CC BY
99
УДК 616.89-008.441.13+612-092.18
Е. С. ЕФРЕМЕНКО В. Е. ВЫСОКОГОРСКИЙ
Омская государственная медицинская академия
СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ПРИ РАЗВИТИИ АЛКОГОЛЬНОЙ АБСТИНЕНЦИИ
Проведен хемилюминесцентный анализ и определены показатели антиоксидантной защиты в гомогенатах печени крыс при синдроме отмены этанола. Показано, что в условиях моделирования алкогольной зависимости происходит активация процессов свободнорадикального окисления и нарушения обмена глутатиона. Оценено влияние предшественника восстановленного глутатиона на показатели свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты при экспериментальном синдроме отмены этанола.
Активация свободнорадикальных процессов выявлена при острой [1] и хронической алкогольной интоксикации [2]. Длительная алкоголизация приводит не только к развитию интоксикации, но и формированию алкогольной зависимости, узловым этапом развития которой является абстинентный синдром [3]. В этих условиях неудовлетворительная инактивация соединений свободнорадикальной природы, осуществляемая антиокислительной системой, также определяет возможность развития окислительного стресса [4]. Так, F. Peng et al. [5] выявили угнетение активности супероксиддисмутазы и глутатионперок-сидазы при алкогольной абстиненции. A. Bagrel et al. [6] отмечали увеличение продукции гидроксильного радикала через 29 суток лечения больных с алкогольным абстинентным синдромом. Однако в некоторых исследованиях изменений интенсивности свободнорадикальных процессов не наблюдалось [7] либо показатели окислительного стресса быстро возвращались к нормальному уровню [8]. Несмотря на наличие данных о влиянии отмены алкоголя на интенсивность процессов свободнорадикального окисления, имеется определенный информационный недостаток в отношении характеристики динамики показателей антиоксидантной защиты, раскрытия механизмов активации свободнорадикального окисления, а также сведений о состоянии свободнорадикальных процессов при абстиненции, полученных в клинико-экспериментальных исследованиях. В связи с этим можно предположить, что исследование показателей, отражающих оксида-тивный статус организма, в различные сроки течения абстинентного синдрома будет способствовать уточнению роли свободнорадикальных процессов в развитии данного патологического состояния.
Цель исследования — выяснить активность свободнорадикальных процессов при моделировании алкогольной зависимости для обоснования необходимости коррекции нарушений метаболизма при экспериментальном синдроме отмены этанола.
Задачи исследования:
1. Определить показатели свободнорадикального окисления методом хемилюминесцентного анализа в печени экспериментальных животных в различные сроки отмены этанола.
2. Исследовать уровень восстановленного глутатиона и активность ферментов его обмена в печени при моделировании алкогольной зависимости.
3. Оценить влияние препарата Глутоксим на показатели хемилюминесценции и антиокислительной защиты при формировании реакции отмены этанола в эксперименте.
Материал и методы исследования
В эксперименте использовали 120 беспородных крыс-самцов массой 180 — 220 граммов. Содержание животных проводилось в условиях, соответствующих методическим рекомендациям [9]. Для определения состояния процессов свободнорадикального окисления в период реакции отмены этанола применяли модель экспериментального алкоголизма, разработанную А.Х. Абдрашитовым и соавт. Согласно этой модели животным интрагастрально вводили 25%-й раствор этанола в дозе 8 г/кг в сутки в течение 4 дней и 4 г/кг/сут на пятые сутки. Выраженность реакции отмены этанола оценивали по латентному времени болевой реакции животных методом «горячей пластинки», который основан на корреляции между степенью анальгезии и выраженностью реакции отмены этанола у животных [10]. Проводили определение латентного времени болевой реакции и вычисляли индекс анальгезии. В группе интактных животных латентное время было измерено в аналогичные сроки, что и у подопытных животных. Определение латентного времени и вычисление индекса анальгезии производили через 1 сутки (группа А1), 2 (группа А2), 3 (группа А3) и 5 (группа А5) суток после заключительного введения алкоголя. После измерения латентного периода животные подвергались декапитации под эфирным наркозом.
Для оценки влияния препарата Глутоксим на показатели антиоксидантной защиты в период реакции отмены этанола были дополнительно сформированы три группы животных, которым внутримышечно вводили Глутоксим в дозе 1 мг/кг/сут в период развития реакции отмены. Измерение латентного времени и последующая декапитация животных проводились через 1 сутки (группа А + Г 1), 2 (группа А + Г 2) и 3 (группа А + Г 3) суток после последнего введения алкоголя.
В работе были использованы хемилюминесцент-ный анализ, биохимические и статистические методы исследования. Для оценки состояния процессов свободнорадикального окисления проводили определение параметров хемилюминесценции с использованием хемилюминометра ХЛМ1Ц-01. В измерительную
«ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК» № 1 (65) МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ «ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК» № 1(65)
ю_
БВ
ЛП МВ
показатели
сс
□1 к
□ <
□ А2
□ A3
□ 2
Рис. 1. Показатели железоиндуцированной хемилюминесценции гомогенатов печени крыс
при синдроме отмены этанола.
Примечание. * — ри < 0,05 по сравнению с контролем.
90
*
¥
80
70
60
30
20
*
*
0
кювету вводили 1,0 мл 10%-го гомогената, 8,0 мл 20 мМ К-фосфатного буфера (рН = 7,45) и помещали в термостатируемую (37 0С) и светоизолированную камеру. После пятиминутной инкубации при постоянном перемешивании индуцировали хемилюминесценцию введением в кювету раствора сульфата железа, конечная концентрация которого в пробе составляла 5х104 М. Фиксировали спонтанную хемилюминесценцию в режиме счета фотонов. После добавления ионов двухвалентного железа регистрировали быструю (БВ) и медленную (МВ) вспышки свечения, а также оценивали продолжительность латентного периода (ЛП) от момента введения сульфата железа до начала развития медленной вспышки [11] и светосумму (СС). Величины показателей выражали в условных единицах.
Содержание восстановленного глутатиона в гомогенатах печени определяли по реакции с 5, 5х- дитиобис -2 — нитробензойной кислотой методом J. Sedlak et al. (1968). Определение активности глутатионредуктазы (ГР; КФ 1.6.4.2) проводили по методу I. Carlberg (1985). Активность глутатионпероксидазы (ГПО; КФ 1.11.1.9) определяли по методу D.E. Paglia et al (1967) в модификации Д.В. Черданцева (2002). Глутатион^-трансферазную активность (r-S-ТФ) в гомогенатах печени измеряли по скорости образования глутатион^-конъюгатов между восстановленным глутатионом и 1-хлор-2,4-динитробен-золом (W.H. Habig, 1974). Активность у-глутамилтранс-феразы (ГГТ; КФ 2.3.2.1) определяли по методу A Meister et al. (1981). Для определения активности каталазы (КАТ) использовали метод М.А. Королюк (1988). Определение активности супероксиддисмутазы (СОД; КФ 1.15.1.1) проводили по методу Т.В. Сирота (1999). Содержание белка в пробах определяли по методу O. Lowry et al. (1951). В работе использованы реактивы фирм «Реахим», Reanal, «Витал Диагностикс СПб» и другие реактивы с квалификацией х. ч. и ч. д. а.
Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью компьютерных программ Biostat и Microsoft Excel. В качестве основных характе-
ристик описательной статистики применяли среднюю арифметическую (М) и стандартное отклонение (о), при нормальном типе распределения переменных (тождественность дисперсий в сравниваемых группах, разница между М и медианой (Ме) менее 10%). При распределении, отличающемся от нормального (различие дисперсий в сравниваемых группах, М и Ме отличались более чем на 10%), использовали медиану, нижний 25-й (Ь) и верхний 75-й (Н) квантили. Оценку статистической значимости различий проводили с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни (и) — для двух независимых выборок и Вилкоксона (Ш) — для связанных выборок. Зависимость между отдельными показателями выявлялась с помощью корреляционного анализа: определяли непараметрический коэффициент ранговой корреляции Спирмена (г) [12].
Результаты и их обсуждение
Выявленные нами изменения параметров железоиндуцированной хемилюминесценции особенно ярко выражены в ранние сроки развития реакции отмены этанола (рис. 1). В частности, происходящее в первые сутки синдрома отмены этанола ограничение длительности латентного периода свидетельствует о преобладании прооксидантных факторов над количеством антиоксидантов в ткани печени. Уменьшение латентного периода может указывать на возникающий дефицит антиоксидантной системы, и, как результат этого, на вторые сутки после заключительного введения этанола зафиксировано увеличение амплитуды медленной вспышки на 33% (ри < 0,05) по сравнению с данными группы контроля, указывающее на повышение способности липидов к переокислению. Данное изменение находит отражение в росте светосуммы в 1,3 раза (ри < 0,05) по отношению к контролю, что свидетельствует об увеличении количества образовавшихся пере-кисных радикалов на один ион двухвалентного железа. На пятые сутки после завершения алкоголизации регис-
трируется повышение светосуммы на 25% (ри < 0,05) относительно контрольной группы. Отсутствие изменений параметров хемилюминесценции на третьи сутки реакции отмены этанола, по всей видимости, обусловлено тем фактом, что активность цитохрома Р-450 2Е1, функционирование которого связано с формированием окислительного стресса[13], существенно уменьшается через трое суток после прекращения алкоголизации [14]. Увеличение светосуммы хемилюминесценции на пятые сутки реакции отмены этанола говорит об увеличенном образовании перекисных радикалов, что может быть обусловлено недостатком антиоксидантов.
В связи с тем что наблюдаемое в первые сутки синдрома отмены этанола уменьшение длительности латентного периода железоиндуцированной хемилюминесценции происходит одновременно со снижением количества восстановленного глутатиона и отмечается достоверная корреляция между данными показателями (г = 0,59; р = 0,02), которая отсутствует в контрольной группе (г = 0,16; р = 0,56), можно предположить определенную роль восстановленного глутатиона в определении соотношения антиоксиданты/прооксиданты при данных условиях.
Таким образом, результаты исследования показывают, что в ранние сроки развития реакции отмены этанола происходят существенные негативные сдвиги в показателях хемилюминесценции. Компенсаторные изменения, выражающиеся в положительной тенденции изменения продолжительности латентного периода и отсутствии различий в показателях хеми-люминесценции, на третьи сутки развития реакции отмены оказываются недостаточными.
Учитывая, что основным местом синтеза восстановленного глутатиона является печень [15], было проведено определение показателей обмена глутати-она в гомогенатах печени крыс при синдроме отмены этанола.
В результате проведенных исследований обнаружено снижение в печени в 2,3 раза (ри < 0,05) уровня восстановленного глутатиона на первые сутки синдрома отмены этанола по сравнению с контролем.
Одним из важных параметров, лимитирующих протекание химических реакций, является наличие ко-ферментов. Недостаток восстановленного глутатиона ограничивает активность глутатион-Я-трансферазы в первые сутки реакции отмены этанола. Однако уже на вторые сутки реакции отмены уровень активности глу-татион-Я-трансферазы и содержание восстановленного глутатиона возвращаются к значениям группы контроля. Статистически значимая положительная связь между исследуемыми параметрами (г = 0,61; р = 0,02) позволяет предположить, что возвращение концентрации восстановленного глутатиона приводит к увеличению глутатион-Я-трансферазной активности. Одновременно с данными событиями происходит повышение активности глутатионпероксидазы, которая положительно коррелирует с активностью супероксиддисмутазы (г = 0,70; р = 0,005). Появление положительной связи между указанными показателями, по сравнению с контрольной группой (г = —0,26; р = 0,3), подтверждает, что, кроме стабилизирующего действия суперок-сиддисмутазы на клеточные мембраны, посредством предотвращения процессов перекисного окисления, снижая уровень супероксида, супероксиддисмутаза защищает от его дезактивирующего действия глута-тионпероксидазу [16]. Взаимодополняемость функций глутатионпероксидазы и глутатион-Я-трансферазы находит отражение в сохранении положительной связи между уровнями их активности (г = 0,60; р = 0,02) в условиях алкоголизации (в группе контроля г = 0,59;
р = 0,02). Следует также отметить происходящее смещение функциональной активности восстановленного глутатиона в сторону коферментной работы по сравнению с первыми сутками реакции отмены этанола, когда, вероятно, вся «свободнорадикальная нагрузка» ложилась на данный серосодержащий трипептид. Повышенная активность супероксиддисмутазы снижается до нормы на третьи сутки реакции отмены этанола. Настоящий факт кажется во многом предопределяющим, так как сопровождается возникновением дефицита восстановленного глутатиона и ограничением глута-тион-Я-трансферазной активности, что в значительной степени повторяет изменения, наблюдаемые в первые сутки реакции отмены этанола. Однако отличия, выражающиеся в повышенной активности глутатион-пероксидазы, вероятно, предупреждают уменьшение длительности латентного периода железоиндуцированной хемилюминесценции, которая находится в пределах нормы. Меньшую степень истощения запасов восстановленного глутатиона в этот срок можно связать с вероятным уменьшением активности цитохрома Р-450 2Е1 [14]. На пятые сутки развития реакции отмены этанола отмечается только увеличение на 14% (ри <
0,05) активности глутатионпероксидазы.
Таким образом, результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о нарушениях в системе обмена глутатиона, являющегося связующим компонентом между частями антиокислительной системы, что, скорее всего, обусловливает активацию свободнорадикального окисления в условиях моделирования алкогольной зависимости. Это обстоятельство побудило нас исследовать возможность коррекции выявленных нарушений, что может быть достигнуто назначением препаратов, влияющих на уровень данного трипептида.
При введении препарата Глутоксим в течение первых суток после завершения алкоголизации нами отмечено, что продолжительность латентного периода, как и другие параметры железоиндуцированной хемилюминесценции, соответствует значениям контрольной группы животных. Значит, в отличие от группы алкоголизированных животных, не получавших Глутоксим, ограничения латентного периода при использовании Глутоксима не наблюдается. Через двое суток после отмены этанола на фоне применения Глутоксима также выявлены положительные сдвиги, выражающиеся в отсутствии роста амплитуды медленной вспышки и увеличения значений светосуммы, отмеченных в данный срок реакции отмены этанола у животных, которым Глутоксим не вводился.
Глутоксим, как структурный аналог окисленного глутатиона, способен активировать глутатион-зависи-мые ферменты системы антиоксидантной защиты, поэтому обнаруженные сдвиги показателей хемилюми-несценции могут быть связаны с данными эффектами препарата. В связи с этим было проведено измерение уровня восстановленного глутатиона и активности антиокислительных энзимов в ткани печени.
Содержание восстановленного глутатиона в гомогенатах печени снижено в первые сутки синдрома отмены этанола по отношению к контролю, как и в случае, когда Глутоксим не применялся. Однако степень уменьшения концентрации восстановленного глутатиона была значительно ниже, что немедленно отражалось на длительности латентного периода хеми-люминесценции, которая не отличалась от контроля,
и, вероятно, было обусловлено влиянием Глутоксима на активность глутатион-зависимых ферментов. В первые сутки синдрома отмены этанола это глутати-онпероксидаза и глутатион-Я-трансфераза. Активность
«ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК» № 1 (65) МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ «ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК» № 1(65)
первого фермента в этот срок выше контрольных значений, уровень активности второго нормализуется, что согласуется с представлениями об активирующем влиянии Глутоксима на данные ферменты. Кроме того, отмечается повышение под влиянием Глутоксима активности глутатионредуктазы на вторые сутки реакции отмены этанола, когда активность этого фермента нормализуется по сравнению с алкоголизированными животными, которым Глутоксим не вводился. Однако положительный эффект применения Глутоксима в этот срок еще не сопровождается повышением уровня восстановленного глутатиона. Соответствие значениям контрольной группы активности всех глутатион-зави-симых ферментов других показателей антиокислитель-ной защиты на третьи сутки реакции отмены этанола при использовании Глутоксима, а также более ранняя активация глутатионпероксидазы и предупреждение угнетения глутатионредуктазы и глутатион-Я-транс-феразы в различные сроки исследования позволяют сделать заключение о преимущественном влиянии Глутоксима на энзиматическую составляющую глу-татионовой системы.
В целом под влиянием Глутоксима не только отмечаются активация и поддержание нормального уровня глутатион-зависимых ферментов антиоксидантной защиты, но и происходит предупреждение негативных изменений параметров железоиндуцированной хемилюминесценции. Отсутствие влияния Глутоксима в указанных дозах на уровень восстановленного глутатиона может быть связано со значительной активацией свободнорадикальных процессов, требующей максимальных затрат серосодержащего антиоксиданта. Глутоксим не оказывает влияние на активность каталазы и супероксиддисмутазы в гомогенатах печени.
Таким образом, увеличение интенсивности свободнорадикальных процессов при состоянии отмены этанола у экспериментальных животных в основном обусловлено нарушением обмена глутатиона, которое выражается в уменьшении его печеночной концентрации, а также в несбалансированности ферментативного звена глутатионовой системы. Данные изменения предопределяют истощение антиоксидантной защиты, что является одной из важнейших причин формирования окислительного стресса. Под влиянием Глутоксима происходит уменьшение степени выраженности окислительного стресса при моделировании состояния отмены алкоголя.
Выводы
1. Формирование экспериментального синдрома отмены этанола сопровождается изменениями параметров железоиндуцированной хемилюминесценции гомогенатов печени экспериментальных животных, которые свидетельствуют об активации процессов свободнорадикального окисления.
2. При моделировании состояния отмены этанола уровень антиоксидантной защиты в гомогенатах печени снижен, что связано с недостаточностью фонда восстановленного глутатиона и нарушениями его обмена.
3. Введение Глутоксима лабораторным животным на фоне развития синдрома отмены этанола обеспечивает более раннее устранение нарушений обмена глутатиона.
Библиографический список
1. In situ rat brain and liver spontaneous chemiluminescence after acute ethanol intake / A. Boveris, S. Llesuy, L. Azzalis et al. //
Toxicology Letters. — 1997. — Vol. 93, № 1. — P. 23-28.
2. Фонякова О.Г. Взаимосвязь обмена глутатиона и процессов пероксидации при различной алкогольной мотивации и алкоголизации: дис. ... канд. мед. наук / О.Г. Фонякова. — Омск, 1996. — 137 с.
3. Шабанов П.Д. Основы наркологии / П.Д. Шабанов. — СПб.: Лань, 2002. - 560 с.
4. Abstinence-induced oxidative stress in moderate drinkers is improved by bionormalizer / F. Marotta, I. Reizakovic, H. Tajiri et al. // Hepatogastroenterology. — 1997. — Vol. 44, № 17. — P. 1360-1366.
5. Oxidative status in patients with alcohol dependence: a clinical study in Taiwan / F. Peng, S. Tang, M. Huang et al. // J. Toxicol. Environ. Health. — 2005. — Vol. 68, № 17-18. — P. 1497-1509.
6. Bagrel A. Mise en evidence par resonance paramagnetique de l'augmentation du taux de radicaux hydroxyles entre le debut et la fin d'un sevrage alcoolique de 29 jours / A. Bagrel // Les Cahiers de L'Ireb. — 2001. — Vol. 15. — P. 61-63.
7. Sun A. Foudin-L; Middleton-C-C. Membrane vulnerability in liver after chronic ethanol administration / A. Sun, L. Foudin, C. Middleton et al. // Pharmacol. Biochem. — 1980. — Vol. 324. — P. 12-14.
8. Alcohol-induced endothelial changes are associated with oxidative stress and are rapidly reversed after withdrawal / G. Soardo, D. Donnini, R. Varutti et al. // Alcohol Clin. ExP. Res. — 2005. — Vol. 29, № 10. — P. 1889-1898.
9. Лоскутова З.Ф. Виварий / З.Ф. Лоскутова. — М.: Медицина, 1980. — 93 с.
10. Успенский А.Е. Степень анальгезии как показатель выраженности синдрома отмены этанола в эксперименте / А.Е. Успенский, В.П. Нужный, А.Х. Абдрашитов // Мед. биол. пробл. алкоголизма: материалы Всесоюз. научн. конф. — Воронеж, 1987. — С. 85-89.
11. Тарасов Ю.А. Динамические характеристики пере-кисного окисления липидов в микросомах печени при введении этанола адреналэктомированным крысам / Ю.А. Тарасов, Г.З. Абакумов, Ю.М. Островский // Вопр. наркол. — 1992. — № 2. — С. 41-44.
12. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы / А.Е. Платонов. — М.: Издательство РАМН, 2000. — 52 c.
13. Modulation of experimental alcohol-induced liver disease by cytochrome P450 2E1 inhibitors / M. Morimoto, A. Hagbjork, Y. Wan et al. // Hepatology. — 1995. — Vol. 21. — P. 1610-1617.
14. Induction of cytochrome P4502E1 activity by moderate alcohol consumption in man / C.M. Oneta, J. Li, S. Ruuttimann et al. // Journal of Hepatology. — 2001. — Vol. 34. — P. 204.
15. Мазо В.К. Глутатион как компонент антиоксидантной системы желудочно-кишечного тракта / В.К. Мазо // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. — 1998. — № 1. — С. 47-52.
16. Черданцев Д.В. Диагностика и лечение окислительного стресса при остром панкреатите / Д.В. Черданцев, Ю.С. Винник, Э.В. Каспаров. — Новосибирск, 2002. — 147 c.
ЕФРЕМЕНКО Евгений Сергеевич, старший преподаватель кафедры биохимии и лабораторной медицины с курсом клинической лабораторной диагностики. ВЫСОКОГОРСКИЙ Валерий Евгеньевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии и лабораторной медицины с курсом клинической лабораторной диагностики.
Дата поступления статьи в редакцию: 10.10.2008 г.
© Ефременко Е.С., Высокогорский В.Е.
