CC BY
48
A.A. Гумерова, А.К. Шафигуллина, С.Р. Абдулхаков,
И.М. Газизов, М.С. Калигин, Д.И. Андреева,
М.А. Титова, Г.Р. Бурганова, A.A. Трондин,
А.Р. Шайхутдинова, А.П. Киясов Перспективы использования различных популяций стволовых/прогениторных клеток в клеточной терапии заболеваний печени
ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань, Россия [email protected]
A.A. Gumerova, A.K. Shafigullina, S.R. Abdulkchakov,
I.M. Gazizov, M.S. Kaligin, D.I. Andreeva, M.A. Titova,
G.R. Burganova, A.A. Trondin, A.R. Shaichutdinova,
A.A. Kiassov
Perspectives of different populations of stem/progenitor cells in stem cell therapy of liver diseases
В настоящее время проводится множество исследований, посвященных поиску региональной стволовой клетки печени, изучению возможностей диффе-ренцировки в гепатоциты стволовых/прогениторных клеток различной природы и анализу перспектив их дальнейшего использования в терапии хронических заболеваний печени. Целью комплекса наших экспериментальных и клинических исследований было оценить перспективы применения различных популяций стволовых/прогениторных клеток для лечения хронических гепатитов.
Материал и методы. Аутотрансплантация мобилизованных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) периферической крови проведена 12 больным хроническим алкогольным гепатитом с исходом в тяжелый фиброз/цирроз печени. Биопсия печени проведена больным до трансплантации и через 1, 3 и 12 мес. после трансплантации. В условиях in vitro проведено изучение способности ГСК человека, мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга крысы и звёздчатых клеток печени (ЗКП) крысы дифференцироваться в гепатоциты в различных условиях (влияние растворимых и контактных факторов со стороны ЗКП, добавление факторов роста). В экспериментах на белых лабораторных крысах изучена активация стволового компартмента печени после частичной гепатэктомии, а также хоуминг и пути дифференцировки нативных и генетически модифицированных ГСК пуповинной крови человека, транпланти-рованных крысам, перенесшим частичную гепатэктомию. Изучение фенотипов клеток во всех случаях проведено иммуногистохимическими методами.
Результаты клинических испытаний аутотрансплантации ГСК, мобилизованных из периферической крови, больным алкогольным гепатитом с исходом в тяжелый фиброз/цирроз печени показали её безопасность и эффективность. Через 1—3 мес. после однократной инъекции ГСК у больных улучшались клинические, биохимические и морфологические показатели (снижение индекса гистологической активности на 1—2 пункта у всех больных). Иммуногистохимическое исследование позволило установить снижение активности миофиб-робластов, восстановление фенотипа эндотелиальных клеток синусоидов печени и уменьшение их капилляри-зации, снижение напряженности регенераторного процесса (сокращение числа пролиферирующих клеток) и риска опухолевой трансформации (уменьшение числа клеток, экспрессирующих Bcl-2). Однако эффект от лечения сохранялся не более 12 мес.
Результаты экспериментов по культивированию ГСК пуповинной крови человека, ММСК и ЗКП крысы показали, что ГСК сохраняют жизнеспособность только при сокультивировании с ЗКП, но не дифференцируются в гепатоциты ни под воздействием паракринных и контактных влияний со стороны последних, ни под влиянием добавленных в культуральную среду факторов роста. Однако ГСК пуповинной крови человека (как нативные, так и генетически модифицированные) после трансплантации крысам, перенёсшим операцию частичной гепатэктомии, мигрировали в печень и дифференцировались в гепатоциты, холангиоциты и синусоидные клетки печени. Другие же популяции клеток — ММСК и ЗКП — продемонстрировали, в отличие от ГСК, способность к гепатоцитарной дифференцировке уже в условиях in vitro. ММСК начинали экспрессировать гепатоцитарные маркеры (цитокератин 18, —-фето-протеин, специфический антиген гепатоцитов) спонтанно, но при добавлении среды, переработанной ЗКП, этот процесс происходил быстрее и был более выраженным. ЗКП после образования монослоя также начинали экспрессировать гепатоцитарные маркеры. Культивирование ММСК и ЗКП с факторами роста ускоряло их дифференцировку в гепатоциты.
Изучение активации стволового компартмента в печени после частичной гепатэктомии показало наиболее выраженные свойства стволовых/прогениторных клеток (экспрессию маркера стволовых клеток C-kit) у ЗКП и гепатоцитов. Аналогичные результаты были получены нами ранее при изучении онтогенеза человека и крысы.
Выводы: поскольку в условиях in vivo ЗКП проявляют признаки стволовых/прогениторных клеток в онтогенезе и при регенерации, в условиях in vitro ММСК и ЗКП демонстрируют значительно более выраженные, по сравнению с ГСК, потенции к гепатоцитарной дифференцировке, а терапевтический эффект от аутотрансплантации ГСК больным хроническим алкогольным гепатитом не является длительным, мы считаем более перспективными для разработки методов клеточной терапии заболеваний печени ЗКП и ММСК.
Р.В. Деев 1 а, И.Я. Бозо 3, Н.В. Цупкина 4,
И.В. Честков 5, М.С. Калигин 6, Г.П. Пинаев 4 Судьба пересаженных в костную рану мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток
1 ОАО «Институт стволовых клеток человека»,
Москва, Россия
2 ФГУ «Российский НИИ травматологии и ортопедии им. P.P. Вредена Росмедтехнологий»,
Санкт-Петербург, Россия
3 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия
4 УРАН «Институт цитологии РАН», Санкт-Петербург, Россия
5 УРАН «НИИ общей генетики РАН им. Н.И. Вавилова», Москва, Россия
Б ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Россия [email protected]
R.V. Deev, I.Ya. Bozo, N.V. Tsupkina, I.V. Thestkov,
M.S. Kaligin, G.P. Pinaev
Differentiations of transplanted in bone defect multipotent mesenchymal stromal cells
Многочисленными исследованиями показан диф-ференцировочный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Подтверждающие это данные были получены в экспериментах
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, hl< 3, 2010
как in vitro, так и in vivo — в диффузионных камерах, то есть в условиях, лишенных всего многообразия факторов микроокружения в тканях и тем более — в костной ране (про- и противовоспалительные цитокины и др.). Ранее нами было показано, что в случае пересадки в дефект длинной трубчатой кости культивированных на остеоиндуктивном носителе ММСК, последние в первые недели локализуются прежде всего в реактивно измененной соединительной ткани межбалочных пространств в области формирования костного регенерата (Р.В. Деев и др., 2008), что дало основания считать одним из основных факторов воздействия на репаративный процесс индукционные влияния со стороны пересаженных клеток. Вместе с тем, требуется более детальное исследование непосредственной дифференцировки пересаженных ММСК в костной ране и их продуктивного участия в регенерационном гистогенезе.
Цель исследования — выявить пересаженные ММСК и их дифференцировочную судьбу в составе костного регенерата через 30 и 60 сут. после пересадки.
Материал и методы. Эксперименты выполнены на кроликах. ММСК получали из костного мозга по известной методике. После 3 нед. культивирования клетки подвергали трансфекции лентивирусной конструкцией GPur, кодирующей GFP под CMV промотером. Еще через 4 сут. культивирования, визуально констатировали результативность трансфекци. В дальнейшем по оригинальной запатентованной методике совмещали меченые клетки с деминерализованным костным матриксом из расчета 10 млн клеток на 1 см3 материала. Всем животным осуществляли резекцию 2 см средней трети диафиза большеберцовой кости, выполняли интрамедуллярную фиксацию с монтажом импровизированного дистрактора для предотвращения самостоятельного совмещения костных опилов. Полученный таким образом танеинженерный эквивалент кости помещали в диастаз, рану ушивали послойно. Животных выводили из эксперимента через 30 и 60 сут. выпиливали костные фрагменты из области дефекта, фиксировали, осуществляли рутинную бескислотную декальцинацию, изготавливали гистологические препараты по общепринятой методике. Срезы исследовали в люминесцентном микроскопе. Для более достоверного выявления пересаженных клеток ставили иммуноги-стохимическую реакцию с антителами к GFP (Abeam, Великобритания).
Результаты. Установлено, что пересаженные клетки сохраняли жизнеспособность через 30—60 сут. Они интегрировались в состав мультитканевого костного регенерата и претерпевали дивергентную дифферен-цировку на месте в трех ортодоксальных направлениях. Получены данные, свидетельствующие о фибро-, хондро- и остеогенной дифференцировке пересаженных в составе тканеинженерного эквивалента ММСК. Следует отметить, что значительная их часть локализовалась в периваскулярных тканевых нишах.
Таким образом, клеточная культура не только индуцирует восстановительный процесс в костной ране, но и продуктивно участвует в строительстве регенерата.
Р.В. Деев 1, С.Л. Киселев а, A.A. Исаев \
A.B. Приходько 1, И.В. Потапов 1, С.В. Грязнов 3,
P.E. Калинин 3, П.Г. Швальб 3 Опыт создания и применения (1-2 фаза клинических испытаний) препарата на основе гена VEGF
1 ОАО «Институт стволовых клеток человека»,
Москва, Россия
2 УРАН «Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН», Москва, Россия
3 ГОУ ВПО Рязанский государственный медицинский университет, Рязань, Россия
R.V. Deev, S.L. Kiselev, A.A. Isaev, A.V. Prichodko, I.V. Potapov,
S.V. Griasnov, R.E. Kalinin, G.G. Schvalb
Experience of creating and applying
(1-2 phase of clinical trials) of the drug on the basis
of VEGF gene
В соответствии с действующим законодательством и на основании официально выполненных доклинических исследований проведена l-lla фаза клинических исследований на базе трех лечебных учреждений. В простое открытое рандомизированное многоцентровое исследование было включено 45 пациентов, 10 из которых составили группу сравнения. Исследование проведено в строгом соответствии с национальными правилами этики и достоверности клинических исследований. Назначение исследуемого препарата производилось на фоне стандартной терапии в соответствии с протоколами ведения больных, используемыми в клинике, участвующей в исследовании. Пациенты группы испытуемых получали гентерапевтический препарат на основе высокоочищенной сверхскручен-ной формы плазмиды pCMV-VEGF165, кодирующей эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF). Производитель: ОАО «Институт Стволовых Клеток Человека» (Москва, Россия).
Цель исследования: определить безопасность и переносимость введения препарата у пациентов с ишемией нижних конечностей (Па-Ill стадии по A.B. Покровскому — Фонтейну).
Препарат вводили внутримышечно дважды, в дозе 1,2 мг с интервалом в 7 или 14 сут.
Активный период наблюдения составил 30 сут. Общее наблюдение за пациентами осуществлялось в течение 3 мес. В ходе наблюдения оценивали: жалобы, жизненно-важные функции, дистанцию безболевой ходьбы, общий и биохимический анализы крови, мочи, коагулограмму, результаты ультразвукового дуплексного сканирования сосудов нижних конечностей, лодыжечно-плечевой индекс, транскутанное напряжение кислорода (ТсР02).
Установлено, что препарат безопасен для пациентов, имеет хорошую переносимость, не оказывает значимого влияния на общеклинические, биохимические показатели, а также показатели гемостаза. Результаты обработаны статистически (р<0,05). У пациентов группы испытуемых в сравнении с исходным уровнем статистически достоверно увеличивались лодыжечноплечевой индекс (на 18,8—22,9%), уровень ТсР02 (на 15,4—17,8%), безболезненно проходимое расстояние (на 260,8-290,3%).
Полученные результаты позволяют реализовывать следующую фазу клинических испытаний с участием больших групп пациентов.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 3, 2010
