствора хлорида натрия и 1 мл вторичного ал-килсульфата натрия. Смесь инкубировали 12 часа при температуре 37°С, затем сорбент отмывали 100 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 100 мл дистиллированной воды.
Для оптимизации условий иммобилизации специфического аутоантигена на маг-носорбенте исследовали ряд параметров: концентрацию белка антигена (от 0,5 до 10 мг/мл); время (1-24 часа) и температуру (4°С, 10оС, 20°С, 37°С и 50°С) инкубации, рН среды иммобилизации (5-9,5). Исследования показали, что концентрация белка ли-ганда 3,5 ±0,1 мг/мл является оптимальной. При меньшей нагрузке возрастала вероятность возникновения неспецифических реакций. При использовании антигена с концентрацией белка больше 4 мг/мл адсорбционная емкость магносорбента снижалась. Максимальная адсорбционная емкость сорбента наблюдалась при температуре от 4°С до 40°С и экспозиции - 1-1,5 часа (время полного насыщения белком), но при температуре ниже 10°С процесс адсорбции замедлялся (до 1,5 часов при 4°С), без потери качества. Повышение температуры далее и особенно до 50°С при иммобилизации ли-ганда, снижало адсорбционную емкость (до 15%) и специфическую активность магно-сорбента. Поэтому оптимальной температуру иммобилизации мы определили 20±2°С и время экспозиции - 1 час. Изменение рН реакционной смеси в пределах от 5 до 9,5 не оказывало существенного отрицательного воздействия на те же характеристики магно-сорбента. В связи с вышеизложенным, процесс сорбции сводился к следующему: 0,1 г активированного сорбента приливали 1 мл спаечного аутоантигена с содержанием белка 3,5+0,1 мг/мл, рН - 7,2. Смесь оставляли при 20о+2оС в течение одного часа. Далее надосадочную жидкость удаляли, а носитель
ы
ШГобеджишвили В.К.
«Магноиммунносорбентная тест-система для прогнозирования.»
промывали 0,15 М раствором хлорида натрия до «О» экстинции на спектрофотометре.
Полученные композиционные алюмо-силикатные магноиммуносорбенты представляли собой высокодисперсные микрогранулы неправильной формы с ярковыра-женными магнитными свойствами, обладающие хорошей смачиваемостью и эффективным оседанием в растворе, отсутствием склонности к конгломерации. Сорбенты имели размеры гранул от 70 до 100 мкм. Среднее значение их удельной поверхности 117 м2/г, средний радиус пор - 35 нм, объем пор 1,7 см3/г (рис. 5).
Рис. 5. Композиционные алюмосиликатные магноиммуносорбенты. Увеличение в 100 раз.
Приготовлено 5 экспериментальных серий магноиммуносорбентов для иммуно-ферментного анализа. Для проведения им-муноферментного анализа во флаконы (типа пенициллиновых) вносили по 100 мкл 10% взвеси магноиммуноросбента. Затем в опытные флаконы вносили по 200 мкл сывороток крови экспериментальных кроликов с развившейся спаечной болезнью. Параллельно ставили два контроля: один - с нормальной кроличьей сывороткой, другой - с фосфат-но-солевым буферным раствором (по 200 мкл). Через 30+5 минут инкубации при температуре 37°С после тщательной промывки гранул сорбента с помощью постоянного магнита во все флаконы (опытные и контрольные) вносили по 200 мл конъюгата
иммунопероксидазного против глобулинов кролика в рабочем разведении (коммерческий препарат НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Через 30+5 минут после отмывки гранул во флаконы вносили по 200 мл субстрат - индикаторного раствора (0,1 М лимонная кислота с 0,2 М натрием фосфорнокислым в присутствии 0,006% перекиси водорода). Реакцию останавливали внесением во флаконы по 0,2 мл 2 М серной кислоты. Учет результатов проводили визуально через 1-5 мин. При положительном результате происходило оранжево-коричневое окрашивание, при отрицательном - раствор ингредиентов реакции оставался бесцветным. Для учета результатов на анализаторе колориметрическом «Мультискан» содержимое флаконов после остановки реакции переносили в микропланшеты и снимали показания прибора при 492 нм. Положительными считали пробы, показатели цвета которых в 1,5 и более раз превышали контрольные. У кроликов со спаечной болезнью титры специфических антител варьировали в пределах 160±16,75 - 320±33,5. Сыворотки здоровых животных дали отрицательный результат.
Для оценки специфичности разработанной тест-системы необходимо было получить кроличьи сыворотки с антителами против различных здоровых органов животных. Для чего из печени, селезенки, легкого, брюшины кроликов были изолированы водорастворимые антигенные комплексы, которыми иммунизировали кроликов путем 4-х кратных внутривенных введений с интервалом в 5 дней. При контроле наличия специфических антител в реакции преципитации по Оухтер-лони было показано наличие полос преципитации сыворотки с соответствующим антигеном. В то же время при постановке им-муноферментного анализа с применением магноиммуносорбентов для диагностики спаечного процесса были получены отрицательные результаты, что свидетельствовало о достаточной специфичности разработанной тест-системы.
Таким образом, вышеизложенное показывает принципиальную возможность использования иммуноферментного анализа с применением антигенного аффинного сорбента с магнитными свойствами для оценки иммунологических сдвигов при развитии спаечной болезни. Эти опыты дали нам основание сконструировать магноиммуносор-бентную антигенную тест-систему для диагностики подобного заболевания у человека. При этом в качестве лиганда, иммобилизуемого на поверхность аллюмосиликатного магносорбента, использовали водорастворимый антигенный комплекс из спаек брюшной полости оперированных больных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Афанасьев Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагности-ки возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва). - Автореф. дис. ... д-pa, мед. наук. - Ростов-н/Д., 2000. - 28 с.
2. Гатауллин Н.Г., Хунафин С.Н. Спаечная болезнь брюшины: Обзор // Клин. хирургия. -1971. - № 10. - С. 2025.
3. Женчевский Р.А. Спайки брюшной полости. - Ставрополь, 1984. - 159 с.
4. Евтихов P.M., Грошев Н.Н., Никитин ВА. и др. Результаты ультразвуковой диагностики при острой кишечной непроходимости // IX Всерос. съезд хирургов.-Волгоград, 2000. - С. 161-162.
5. Ефременко В.И., Пушкарь В.Г., Трофимов Е. Н. и др. Получение и применение магнитных сорбентов в методах иммуноанализа микроорганизмов //ЖМЭИ. - 1989. - № 12. - С. 100-106.
6. Кургузов О.П., Кузнецов НА, Артюхина Е.Г. Профилактика спаечной болезни: Обзор // Хирургия. -1990. -№ 10. -С. 153-159.
7. Рыбачков В.В., Гужков О.Н., МайровМ.И. и др. Послеоперационная ранняя кишечная непроходи-
мость // IX Всерос. съезд хирургов // IX Всерос. съезд хирургов. - Волгоград, 2000. - С. 209-209.
8. Седов В.М., Соловейчик А.С., Лушицкий A.M. и др. Диагностика и лечение острой спаечной кишечной непроходимости //Клин. медицина. -1996. -№ 2. - С. 65-65.
9. Совцов С.А., Подшивалав В.Ю., Абдуллин С.Г. Новые подходы к диагностике и лечению острой кишечной непроходимости // IX Всерос. съезд хирургов. -Волгоград, 2000. - С. 213-213.
10. Тимербулатов В.М., Хунафин С.Н., Гаттаров И.Х. и др. Клиника и хирургическое лечение спаечной кишечной непроходимости // Вестн. хирургии. - 1999. - № 6. - С.36-39.
11. Тюменцева И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций: Автореф. дис.... д-ра. мед. наук. - Саратов, 1996. - 57 с.
12. Харин В.Г. Значение системы мононууклеарных фагоцитов в патогенезе избыточного спайкообразо-вания при перитоните у детей // Педиатрия. -1990. - № 8. - С. 49-51.
13. Черенько М.П., Бойков Я.П., Яцентюк М.Н. Клиника, лечение и профилактика спаечной и другой кишечной непроходимости // Клин. хирургия. - 1988. -№ 2. - С. 3-5.
14. Menzies D, Ellis H. Intestinal obstruction from adhesions - how big is the problem? //Ann. R Coil. Surg. Engl. -1990. - V. 72. - P. 60-63.
15. PijlmanB.M., DorrP.Y., BrommerE. etal. Peritoneal adhesions: causes and prevention // Eur, J. Obstet. Gynekol. Repod Biol. - 1994. - V. 53. - № 3. -P. 155-163.
Об авторе
Гобеджишвили Владимир Кишвардиевич,
кандидат медицинских наук, доцент кафедры, общей хирургии Ставропольской государственной медицинской академии. Сфера научных интересов - абдоминальная хирургия, проктология.
