CC BY
57
УДК 616.36-008-078:612.017.08:617-036.882-08:616-092.9 © Г.А. Дроздова, Е.А. Нургалеева, Д.А. Еникеев, Г.А. Байбурина, 2012
Г.А. Дроздова1, Е.А. Нургалеева2, Д.А. Еникеев2, Г.А. Байбурина2 МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ В ПЕЧЕНИ И ИЗМЕНЕНИЯ ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ КРОВИ КРЫС В МЕХАНИЗМАХ ФОРМИРОВАНИЯ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА В ПОСТРЕАНИМАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ гФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», г. Москва 2ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет»,
Минздрава России, г. Уфа
Острая остановка кровообращения пережатием сосудисто-нервного пучка была воспроизведена на 215 крысах-самцах массой 180-200 г под общим эфирным наркозом. Контрольная группа крыс (10) подвергалась аналогичному наркозу без моделирования клинической смерти. Установлено, что в печени крыс в постреанимационном периоде усиление процессов свободнорадикального окисления и перекисного окисления липидов наиболее выражено в 1-3-и, а также на 7- и 10-е сутки.
В эти же периоды наблюдается повышение в крови провоспалительных цитокинов ФНО-a, ИЛ-1, ИЛ-6. Активность ката-лазы печени в ранние сроки после оживления угнетена, а при повторном усилении перекисного окисления липидов к 10-м суткам находится на уровне контроля. Содержание восстановленного глутатиона во все сроки наблюдения снижено. Ферменты антирадикальной защиты крови - глутатионпероксидаза и общая антиоксидантная активность - угнетены во все сроки наблюдения. Каталаза эритроцитов и глутатионтрасферраза повышают свою активность в периоды усиления перекисного окисления липидов (ПОЛ).
Ключевые слова: постреанимационный период, печень, кровь, цитокины, каталаза, глутатионпероксидаза, глутати-онтрансферраза, восстановленный глутатин, общая антиоксидантная активность
G.A. Drozdova, E.A. Nurgaleeva, D.A. Enikeev, G.A. Bayburina METABOLIC CHANGES IN LIVER AND BLOOD CYTOKINE PROFILE OF RATS IN THE MECHANISMS OF SYSTEMIC INFLAMMATORY RESPONSE FORMATION IN POSTRESUSCITATION PERIOD
Acute circulatory arrest by neurovascular bundle ligation was reproduced on 215 male rats weighing 180-200 g under the ether anesthesia. The control group of rats (10) had the same anesthesia but without clinical death simulation. It was established that the livers of rats during postresuscitation period show the increase of free-radical oxidation processes and lipid peroxidation on the 1-3rd, and on the 7th and 10th day. At the same time there is an increase of anti-inflammatory cytokines TNF-a, IL-1, IL-6 in the blood. Catalase activity of the liver early after reviving is depressed and after the second enhancement of lipid peroxidation by the 10th day it can be controlled. The reduced glutathione level has been being low throughout observation. Antiradical defense enzymes of blood - glutathione peroxidase and the total antioxidant activity are depressed in all periods of observation. Erythrocyte catalase and glutationtrasferases increase their activity in periods of lipid peroxidation enhancement.
Key words: postresuscitative period, liver, blood, cytokines, catalase, glutathione peroxidase, glutationtransferases, restored glu-tatin, total antioxidant activity
Течение постреанимационного периода почках, легких [9]. В качестве посредников
осложняется развитием полиорганной недо- выработки цитокинов рассматриваются и
статочности, патогенетическую основу кото- продукты свободнорадикального окисления
рой составляет синдром системного воспали- [16], оказывающие повреждающее действие
тельного ответа. Тотальная гипоксия органов на мембраны клеток, в частности гепатоцитов
и тканей, развивающаяся во время клиниче- [10], и нарушающие течение процессов деток-
ской смерти, и последующая реперфузия при сикации. Это является одним из ключевых
оживлении приводят к возврату токсических звеньев развития синдрома полиорганной не-
метаболитов в общий кровоток с развитием достаточности. Временные и амплитудные
системных осложнений [12]. характеристики ПОЛ печени, ферменты анти-
В механизмах развития системного вос- радикальной защиты в динамике постреани-
палительного ответа поражение эндотелия мационного длительного периода освещены в
сосудов при реперфузии играет ключевую литературе недостаточно, не изучена система
роль, поскольку эндотелиоцит является мощ- глутатиона, позволяющая дополнительно проной секреторной клеткой, продуцирующей гнозировать нарушение процессов обезвре-
множество цитокинов - сигнальных молекул живания токсических метаболитов, образую-
управления, действующих на ткани и клетки щихся в большом количестве после перене-
притекающей крови [14]. Усилению выработ- сенного терминального состояния.
ки провоспалительных цитокинов способ- Изучение закономерностей метаболиче-
ствуют ишемические и реперфузионные по- ских изменений в органах (печени) функцио-
вреждения кишечника, его слизистой оболоч- нальной системы детоксикации, а также цито-
ки, что ведет к бактериальной и эндотоксино- кинового профиля крови является целью
вой транслокации с накоплением в печени, настоящего исследования.
Материал и методы
Острая остановка кровообращения пережатием сосудисто-нервного пучка воспроизводилась по методике [5] на 215 крысах-самцах массой 180-200 г под общим эфирным наркозом. Контрольная группа крыс (10) подвергалась аналогичному наркозу без моделирования клинической смерти.
Активность каталазы в печени и эритроцитах определялась по [4], содержание восстановленного глутатиона (GSH) в печени -по Patterson et al. в модификации Путилиной Ф.Е. [6]. Определение а-глутатион-S-трансферраз осуществлялось при помощи стандартных диагностических наборов Biotrin High Sensitivity Alpha GST EIA фирмы «Biotrin» США для иммуноферментного количественного определения. Общую антиоксидантную активность крови (ОАА) оценивали калориметрическим методом с помощью стандартного тест-набора «Total аntioxidant status» фирмы «Randox Laboratories» (Великобритания).
Содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой в печени (ТБК-рп), определяли с помощью набора реактивов «ТБК-АГАТ» (Россия). При оценке Fe2-индуцированной хемилюминесценции в крови и печени определяли спонтанное свечение, амплитуду медленной вспышки, светосумму по [8]. Цитокины определялись с помощью стандартных диагностических наборов имму-ноферментного анализа фирмы «Вектор бест» (Россия). В сыворотке крови исследовано содержание а-ФНО, ИЛ-lß, ИЛ-6, ИЛ-2, ИЛ-4.
Статистическая обработка результатов велась с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни для независимых выборок.
Результаты
Изучение динамики содержания ТБК-рп в печени после перенесенной клинической смерти показало достоверное накопление вторичных метаболитов перекисного окисления липидов с 1-х по 21-е сутки, причем наиболее высокими показатели были именно на 21-е сутки, когда превышение составило 86,2% по отношению к контролю. В конце периода наблюдения их содержание приблизилось к исходному уровню.
Спонтанная светимость в ткани печени крыс во все сроки наблюдений, за исключением 28- и 35-х суток, были выше исходных величин. Выявлялось три волны повышения значений: к 3-м суткам на 44,8% (р=0,0343), к 10-м суткам в два раза (р=0,0052) и к 21-м суткам на 69% (р=0,2413). Значения амплиту-
ды медленной вспышки были повышены по отношению к контролю только на 1-е сутки (в 2,3 раза), а в последующие сроки, вплоть до 35-х суток, показатели были либо ниже контроля, либо приближались к нему. Значения светосуммы достоверно превышали исходные параметры на 1-е и 3-и сутки в 1,6 раза (р=0,0025) и 2,1 раза (р=0,0002) соответственно, с последующим снижением по отношению к контролю и лишь на 35-е сутки имели тенденцию к росту.
Низкие показатели амплитуды медленной вспышки и светосуммы, по всей видимости, обусловлены накоплением веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНиСММ), которые способны связывать ионы железа, добавляемые для инициирования окисления. В результате снижается их каталитическая активность и падает интенсивность хемолюминесценции [8].
Ранее нами было показано повышение содержания ВНиСММ во все сроки постре-анимационного периода с максимальными значениями на 1-е - 3-и и 10-е сутки [2], что позволило нам выделить две волны эндотоксикоза.
Процессы ПОЛ протекали на фоне поражения ферментов антирадикальной защиты. Снижение активности каталазы печени наблюдалось у животных в ранние сроки после оживления. Так, в 1-е сутки ее активность была ниже контроля на 35,5% (р=0,0494) (рис.2), а к 3-м суткам приблизилась к контрольному уровню. В последующие дни - на 5- и 7-е сутки - показатели были значимо выше контрольных значений на 24,1% и 35% соответственно. На 10- и 14-е сутки уровень каталазной активности колебался в районе контрольных величин, а начиная с 21-х - статистически значимо превышал их. Так, на 21е сутки активность каталазы была выше контроля на 41,4% (р=0,0032), на 28-е сутки - на 38,2% (р=0,0413), а на 35 -е сутки активность каталазы была максимальной, превысив контроль в 1,8 раза (р=0,0003). Содержание восстановленного глутатиона, играющего важную роль в процессах конъюгации в печени и защите ее от свободнорадикального окисления, было низким, за исключением 3- и 5-х суток, когда отмечалась тенденция к повышению значений.
Ферменты антирадикальной защиты крови, в частности каталазная активность эритроцитов, в первые сутки имели тенденцию к росту, а на 3-и сутки были достоверно выше контрольных значений на 43,7% (р=0,0025) (рис.3).
Рис. 1. Показатели хемилюминесценции печени в постреанимационном периоде у крыс (** - р<0,01, * - р<0,05 в сравнении с контролем, принятым за 100%)
Рис. 2. Показатели активности каталазы, восстановленного глутатиона печени в течение постреанимацион-ного периода (** - р<0,01, * - р<0,05 в сравнении с контролем, принятым за 100%)
Повторное повышение каталазной активности произошло на 7-е сутки в 2,3 раза и сохранялось вплоть до 21-х суток постреани-мационного периода. К 28-м суткам уровень каталазной активности снизился до контрольных величин, а к концу периода наблюдения был ниже контроля на 28% (р=0,0065). Другой фермент - глутатионпероксидаза, катализирующий восстановление пероксида водорода до О2 и Н2О, был угнетен до 21-х суток, а в последующем его значения приближались к контрольным или несколько превышали их.
Изучение содержания глутатионтранс-ферразы (a-GST), ключевого фермента, обеспечивающего совместно с глутатионом обезвреживание токсических метаболитов и ксенобиотиков в реакциях конъюгации, а также защиту клеток от продуктов ПОЛ [11], показало, что активность a-GST в постреанимаци-онном периоде была значимо повышена лишь на 1-е сутки, а уже к 3-м суткам наблюдался спад. На пике второй волны эндотоксикоза (10-14-е сутки) отмечался всплеск активности фермента.
Общая антиоксидантная активность крови была значимо низкой во все сроки постреанимационного периода, причем снижение составляло от 20 до 40% (рис.3).
Рис. 3. Показатели активности глутатионпероксидазы, глутати-онтрансферразы, каталазы эритроцитов и общей антиоксидант-ной активности крови в течение постреанимационного периода (*** - р<0,001, ** - р<0,01, * - р<0,05 в сравнении с контролем, принятым за 100%)
Изучение цитокинового профиля показало, что достоверный подъем провоспалительных цитокинов ФНО-а и ИЛ-6 регистрировался лишь на 1-е сутки (р=0,00016) и (р=0,00038) соответственно (рис. 4). Одновременное повышение уровней ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8 является неблагоприятным прогностическим признаком [7]. В то же время ИЛ-ф показал иную динамику, содержание его было ниже уровня контроля, причем данное снижение было достоверно до 10-х суток, а в дальнейшем отмечалась лишь тенденция к снижению. Повышение ФНО-а на фоне снижения ИЛ-1, по мнению ряда авторов [1], свидетельствует о генерализации воспалительного процесса с формированием синдрома полиорганной недостаточности и может иметь прогностическое значение в плане развития инфекционных осложнений.
Изучение естественного ингибитора воспаления ИЛ-4 в постреанимационном периоде показало фазную динамику содержания, однонаправленную с пиками повышения провоспалительных цитокинов ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8. Данный факт можно расценить как по-
ложительный, учитывая способность цитоки-на подавлять освобождение цитокинов воспаления. Однако практически параллельный выброс в системный кровоток каскадов анти-воспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10), обладающих иммуномодулирующим дей-
ствием, приводит к подавлению секреции макрофагами медиаторов провоспалительной фазы [7], что в нашем исследовании произошло уже к 3-м суткам, и развитию иммуноде-фицитного состояния - «иммунного паралича».
Рис. 4. Содержание провоспалитель-ных цитокинов в плазме крови крыс в постреанимационном периоде (*** - р<0,001, ** - р<0,01, * - р<0,05 в сравнении с контролем, принятым за 100%)
Второй подъем в количественных параметрах провоспалительных цитокинов был отмечен с 10-х суток после оживления, когда произошло достоверное повышение ФНО-а и ИЛ-6, что, с одной стороны, обусловило формирование второй волны эндотоксинемии наряду с нарушенной деятельностью многих органов вследствие полиорганной недостаточности и катаболическими процессами, в них происходящими [17], а с другой стороны, характеризует некоторую активацию деятельности иммунной системы после состояния «иммунного паралича». В отношении ИЛ-6 нет однозначной трактовки полученных ре-
зультатов. В 1-е сутки постгеморрагического периода повышение концентрации ИЛ-6, по всей видимости, связано с воспалительным ответом печени и легких, в которых активировался 81а1 3 - один из шести белков активаторов транскрипции [15]. На 10-е сутки повышение концентрации изучаемого цитокина, возможно, связано с завершением острой фазы воспаления, поскольку он оказывает как провоспалительный, так и противовоспалительный эффект [13]. Содержание ИЛ-4 увеличивалось параллельно повышению ФНО-а и ИЛ-6, что приводит к очень непродолжительному всплеску их активности.
Рис. 5. Содержание противоспалительных цитокинов в нлазме крови крыс в постреанимационном периоде (*** - р<0,001, ** - р<0,01, * - р<0,05 в сравнении с контролем, принятым за 100%)
В постреанимационном периоде снижа- палительный цитокин ИЛ-2 играет централь-
лась выработка таких противовоспалительных ную роль в регуляции клеточного иммуните-
цитокинов, как ИЛ-2 и ИЛ-^A. Противовос- та, что позволяет усилить защиту организма
от инфекционных осложнений [3]. Развитие Выводы
инфекционных осложнений, а также длитель- 1. Установлена фазность усиления про-
ное наличие очагов некротических изменений цессов свободнорадикального окисления и
в органах и тканях при проведении наших ПОЛ в печени крыс в постреанимационном
экспериментов, возможно, связано с нару- периоде, наиболее выраженная в 1-е - 3-и, а
шенной выработкой ИЛ-2 в постреанимаци- также на 7- и 10-е сутки после оживления.
онном периоде. Понижение выработки друго- Активность каталазы печени в ранние сроки
го противовоспалительного цитокина - ИЛ- после оживления угнетена, а при повторном
1РА - обусловлено, по всей видимости, сни- усилении ПОЛ к 10-м суткам находится на
женной выработкой ИЛ-1, поскольку ИЛ-1РА уровне контроля. Содержание восстановлен-
является его эндогенным ингибитором. ного глутатиона в эти сроки также снижено.
Таким образом, так называемый «цито- 2. Выявлено, что в периоды активации
киновый пожар» в постреанимационном пе- ПОЛ в печени наблюдается повышение со-
риоде весьма кратковремен лишь в первые держания в крови провоспалительных цито-
трое суток, что необходимо учитывать при кинов ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6.
коррекции цитокиновых расстройств, по- 3. Ферменты антирадикальной защиты
скольку применение антител к провоспали- крови - глутатионпероксидаза и ОАО - угне-
тельным цитокинам или элиминация цитоки- тены во все сроки наблюдения. Каталаза
нов сорбционными методами в более поздние эритроцитов и глутатионтрасферраза повы-
сроки могут только усилить развитие иммун- шают свою активность в периоды усиления
ной дисфункции и усугубить тяжесть повре- ПОЛ.
ждений органов и систем.
Сведения об авторах статьи:
Дроздова Галина Александровна - д.м.н., профессор кафедры патофизиологии ФГБОУ ВПО РУДН. Адрес: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6.
Нургалеева Елена Александровна - к.м.н., доцент кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, Ленина, 3.
Еникеев Дамир Ахметович - д.м.н., профессор, зав. кафедрой патофизиологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, Ленина, 3.
Байбурина Гульнар Анузовна - к.м.н., доцент кафедры патофизиологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, Ленина, 3.
ЛИТЕРАТУРА
1. Влияние травматического токсикоза на иммунную реактивность пострадавших с шокогенной травмой / О.Б. Арискина, Л.П. Пивоварова, И.В. Осипова [и др.] // Актуальные вопросы сочетанной шокогенной травмы и скорой помощи: сборник научных трудов, посвящ. 70-летию НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе. - СПб., 2002. - С. 247-257.
2. Еникеев, Д.А. Влияние морфофункционального состояния брыжейки и кишечника в развитии эндотоксемии в постреанимационном периоде в эксперименте / Д.А. Еникеев, Е.А. Нургалеева, Е.Р. Фаршатова, Д.С. Куклин [и др.]// Медицинский вестник Башкортостана. - 2011. - Т.6, № 1. - С. 82-86.
3. Кетлинский, С.А. Эндогенные иммуномодуляторы / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев, А.А. Воробьев. - СПб., 1992. - 256 с.
4. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк, Л.И. Иванова, И.Г. Майорова // Лабораторное дело. - 1988. - N° 1. -С.16-18.
5. Корпачев, В.Г. Моделирование клинической смерти и постреанимационной болезни у крыс / В.Г. Корпачев, С.П. Лысенков, Л.З. Телль // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1982. - № 3. - С. 78-80.
6. Методы биохимических исследований / под ред. М.И.Прохоровой - Л.: Изд-во Ленинградского университета, 1982. - 272 с.
7. Прогностическое значение определения спектра провоспалительных цитокинов у больных с краниоторакальной травмой тяжелой степени / В.Н. Лукач, А.Г. Калиничев, Г.А. Байтугаева [и др.] // Анестезиология и реаниматология. - 2008. - № 1. - С. 31-33.
8. Хемилюминесцентные методы исследования в пульмонологии: методические рекомендации / Р.Р. Фархутдинов, У.Р. Фархут-динов, Л.М. Абрамова. - Уфа: Издательство «Здравоохранение Башкортостана», 2011. - 44 с.
9. Храмых, Т.П. К вопросу о эндотоксемии при геморрагической гипотензии / Т.П. Храмых, В.Т. Долгих // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2009. - № 1. - С. 28-30.
10. Влияние нитроглицерина на некоторые показатели прооксидантно-антиоксидантного баланса и функциональное состояние печени при ишемии-реперфузии / М.Н. Ходосовский, В.В. Зинчук // Бюллетень эксперим. биологии и медицины.- 2006.- Т.142, №12. - С. 631-634.
11. Чеснокова, Н.П. Молекулярно-клеточные механизмы инактивации свободных радикалов в биологических системах / Н.П. Чес-нокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Успехи современного естествознания. - 2006. - № 7. - С. 29-36.
12. Шугаев, А.И. Острые нарушения артериального мезентериального кровообращения / А.И. Шугаев, Вовк А.В. //Вестн. хир. -2005. -Т.164, № 4 - С. 112-115.
13. Ярилин, А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии / А.А. Ярилин // Иммунология. -1997. - № 5. - С. 7-13.
14. Galley, H.F. Physiology of the endothelium / H.F. Galley, N.R. Webster // Brit. J. Anaesth. - 2004. - Vol. 93. - № 1. - P. 105-113.
15. Interleukin-6 production in hemorrhagic shock is accompanied by neutrophil recruitment and lung injury / C. Hierholzer, J.C. Kalff, L. Omert [et al.] // Am. J. Physiol. - 1998. - Vol. 275, № 3. - P. L611-21.
16. Lo, Y.Y.C. Reactive oxygen species mediate cytokine activation of c-Jun NH2-terminal kinasis / Y.Y.C. Lo, J.M.C. Wong, T.F. Cruz // J. Biol. Chem. - 1996. - Vol. 271. - P. 15703-15707.
17. Sepsis-induced organ failure is mediated by different pathways in the kidney and liver: acute renal failure is dependent on MyD88 but not renal cell apoptosis / J.W. Dear, H. Yasuda, X. Hu [et al.] // Kidney Int. - 2006. - Vol. 69, № 5. - P. 832-836.
