CC BY
99
технологии индукции клеточного противоопухолевого иммунного ответа in vitro
С.В. Сенников, Е.В. Куликова, И.А. Облеухова, Ю.А. Шевченко
Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии, Новосибирск, Россия
Technologies of cellular antitumor immune response induction in vitro
S.V. Sennikov, E.V. Kulikova, I.A. Obleukhova, JA. Shevchenko
Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology, Novosibirsk, Russia
Дендритные клетки являются «профессиональными» антиген-презентирующими клетками и наиболее мощными стимуляторами различных иммунных ответов организма, в том числе противоопухолевого . Современными исследованиями показано, что при злокачественных новообразованиях у пациентов не происходит формирования эффективного противоопухолевого иммунного ответа . Во многом, это связано со снижением функциональной активности дендритных клеток у онкологических больных за счет нарушений в процессе созревания до функционально-активных форм и в процессе презентации антигена наивным Т-лимфоцитам . В обзоре освещены основные этапы технологии индукции клеточного противоопухолевого иммунного ответа in vitro, направленные на решение проблем, препятствующих полноценному функционированию дендритных клеток, и на дополнительную стимуляцию противоопухолевого иммунного ответа, а также перспективы развития технологии
Ключевые слова: дендритные клетки, противоопухолевый иммунный ответ, онкологические заболевания
Dendritic cells are "professional" antigen-presenting cells and the most potent stimulators of various immune responses of the organism, including antitumor . Modern studies have shown that an effective antitumor immune response doesn't occur in patients with malignant tumors . This is largely due to a decrease in functional activity of dendritic cells in cancer patients through irregularities in the maturation process to a functionally active form and in the antigen presentation process to naive T lymphocytes This review describes the main stages in technology of cellular antitumor immune response induction in vitro, aimed at resolution of the problems blocking the full functioning of dendritic cells, and additional stimulation of antitumor immune response, as well as prospects for the technology development
Keywords: dendritic cells, antitumor immune response, cancer
Введение
В настоящее время прогресс в лечении пациентов с онкологическими заболеваниями связан с существенным прорывом в молекулярной биологии, иммунологии, биотехнологии, а также с пониманием причин возникновения опухолевого роста и закономерностей патогенетических механизмов злокачественного перерождения . В организме существует целый ряд механизмов и систем, позволяющих ему противостоять возникновению и развитию опухоли. К ним, прежде всего, относят иммунную систему, работа которой направлена на распознавание и элиминацию клеток, несущих признаки антигенного отличия от нормальных тканей человека
Исследованиями последних десятилетий показано, что при злокачественных новообразованиях не происходит формирования протективного противоопухолевого иммунного ответа [1, 2]. Это может быть обусловлено несколькими причинами: недостаточной иммуногенностью опухолевых клеток, способностью опухоли вызывать местную или системную иммунодепрессию различными факторами (интерлейкин-10 (ИЛ-10), трансформирующий фактор роста-p (TGF-p), сосудистый эндотелиаль-ный фактор роста (VEGF)) со снижением активности Т-лимфоцитов, нарушением механизма представления опухоль-ассоциированного антигена [2—4]. В настоящее время одним из наиболее перспективных подходов в лечении онкологических больных является селективная активация Т-клеточного противоопухолевого иммунитета с помощью иммунокомпетент-ных клеток . Ключевым звеном в реализации этой задачи являются дендритные клетки (ДК) . Дендритные клетки способны распознавать и представлять
e-mail: sennikov_sv@mail . ru
антигены Т- и В-лимфоцитам в ансамбле с молекулами главного комплекса гистосовместимости i и ii классов (MHC i и MHC ii), которые экспрессируют-ся в большом количестве на поверхности клеток наряду с костимуляторными молекулами (CD80, CD86) [5, 6]. Поэтому зрелые ДК демонстрируют высокую способность презентировать опухоль-ассоциирова-ные антигены in vitro и in vivo [7, 8]. Однако функциональная активность ДК у онкологических больных значительно снижена [9]. Основной причиной этого считают нарушения в процессе созревания ДК до функционально-активных форм, а также в процессе презентации антигена наивным Т-лимфоцитам [10]. В связи с этим получение функционально-активных ДК in vitro, активация их опухоль-специфичными антигенами для индукции цитотоксического ответа, а также повышение эффективности презентации антигена с последующим увеличением количества цито-токсических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) за счет определенных костимуляторных молекул и цитокинов является перспективным при разработке противоопухолевых вакцин на основе ДК и позволяют мобилизовать защитные системы организма больного
Таким образом, перечисленные выше научные задачи формируют отдельные этапы, которые являются основой технологий индукции клеточного противоопухолевого иммунного ответа in vitro, и включают в себя получение зрелых ДК, доставку опухолевых антигенов в ДК, стимуляцию противоопухолевого клеточного иммунного ответа и оценку его эффективности Обзор посвящен описанию современного состояния разработок каждого этапа и перспективам развития технологий индукции противоопухолевого иммунного ответа в целом
Использование различных протоколов
генерации незрелых и зрелых дендритных
клеток
Технологии, индуцирующие «созревание» ДК ex vivo, повторяют комплекс биологических процессов в ответ на инфекцию патогенами, но они до сих пор имеют ограничения в генерации ДК, способных вызывать эффективный противоопухолевый иммунитет . Широкое распространение получило использование протокола созревания ДК из моноцитов периферической крови человека с применением четырех факторов (фактор некроза опухоли — а (ФНО-а), интерлейкин-1а (ИЛ-1а) или интерлейкин-1р (ИЛ-1р), интерлейкин-6 (ИЛ-6) и простагландин Е2 (ПГЕ2)) . Проведенная D. Schadendorf с соавт . (2006) III фаза клинического исследования показала, что вакцинирование пациентов, больных мела-номой, дендритными клетками, созревающими под действием этого цитокинового «коктейля», не имеет преимуществ перед стандартной дакарбазиновой химиотерапией, что может быть связано с неоптимальными условиями созревания и, следовательно, с недостаточной презентационной активностью ДК [11]. Основным виновником неэффективности протокола в формуле цитокинового «коктейля» считают ПГЕ2 . Несмотря на то, что присутствие ПГЕ2 в протоколе индукции созревания обуславливает получение ДК ex vivo со способностью к миграции, этот медиатор в условиях микроокружения опухоли может приводить к поляризации Т-клеток к фенотипу Т-хелперов 2 типа (Тх2) и запускать дифферен-цировку ДК, секретирующих иммуносупрессивный цитокин — ИЛ-10 . Кроме того, на примере больных миеломой было обнаружено, что генерированные по такому протоколу зрелые ДК более эффективно, чем незрелые, увеличивают количество Т-регуляторных клеток, экспрессирующих транскрипционный фактор F0XP3 [12]. В исследовании R . Sporri и C . R . Sousa (2005) было показано, что для оптимальной активации ДК требуется стимуляция толл-подобных рецепторов, которую не обеспечивает упомянутый протокол созревания [13]. Другой «коктейль», содержащий 5 факторов — ФНО-а, ИЛ-1р, полиинозиновую-по-лицитидиловую кислоту (PoliI:C), интерферон-а (ИФН-а), интерферон-у (ИФН-у), выявил более высокую эффективность у больных меланомой по сравнению со стандартным цитокиновым «коктейлем» созревания ДК, включающим ФНО-а, ИЛ-1р, ИЛ-6, ПГЕ2 [14]. Тем не менее, наши недавние работы показали эффективность использования одного TNF-а как фактора дозревания ДК в 4-дневном протоколе в случае их получения из моноцитов периферической крови больных раком яичника и в 5-дневном протоколе в случае их получения из моноцитов больных раком молочной железы [15, 16].
На сегодняшний день существуют быстрые, двухдневные протоколы «Fast-DC», которые имеют перспективы для получения ДК, способных стимулировать Т-клеточный ответ in vitro также эффективно, как и ДК, полученные при стандартных протоколах, требующих обычно 5—7 дней культивирования [17]. В одной из работ подтверждено, что зрелые «быстрые» ДК (2-сут . ) и «стандартные» ДК (5—7 сут . ) демонстрируют сравнительно одинаковый уровень таких маркеров дифференцировки, как HLA-DR, CD83, CD86, CD208, и CCR7 [18]. Однако по сравнению со «стандартными» ДК, зрелые «быстрые»
ДК показали высокий уровень экспрессии CD14 и низкий CD209 . «Быстрые» ДК и «стандартные» ДК, трансфицированные мРНК клеток линии Jurkat E6, в равной степени индуцировали Т-клеточный специфический иммунный ответ in vitro . В опубликованном клиническом исследовании больные НЕ1Г2/пеи-позитивным раком молочных желез вакцинировались пептид-нагруженными ДК, полученными за 2 дня культивирования моноцитов, инкубированных с ИФН-у и липополисахаридом (ЛПС), индуцировали НЕ1Г2/пеи-специфический CD4+ и CD8+ Т-клеточные ответы и существенное сокращение объема опухоли [19]. В другой работе оценивали способность стимулировать Т-клетки с помощью 2-, 4- и 7-дневных ДК, нагруженных лизатом клеточной линии рака яичника (SKOV3), с последующим созреванием в присутствии ЛПС и ИФН-у в течение 16 ч . Значимым результатом данной работы было то, что 4- и 7-дневные ДК, полученные от больных раком яичников, обладали одинаковой способностью к захвату антигена, которая была выше, чем у 2-дневных ДК, а также способностью к стимуляции опухолеспе-цифического ответа Т-клеток, что может послужить определяющим фактором в перспективе выбора протокола генерации ДК при иммунотерапии [20]. Как альтернативным и дополнительным подходом получения функционально-зрелых ДК является ингибиро-вание негативных регуляторных путей, подавляющих созревание ДК . Этот подход был впервые применен L . Shen с соавт . (2004), которые обнаружили, что ингибирование с помощью малых интерферирующих РНК функции SOCS1 (suppressor of cytokine signaling 1), отрицательно регулирующего цитокиновую передачу ДК и Т-клеток, у ДК повышает их презентационную активность [21]. Другой привлекательной мишенью может быть GiLZ (glucocorticoid-induced leucine zipper), который является важным фактором, опосредующим супрессивные сигналы ИЛ-10, TGF-p и определяющим способность ДК стимулировать Т-лимфоциты [22]
Таким образом, в настоящее время существует множество протоколов получения ДК с различными модификациями смеси цитокинов и провоспали-тельных агентов и времени дифференцировки клеток-предшественников, которые могут отличаться по эффективности . Поскольку представления об иммунобиологии ДК по-прежнему развиваются, наблюдения in vitro и разработка новых протоколов генерации ДК на сегодняшний день остаются актуальными
Помимо функциональной зрелости ДК важной характеристикой также является их способность индуцировать антиген-специфический Т-клеточный ответ, что возможно путем доставки опухоль-ассоциирован-ных антигенов в ДК и дальнейшей презентации им-муногенных детерминант наивным Т-клеткам . Существуют различные способы доставки антигенов в ДК, отличающиеся по исполнению и эффективности
Виды антигенов и способы их доставки
в дендритные клетки: преимущества
и недостатки
Для эффективной стратегии противоопухолевой вакцинации при опухолевом росте необходимым является выбор антигена, а также вид и способ его доставки в ДК . Опухоль, как биологический объект, не ограничена паренхиматозным компонентом (собственно опухолевыми клетками и опухолевыми
стволовыми клетками), так как содержит также нормальные клетки, включающие стромальные, имму-нокомпетентные клетки, экстраклеточный матрикс, сосудистые компоненты, мезенхимальные стволовые клетки и коммитированные предшественники . Вместе взятые, они создают опухолевое микроокружение и в тесном взаимодействии между собой обеспечивают условия для опухолевого роста и прогрессии . Таким образом, опухоль, как неоднородная структура, гетерогенна и по своему набору антигенов . Строение антигена, используемого для праймирова-ния ДК, имеет большое значение при планировании стратегии иммунотерапевтической вакцинации, так как от него зависит способность антигена быть презентированным в составе комплекса молекул МНС i и ii класса и, таким образом, индуцировать CD8 + и CD4+ Т-клеточные ответы соответственно . Однако есть и другие факторы, которые необходимо принимать во внимание, такие как количество антигена, эффективность праймирования, время перси-стенции и представления антигена [23]. В качестве антигенного материала для представления ДК можно использовать как сам опухоль-ассоциированный белок или пептиды (антигенные детерминанты), так и мРНК опухолевых клеток или ДНК-конструкцию, кодирующую опухоль-ассоциированный антиген или его иммуногенные эпитопы . Антигенный материал, такой как пептиды, целые протеины, опухолевый лизат, апоптотический дебрис, комплекс антитела с антигеном, может добавляться в культуру и после этого захватываться незрелыми ДК путем эндоцито-за В случае использования в качестве антигенного материала мРНК или ДНК, кодирующих антиген или иммуногенные эпитопы, применяют различные варианты невирусной трансфекции в ДК, среди которых можно выделить электропорацию, нуклеофекцию, трансфекцию посредством магнитных частиц, липо-фекцию, а также вирусную трансфекцию .
В настоящее время для антигенного прайми-рования ДК многие исследователи используют синтетические пептиды или цельные опухоль-ас-социированные антигены (ОАА), такие как мелано-ма-ассоциированные антигены (MAGE1, MAGE3), муцин 1 (MUC 1), HER2/neu, тирозиназа, карциноэм-бриональный антиген (CEA) или меланомный антиген (Melan-A)/MART-1, распознаваемый Т-клетками
[24]. Большинство из применяемых ОАА презенти-руются в комплексе с МНС i класса, а важная роль МНС ii-рестриктированных Т-клеток инициировать и поддерживать эффективный иммунный ответ игнорируется [23]. Экзогенные короткие пептиды, соответствующие эпитопам, которые презентируются молекулами МНС i и ii классов, являются наиболее предпочтительной формой антигена для праймиро-вания ДК Такие пептиды синтезируются химическим методом и подходят для клинического использования, тогда как применение лизата опухолевых клеток, как источника антигена, может вызвать иммуносу-прессивную реакцию, что было продемонстрировано в проведенных исследованиях на мышиных моделях, в которых было доказано, что лизат опухоли Льюиса способен индуцировать развитие иммуносупрессив-ных макрофагов и толерогенных дендритных клеток
[25]. В то же время употребление в качестве антигенов полноразмерных нативных или рекомбинант-ных протеинов, как и в случае опухолевого лизата, позволяет вызывать иммунные ответы на различные эпитопы, которые могут быть рестриктированными
многими HLA-аллелями . Кроме того, механизмы антиген-процессирования и презентации регулируют ответы на важнейшие иммунодоминантные эпитопы, включая оба класса МНС .
Альтернативный подход включает в себя трансфекцию дендритных клеток ДНК, кодирующей специфический опухолевый антиген, или суммарной опухолевой РНК [26]. Первые работы по трансфекции РНК в дендритные клетки обнаружили сильный иммунный ответ против опухолевых клеток [27, 28]. Преимуществами такого метода являются специфичность, контроль, отсутствие риска встраивания в хозяйский геном [26] При трансфекции с РНК ДК могут экс-прессировать кодируемые антигены на своей поверхности и презентировать его Т-клеткам [29]. Кроме того, использование мРНК может быть многообещающей терапией для пациентов с малым количеством доступных опухолевых клеток, так как мРНК может быть синтезирована в достаточном объеме путем амплификации [30]. Недавние исследования показали, что мРНК может применяться не только как источник антигена, но и как способ для стимуляции ДК продуцировать иммуностимуляторные молекулы [31]. Основные ограничения использования мРНК — это сложность в манипуляциях, низкая эффективность трансфекции и короткая продолжительность жизни вследствие быстрой деградации РНК-азами [32]
В последние годы для увеличения противоопухолевой активности ДК применяются методы доставки ДНК, кодирующей помимо ОАА иммуностиму-ляторные молекулы, цитокины, хемокины и другие факторы, а также ОАА в ассоциации с костимуля-торными молекулами для усиления ответа В одном из исследований было установлено, что праймиро-вание лимфоцитов дендритными клетками, транс-дуцированными универсальным эпитопом PADRE (pan-DR epitope) в комбинации с антигеном HLA-A1 и с ^А-А2-рестриктированными эпитопами муцина 4 (MUC4) приводит к генерации выраженного цито-токсического ответа [33]. В другой работе было показано, что человеческие ДК, инфицированные вектором, экспрессирующим CEA, MUC1, TRiCOM (TRiCOM — три костимулирующих молекулы — CD80, iCAM-1 (intercellular adhesion molecule 1), LFA-3 (lymphocyte function-associated antigen 3)) генерируют как MUC1, так и СЕА-специфические Т-клетки, которые в свою очередь способны лизировать человеческие опухолевые клетки, эндогенно экспресси-рующие MUC1 и (или) СЕА [34].
По сравнению с обычным праймированием опухолевыми антигенами, трансфекция ДНК в ДК имеет ряд преимуществ: достижение кросс-презентации для индукции иммунного ответа, долгосрочная экспрессия антигена, относительное снижение аутоиммунного ответа, простота приготовления, стабильность в процессе трансфекции [26]. В частности, трансфекция клеток с помощью плазмидных и вирусных конструкций, несущих нуклеотидные последовательности, которые кодируют полные опухоль-ассоциированные антигены или их иммуногенные эпитопы, позволяет получать наиболее специфичную стимуляцию, делает процесс более стандартизованным . Использование ДНК-конструкции, кодирующей множественные эпитопы одного или нескольких ОАА, позволяет индуцировать широкий спектр цитотоксических T-лимфоцитов [33]. Так, в одной из работ было показано, что трансфекция ДК
универсальной и аллель-специфичной плазмидами, кодирующими иммуногенные эпитопы белка HER2, приводит к повышению цитотоксической активности мононуклеарных клеток против клеточной линии MCF-7 аденокарциномы человека . В то же время трансфекция ДК плазмидой, кодирующей полноразмерный белок HER2, не влияет на цитотоксический эффект [35]. В другой работе продемонстрировано, что дендритные клетки, трансфицированные полиэ-питопной ДНК-конструкцией, кодирующей эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов CEA, MUC4, молекулы адгезии эпителиальных клеток (EpCAM), стимулируют цитотоксическую активность мононуклеар-ных клеток больных колоректальным раком против аутологичных опухолевых клеток и способствуют накоплению перфорина популяцией лимфоцитов мононуклеарных клеток [36]. Кроме того, плазмида, несущая полиэпитопы ОАА, ввиду содержания в ней неметилированных CG последовательностей, представляет собой естественный адьювант, который стимулирует врожденный иммунитет Ограничения применения данного метода связаны с поиском оптимального метода доставки ДНК-конструкции в ДК Применение вирусных векторов может индуцировать аутоиммунный ответ и мутацию, тогда как невирусная трансфекция имеет низкую эффективность ДНК-стратегия также имеет проблему устойчивой экспрессии и риска встраивания в геном
Особенности создания полиэпитопных ДНК-конструкций базируются на основных этапах антигенной презентации в эукариотической клетке В ходе этого процесса внутриклеточные белки подвергаются протеосомальной фрагментации до коротких пептидов Некоторые из полученных пептидов имеют нужную длину для связывания с рецептором MHC I Транспорт таких пептидов в эндоплазматический ретикулум (ER) осуществляется АТФ-зависимым транспортером TAP (transporter associated with antigen processing), который является трансмембранным гетеродимером [37—39]. Таким образом, чтобы быть хорошим ЦТЛ-эпитопом, пептид должен быть правильно процессирован, перенесен в эндо-плазматический ретикулум, а также должен иметь существенную аффинность к молекуле MHC I . Используемые в настоящее время компьютерные алгоритмы выбора эпитопов базируются на вышеперечисленных принципах [40—42]. Кроме того, каждый эпитоп требует протеолиза в специфическом сайте выше его N-конца для эффективной транслокации, лишние аминокислоты могут удаляться аминопепти-дазами и, следовательно, в отсутствии рационального дизайна конструкции соседние эпитопы могут быть нарушены Добавление аланиновых спейсеров отчасти позволяет решить эту проблему [43]. В то же время другой проблемой может быть неравный «вес» разных эпитопов при стимуляции Т-клеток . Например, ранее было показано, что иммунизация плазмидной конструкцией, содержащей четыре (HLA)-A2-специфичных эпитопа из белков CEA, MAGE2 и MAGE3 с универсальным эпитопом PADRE, индуцирует моноспецифичный ответ только против иммунодоминантного эпитопа CEA, из чего можно сделать вывод, что наличие субдоминантных и доминантных эпитопов также должно учитываться [44].
Также при создании дизайна нуклеотидной последовательности ДНК-конструкции возможно реализовать различные подходы для усиления иммуногенно-сти или увеличения спектра Т-клеточных рецепторов
для распознавания опухоли, среди которых можно выделить следующие две стратегии . Первая направлена на увеличение аффинности связывания пептида с МНС, что ведет к более длительной экспозиции комплекса, увеличивая шанс развития ЦТЛ-ответа, вторая — на улучшение процессинга и продукции эпитопов (пептидов) . К настоящему времени наиболее исследовано влияние аминокислотных замен на увеличение аффинности связывания в кармане рецептора [45]. Боковой остаток аминокислоты в позиции, связывающей пептид, скрыт, что дает возможность выбрать наиболее благоприятную аминокислоту, не меняя при этом антигенной специфичности
Считается, что дальнейшие исследования нужно сфокусировать на развитии стратегий увеличения экспрессии эпитопов, улучшения формирования комплекса эпитопов с МНС, выборе оптимальной комбинации для полиэпитопной конструкции Лучшее понимание пути процессинга полиэпитопных белков (протеасома/ТАР/Е1Г) позволит проводить разработку более эффективной структуры синтетического гена для вакцинации [46].
На сегодняшний день полиэпитопные ДНК-вакцины признаются наиболее перспективными как для прямой вакцинации, так и для клеточной терапии, опосредованной ДК Таким образом, для создания эффективного противоопухолевого иммунного ответа многообещающим является использование аутологичных ДК, активированных опухолевыми антигенами или с помощью трансфекции полиэпитоп-ными ДНК-конструкциями, содержащими антигенные детерминанты ОАА для стимуляции Т-хелперов 1 типа и цитотоксических лимфоцитов .
Как было описано выше, для иммунотерапии онкологических заболеваний важным фактором является способность ДК индуцировать антиген-специфический иммунный ответ против клеток определенной опухоли Современные исследования говорят и о возможности влияния на эффективность противоопухолевого иммунного ответа путем его сдвига в сторону провоспалительного, то есть в сторону образования Т-клеток с фенотипом Т-хелперов 1 типа (Тх1), что также может играть существенную роль при подборе условий иммунотерапии онкозаболеваний .
Способы стимуляции противоопухолевого
иммунного ответа путем увеличения популяции
цитотоксических и уменьшения популяции
регуляторных Т-лимфоцитов
Эффективный противоопухолевый иммунный ответ зависит не только от функционального состояния ДК, но также от процесса презентации опухолевых антигенов наивным Т-клеткам, который, как было уже отмечено, зачастую нарушен у онкологических больных Таким образом, целесообразно проводить этот этап также т vitгo, повышая эффективность обучения Т-клеток, для чего на сегодняшний день существует несколько способов Одним из таких способов т vitгo может быть использование различных цитокинов . Известно, что активированные ДК и эффекторные клетки секретируют провоспалитель-ные цитокины, такие как интерлейкин-18 (ИЛ-18), интерлейкин-12 (ИЛ-12), ФНО-а и ИФН-у, которые индуцируют врожденный и адаптивный иммунный ответ Действительно, присутствие цитокинов в месте роста опухоли может вызвать как иммунную
активацию, так и толерантность [47]. ИЛ-18, как один из провоспалительных, иммуностимулирующих цитокинов, влияет на многие клетки иммунной системы, включая Т-клетки, В-клетки, НК-клетки (натуральные киллеры). ИЛ-18 увеличивает продукцию ИФН-у Т- и НК-клетками, а также усиливает цитолитическую активность НК-клеток и цитотокси-ческих Т-лимфоцитов [48]. Известный синергетиче-ский эффект ИЛ-18 с ИЛ-12 на индукцию продукции ИФН-у и стимуляцию иммунного ответа делает эти два цитокина перспективными для использования в клеточных технологиях Как показали наши работы, совместное применение дендритных клеток и ИЛ-12 с ИЛ-18 усиливает противоопухолевую цитотоксиче-скую и секреторную активность эффекторных клеток in vitro у больных колоректальным раком, раком яичника и раком молочной железы [15, 16, 49].
Другим подходом для увеличения противоопухолевого иммунного ответа может являться способ уменьшения количества регуляторных Т-клеток, способных привести к иммунной толерантности к опухолевым клеткам, в смешанной культуре ДК и Т-лимфоцитов Некоторые исследователи используют для этого ингибиторы иммуносупрессорных молекул, например 1-метил^-триптофан (L-1-MT) — ингибитор индоламин-2,3-диоксигеназы (iD01). iD01 экспрессируется на клетках многих солидных опухолей и является ключевым ферментом метаболизма триптофана, который катализирует начальную стадию деградации этой аминокислоты до кинуре-нина Истощение триптофана за счет iD01 ингиби-рует активацию Т-клеток, в то время как продукты катаболизма триптофана негативно регулируют пролиферацию Т-клеток и выживаемость [50]. Недавно было показано, что клетки, экспрессирующие iD01, в том числе ДК, имеют толерогенное влияние на Т-клеточный иммунный ответ за счет расширения или индукции популяции регуляторных Т-клеток [51]. A . Curti с соавт . (2010) обнаружили, что позитивные по iD01 ДК, полученные из бластных клеток пациентов с острым миелолейкозом, ингибируют Т-клеточную пролиферацию и повышают количество аллогенных и аутологичных регуляторных Т-клеток, причем данный эффект полностью аннулируется при добавлении L-1-MT [52]. Таким образом, для усиления образования клеточного противоопухолевого иммунного ответа эффективно использовать цитокины ИЛ-12 и ИЛ-18, а также ингибиторы иммуносупрес-сорных молекул
Оценка эффективности создания
противоопухолевого иммунного ответа
При создании терапевтических технологий для лечения онкологических заболеваний основной задачей является получение эффективного цитотокси-ческого и Тх1-иммунного ответа . В условиях in vitro основным показателем формирования успешного ответа является клеточно-опосредованная цитоток-сичность, когда происходит непосредственное уничтожение опухолевых клеток-мишеней эффекторными клетками, активированными под влиянием ДК .
Для оценки цитотоксичности можно применять методы определения специфических молекул цито-токсичности, основанные на том, что цитотоксиче-ские CD8+ Т-клетки и натуральные киллеры используют в основном два контактных цитотоксических механизма . Первый — экзоцитоз литических гранул
цитотоксическими эффекторными клетками, продуцирующими порообразующий токсин (перфорин) и проапоптозные сериновые протеазы (гранзимы), которые синергически убивают клетки-мишени путем активации различных литических механизмов [53]. Второй путь включает продукцию эффекторными клетками молекул семейства ФНО, таких как ФНО-а, FasL (Fas ligand) и TRAiL (tumor necrosis factor ligand), индуцирующих мультимеризацию соответствующих рецепторов на клетках-мишенях, что приводит к апоптозу [54]. Большую популярность в области фундаментальных исследований получили методы, которые позволяют одновременно оценить количество и функциональную активность цитоток-сических Т-лимфоцитов — ELiSpot для определения ИФН-у- и гранзим B-продуцирующих клеток [55]. Другим методом определения цитотоксичности является выявление метаболических факторов, которые выделяются при лизировании клеток-мишеней или способны продуцироваться только живыми клетками . Самым популярным тестом для оценки клеточно-опосредованной цитотоксичности считается анализ, основанный на высвобождении 51Cr, имеющий несколько недостатков: полуколичественный анализ, низкий уровень чувствительности, некоторые опухолевые клетки-мишени плохо метятся и характеризуются высоким уровнем спонтанного высвобождения изотопа . Альтернативой применения радиоактивных веществ является определение фермента лактатдегидрогеназы, выделяющейся при лизисе клеток-мишеней [15, 16, 49].
Современные методы исследования обеспечивают возможность детального анализа фенотипа и функционального состояния антиген-реактивных Т-клеток, полученных при праймировании наивных Т-клеток трансфицированными или антиген-на-груженными ДК Они заключаются в выделении специфических Т-клеток с помощью тетрамеров/ мультимеров/стрептамеров . Такой подход позволяет получить информацию о многих аспектах природы Т-клеточного ответа, таких как цитокиновый профиль, где возможно показать накопление Тх1/Тх2 цитокинов (ИФН-у, ИЛ-2, ФНО-а, ИЛ-5, ИЛ-13), формирование пула эфффекторных клеток памяти с использованием маркеров CD27, CD28, CD45RA, CCR7, цитотоксическая активность с использованием перфорина и поверхностного маркера CD107, пролиферативная активность, миграционный фенотип, функциональная аффинность или авидность Е-клеточного рецептора, наличие регуляторных Т-клеток [56]
Заключение
В настоящее время наблюдается интенсивное развитие подходов к коррекции противоопухолевого иммунитета с помощью описанных в данном обзоре клеточных технологий вакцинации на основе ДК Главная цель этих технологий заключается в переносе определяющих моментов процесса вакцинации, который ранее происходил в организме больного, в культуру клеток вплоть до стадии обучения и получения антигенспецифических Т-клеток . Возможно, в перспективе этот перенос затронет не только образование антиген-специфических эффекторных Т-клеток, но и получение in vitro Т-клеток памяти .
Несомненно, каждый упомянутый в обзоре этап технологии индукции клеточного противоопухолевого
иммунного ответа in vitro важен и требует дальнейшей модернизации применительно к различным онкологическим заболеваниям На наш взгляд, в первую очередь, усилия должны быть сосредоточены на совершенствовании полиэпитопных ДНК-конструкций, как наиболее перспективного способа доставки антигенов в ДК для стимуляции противоопухолевого иммунного ответа . Также не менее значимым этапом является стимуляция противоопухолевого иммунного ответа in vitro, заключающаяся в подборе и использовании различных эффективных молекул-стимуляторов и ингибиторов иммуносупрессорных молекул с целью его сдвига в сторону Тх1 пути . Получение, размножение клонов антигенспецифических цитоток-сических Т-лимфоцитов и получение Т-клеток памяти для использования их в клеточных иммунотерапевти-ческих стратегиях лечения онкозаболеваний находится только на стадии разработки технологии . Основным критерием выбора наиболее действенного клеточного протокола для клеточной иммунотерапии безусловно должна быть клиническая эффективность применения
ЛИТЕРАТУРА:
I. Москалева Е . Ю . , Северин С . Е . Перспективы создания противоопухолевых вакцин с использованием дендритных клеток человека . Иммунология 2002; 1: 8-15 .
2 . Evans C . , Dalgleish A. G ., Kumar D . Review article: immune suppression and colorectal cancer . Aliment . Pharmacol . Ther . 2006; 24(8): 1163-77 .
3 . Данилова А. Б . , Данилов А. О . , Фахрутдинова О .Л . и соавт. Лабораторная оценка содержания TGF1, интерлейкина-10, VGEF in vitro и in vivo у больных солидными опухолями . Вопросы онкологии 2011; 57(6): 759-66 .
4 . Nakayama Н ., Kitayama J . , Muto T . et al . Characterization of intracellular cytokine profile of CD4( + ) T cells in peripheral blood and tumor-draining lymph nodes of patients with gastrointestinal cancer . Jpn . J . Clin . Oncol . 2000; 30(7): 301-5 .
5 . Fujii S . , Liu K ., Smith C . et al . The linkage of innate to adaptive immunity via maturing dendritic cells in vivo requires CD40 ligation in addition to antigen presentation and CD80/86 costimulation . J . Exp . Med . 2004; 199(12): 1607-18 .
6 . Heath W . R ., Belz G . T., Behrens G . M . N . et al . Cross-presentation, dendritic cell subsets, and the generation of immunity to cellular antigens . Immunol . Rev . 2004; 199: 9-26 .
7 . Nersting J ., Svenson M ., Andersen V. et al . Maturation of human dendritic cells by monocyte-conditioned medium is dependent upon trace amounts of lipopolysaccharide inducing tumour necrosis factor alpha . Immunol . Lett . 2003; 89(1): 59-65 .
8 . Avigan D ., Vasir B ., Gong J . et al . Fusion cell vaccination of patients with metastatic breast and renal cancer induces immunological and clinical responses . Clin . Cancer Res . 2004; 10(14): 4699-708 .
9 . Almand B ., Clark J . I . , Nikitina E . et al . Increased production of immature myeloid cells in cancer patients: a mechanism of immunosuppression in cancer . J . Immunol . 2001; 166(1): 678-89 .
10 . Almand B ., Resser J . R ., Lindman B . et al . Clinical significance of defective dendritic cell differentiation in cancer . Clin . Cancer Res . 2000; 6(5): 1755-66 .
II. Schadendorf D ., Ugurel S ., Schuler-Thurner B . et al . Dacarbazine (DTIC) versus vaccination with autologous peptide-pulsed dendritic cells (DC) in first-line treatment of patients with metastatic melanoma: a randomized phase III trial of the DC study group of the DeCOG . Ann . Oncol . 2006; 17(4): 563-70 .
12 . Banerjee D . K . , Dhodapkar M .V ., Matayeva E . et al . Expansion of FOXP3 high regulatory, T cells by human dendritic cells (DCs) in vitro and after injection of cytokine-matured DCs in myeloma patients . Blood 2006; 108(8): 2655-61.
13 . Sporri R ., Reis e Sousa C . Inflammatory mediators are insufficient for full dendritic cell activation and promote expansion of CD4+ T cell populations lacking helper function . Nat . Immunol . 2005; 6(2): 163-70 .
14 . Mailliard R . B ., Wankowicz-Kalinska A., Cai Q. et al . Alpha-type-1 polarized dendritic cells: a novel immunization tool with optimized CTL-inducing activity . Cancer Res . 2004; 64(17): 5934-7 .
15 . Шевченко Ю .А., Хантакова Ю . Н . , Курилин В . В . и соавт. Стимуляция цитотоксического иммунного ответа в культуре монону-клеарных клеток у больных раком молочной железы дендритными клетками, нагруженными антигенами опухолевых лизатов Иммунология 2013; 34(6): 327-30 .
16 . Obleukhova I .A ., Kurilin V . V ., Goncharov M .A . et al . Effect of mature dendritic cells primed with autologous tumor antigens from
данного протокола . На сегодняшний день проведено и проводится очень большое количество клинических испытаний по технологиям индукции противоопухолевого иммунного ответа с помощью дендритных клеток [57, 58]. В основном это технологии использования дендритных клеток, нагруженных опухолевыми антигенами в виде лизата или РНК опухолевых клеток, опухоль-ассоциированных антигенов и пептидов, в то же время появились первые данные о клинических испытаниях, где присутствует в клеточном протоколе этап «обучения» наивных Т-клеток отвечать на специфический опухолевый антиген [59, 60]. Это очень обширный материал, который заслуживает отдельного анализа и обсуждения
Благодарности
Работа поддержана ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», Соглашение № 14.607.21.0043. Уникальный идентификатор RFMEFI60714X0043.
patients with epithelial ovarian cancer on stimulation of the cytotoxic immune response in culture of mononuclear cells . Bull . Exp . Biol . Med . 2013; 156(1): 161-4 .
17 . Dauer M ., Obermaier B ., Herten J . et al . Mature dendritic cells derived from human monocytes within48 hours: a novel strategy for dendritic cell differentiation from blood precursors . J . Immunol . 2003; 170(8): 4069-76 .
18 . Jarnjak-Jankovic S ., Hammerstad H ., S^b0e-Larssen S . et al . A full scale comparative study of methods for generation of functional dendritic cells for use as cancer vaccines . BMC Cancer 2007; 7: 119 .
19 . Czerniecki B . J ., Koski G . K ., Koldovsky U . et al . Targeting HER-2/neu in early breast cancer development using dendritic cells with staged interleukin-12 burst secretion . Cancer Res . 2007; 67(4): 1842-52 .
20 . Chiang C . L ., Hagemann A . R . , Leskowitz R . et al . Day-4 myeloid dendritic cells pulsed with whole tumor lysate are highly immunogenic and elicit potent anti-tumor responses . PLoS One 2011; 6(12): e28732
21. Shen L ., Evel-Kabler K ., Strube R . et al . Silencing of SOCS1 enhances antigen presentation by dendritic cells and antigen-specific antitumor immunity . Nat . Biotechnol . 2004; 22(12): 1546-53 .
22 . Cohen N ., Mouly E ., Hamdi H . et al . GILZ expression in human dendritic cells redirects their maturation and prevents antigen-specific T lymphocyte response . Blood 2006; 107(5): 2037-44 .
23 . Gilboa E . DC-based cancer vaccines . J . Clin . Invest . 2007; 117(5): 1195-203 .
24 . Akiyama Y., Maruyama K ., Nara N . et al . Cytotoxic T cell induction against human malignant melanoma cells using HLA-A24-restricted melanoma peptide cocktail . Anticancer Res . 2004; 24(2B): 571-7 .
25 . Dong B ., Dai G ., Xu L . et al . Tumor cell lysate induces the immunosuppression and apoptosis of mouse immunocytes . Mol . Med . Rep . 2014; 10(6): 2827-34 .
26 . Chen Y .Z. , Yao X. L., Tabata Y. et al . Gene carriers and transfection systems used in the recombination of dendritic cells for effective cancer immunotherapy. Clin . Dev. Immunol . 2010; 2010: 565643
27 . Ashley D . M . , Faiola B ., Nair S . et al . Bone marrow-generated dendritic cells pulsed with tumor extracts or tumor RNA induce antitumor immunity against central nervous system tumors . J . Exp . Med . 1997; 186(7): 1177-82 .
28 . Nair S . K ., Morse M ., Boczkowski D . et al . Induction of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes in cancer patients by autologous tumor RNA-transfected dendritic cells . Ann . Surg . 2002; 235(4): 540-9 .
29 . Weissman D ., Ni H ., Scales D . et al . HIV gag mRNA transfection of dendritic cells (DC) delivers encoded antigen to MHC class I and II molecules, causes DC maturation, and induces a potent human in vitro primary immune response . J . Immunol . 2000; 165(8): 4710-7 .
30 . Nicolette C .A ., Healey D ., Tcherepanova I . et al . Dendritic cells for active immunotherapy: optimizing design and manufacture in order to develop commercially and clinically viable products . Vaccine 2007; 25 Suppl 2: B47-60.
31. Boczkowski D ., Nair S . RNA as performance-enhancers for dendritic cells . Expert . Opin . Biol . Ther . 2010; 10(4): 563-74 .
32 . Morse M . A. , Lyerly H . K . DNA and RNA modified dendritic cell vaccines . World J . Surg . 2002; 26(7): 819-25 .
33 . Wei J . , Gao W ., Wu J . et al . Dendritic cells expressing a combined PADRE/MUC4-derived polyepitope DNA vaccine induce
multiple cytotoxic T-cell responses . Cancer Biother. Radiopharm . 2008; 23(1): 121-8 .
34 . Tsang K . Y ., Palena C . , Yokokawa J . et al . Analyses of recombinant vaccinia and fowlpox vaccine vectors expressing transgenes for two human tumor antigens and three human costimulatory molecules . Clin . Cancer Res . 2005; 11(4): 1597-607 .
35 . Максютов А. З . , Лопатникова Ю .А., Курилин В . В . и соавт. Исследование эффективности индукции цитотоксического иммунного ответа мононуклеарными клетками с помощью дендритных клеток, трансфицированных полиэпитопными конструкциями HER2/ ErbB2 . Медицинская иммунология 2014; 16(5): 417-24 .
36 . Kulikova E .V. , Kurilin V .V., Shevchenko J .A. et al . Dendritic Cells Transfected with a DNA Construct Encoding Tumour-associated Antigen Epitopes Induce a Cytotoxic Immune Response Against Autologous Tumour Cells in a Culture of Mononuclear Cells from Colorectal Cancer Patients . Scand . J . immunol . 2015; 82(2): 110-7 .
37 . Lindquist J .A. , Jensen О . N ., Mann M . et al . ER-60, a chaperone with thiol-dependent reductase activity involved in MHC class i assembly . EMBO J . 1998; 17(8): 2186-95 .
38 . Lyko F., Martoglio B ., Jungnickel B . et al . Signal sequence processing in rough microsomes . J . Biol . Chem . 1995; 270(34): 19873-8
39 . Martoglio B ., Dobberstein B . Signal sequences: more than just greasy peptides . Trends Cell Biol . 1998: 8(10): 410-5 .
40 . Ginodi i ., Vider-Shalit T. , Tsaban L. et al . Precise score for the prediction of peptides cleaved by the proteasome . Bioinformatics 2008; 24(4): 477-83 .
41. Louzoun Y ., Vider T ., Weigert M . T-cell epitope repertoire as predicted from human and viral genomes . Mol . immunol . 2006; 43(6): 559-69
42 . Vider-Shalit T ., Fishbain V ., Raffaeli S . et al . Phase-dependent immune evasion of herpesviruses . J . Virol . 2007; 81(17): 9536-45 .
43 . Bergmann C . C ., Yao Q ., Ho C . K . et al . Lanking residues alter antigenicity and immunogenicity of multi-unit CTL epitopes . J . immunol . 1996; 157(8): 3242-9 .
44 . Durantez M ., Lopez-Vazquez A. B ., De Cerio A. L. induction of multiepitopic and long-lasting immune responses against tumour antigens by immunization with peptides, DNA and recombinant adenoviruses expressing minigenes . Scand . J . immunol . 2009; 69(2): 80-9
45 . Parmiani G ., Castelli C ., Dalerba P . et al . Cancer immunotherapy with peptide-based vaccines: what have we achieved? Where are we going? J . Natl . Cancer inst . 2002; 94(11): 805-18 .
46 . Tourdot S ., Scardino A ., Saloustrou E . et al . A general strategy to enhance immunogenicity of low-affinity HLA-A2 . 1-associated peptides: implication in the identification of cryptic tumor epitopes . Eur . J . immunol . 2000; 30(12): 3411-21.
47 . Smyth M .J ., Cretney E ., Kershaw M . H . et al . Cytokines in cancer immunity and immunotherapy. Immunol . Rev. 2004; 202: 275-93 .
48 . Якушенко Е . В ., Лопатникова Ю .А ., Сенников С . В . Интерлей-кин-18 и его роль в иммунном ответе . Медицинская иммунология 2005; 7(4): 355-64 .
49 . Курилин В . В ., Хантакова Ю . Н ., Облеухова И . А. и др . Стимуляция дендритными клетками in vitro противоопухолевой цито-токсической активности мононуклеарных клеток больных колорек-тальным раком . Медицинская иммунология 2013; 15(3): 235-46 .
50 . Mellor A. L ., Munn D . H . Tryptophan catabolism and T-cell tolerance: immunosuppression by starvation? Immunol . Today . 1999; 20(10): 469-73 .
51. Chen W ., Liang X ., Peterson A . J . et al . The indoleamine 2,3-dioxygenase pathway is essential for human plasmacytoid dendritic cell-induced adaptive T regulatory cell generation J Immunol 2008; 181(8): 5396-404 .
52 . Curti A., Trabanelli S ., Onofri C . et al . Indoleamine 2,3-dioxygenase-expressing leukemic dendritic cells impair a leukemia-specific immune response by inducing potent T regulatory cells Haematologica 2010; 95(12): 2022-30 .
53 . Voskoboinik I . , Dunstone M .A., Baran K . et al . Perforin: structure, function, and role in human immunopathology Immunol Rev . 2010; 235(1): 35-54 .
54 . Wajant H . CD95L/FasL and TRAIL in tumour surveillance and cancer therapy . Cancer Treat . Res . 2006; 130: 141-65 .
55 . Malyguine A. M ., Strobl S . L., Shurin M . R . Immunological monitoring of the tumor immunoenvironment for clinical trials Cancer Immunol . Immunother . 2012; 61(2): 239-47 .
56 . Keilholz U . , Martus P ., Scheibenbogen C . Immune monitoring of T-cell responses in cancer vaccine development Clin Cancer Res 2006; 12 Suppl 7: 2346s-52s .
57 . Galluzzi L ., Senovilla L ., Vacchelli E . et al . Trial Watch: Dendritic cell-based interventions for cancer therapy . Oncoimmunology 2012; 1(7): 1111-34 .
58 . Vacchelli E ., Vitale I ., Eggermont A . et al . Trial Watch: Dendritic cell-based interventions for cancer therapy . Oncoimmunology 2013; 2(10): e25771.
59 . Di L ., Zhu Y . , Jia J . et al . Clinical safety of induced CTL infusion through recombinant adeno-associated virus-transfected dendritic cell vaccination in Chinese cancer patients . Clin . Transl . Oncol . 2012; 14(9): 675-81.
60 Zhan H L , Gao X , Pu X Y et al A randomized controlled trial of postoperative tumor lysate-pulsed dendritic cells and cytokine-induced killer cells immunotherapy in patients with localized and locally advanced renal cell carcinoma . Chin . Med . J . (Engl . ) 2012; 125(21): 3771-7 .
Поступила: 18.03.2015
