CC BY
26
УДК 619:616.981.55
Фотша Т.1., © доктор ветеринарних наук, професор, TiF [email protected] Улько Л.Г., кандидат ветеринарних наук, доцент, Larisau@ukr. net Сумський нацюнальний аграрный утеерситет
ВИВЧЕННЯ КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГ1ЧНИХ ТА ПАТОГЕННИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ М1КРОФЛОРИ 1ЗОЛЬОВАНО1' З ГН1ЙНО-НЕКРОТИЧНИХ ВОГНИЩ ДИСТАЛЬНОГО В1ДД1ЛУ
К1НЦ1ВОК У КОР1В
Виечалися культурально-морфолог1чт та патогент еластиеост1 Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes Streptococcus fecalis Escherichia coli Fusebacterium necrophorum Proteus vulgaris Proteus mirabilis Dichelobacter (Bacteroides) nodosus Klebsiella pneumoniae Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes Clostridium septicum Clostridium oedematiens Clostridium perfringens iзольоеаних з гтйно-некротичних еогнищ дистального eiddwy ктщеок у ко^pie.
Ключовi слова: ктщеки, гтйно-некротичт ураження, мтрофлора, патогент, культуpальнi,моpфологiчнi.
Ведуча роль в патолопчному процеш при гншно-некротичних ураженнях кшщвок належить шфекцшним агентам - Fusobacterium necrophorum та Dihelobacter nodosus [1, 6]. Пусковим мехашзмом в розвитку некробактерiзу, за даними ряду авторiв, являеться порушення рубцевого травлення та хрошчний ацидоз, який виникае при згодовуванш велико1 кшькост концентрованих кормiв та незбалансованому ращош по вуглеводам, протешу i мiнеральним речовинам. Захворювання перебiгае по типу аутошфекци, оскiльки збудники хвороби являються постшними обивателями кишкового тракту велико1 рогато1 худоби i складають нормофлору [4].
Для виникнення та розвитку захворювання необхщна наявшсть та сумацiя, як правило декшькох факторiв: пiдвищена волопсть повiтря в примiщеннi де утримуються тварини i постiйна сирiсть в мюцях розташування кiнцiвок тварин, травми кшщвок, яю призводять до порушення цшсносп шкiряного покриву та порушення вггамшно-мшерального обмiну [5].
Оскiльки виникнення хвороби спричиняе не скшьки мжроб, скiльки стан органiзму тварин зумовлений умовами годiвлi та утримання, то некробактерюз слiд вважати факторною хворобою [2, 4]
Гншно-некротичш ураження кшщвок можуть виникати вторинно на фош iмунодефiцитного стану, порушеннi бiлково-вуглеводного обмшу, ацидозу, кетозу та остеодистрофи [3].
© Фотша Т.1., Улько Л.Г., 2009
185
Захворювання дистального вщдшу кшщвок у високопродуктивних корiв, яю перебiгають з ознаками гнiйно-некротичного запалення на сьогоднi являються загрозою економiчному благополуччю молочних ферм, так як приводять до зниження продуктивност на 18-30% та ранньо! вибраковки тварин.
Метою нашо! роботи було вивчити морфолопчш, антигеннi та патогеннi властивост мiкрофлори iзольовано! з гнiйно-некротичних уражень дистального вiддiлу кiнцiвок у корiв та з'ясувати значення асоцiацiй мiкроорганiзмiв в патогенезi захворювань кiнцiвок, яю перебiгають з ознаками гнiйно-некротичного запалення.
Матер1али 1 методи дослщжень. Дослщження виконанi на кафедрi ветсанекспертизи, м^робшлогп зоогiгieни та безпеки i якос^ продуктiв тваринництва та кафедрi терапи, фармакологи та клмчно! дiагностики Сумського нащонального аграрного унiверситету, в господарствах Сумсько!, Чершпвсько! та Полтавсько! областей.
У експериментальних дослiдженнях було використано 186 проб патолопчного матерiалу вщ велико! рогато! худоби iз господарств вказаних областей Укра!ни. Iзоляцiю та щентифкащю мiкрофлори проводили за загальноприйнятими методиками.
Вивчали культурально-морфологiчнi, бiохiмiчнi, токсигеннi i патогенш властивостi культур мiкроорганiзмiв.
Результати роботи. На пiдставi результатiв проведених дослщжень, були встановленi причини виникнення, видовий та кiлькiсний склад мiкрофлори iзольованоl з уражених кiнцiвок, механiзм розвитку патологи, описана клмчна картина хвороб кшщвок, умови поширення i вплив сприяючих факторiв.
При вивченнi бюлопчних властивостей iзольованих ешерихiй ми встановили, що вони були представленi грамнегативними паличками з закругленими кiнцями. Деяю культури мали кокоподiбну форму. Палички розташовувались окремо або попарно. Бшьша частина культур була рухлива (93,4%). На МПБ iзольованi культури створювали рiвномiрне скаламучення з бiлуватим осадом, який розбивався при струшуваннi. Деяю культури на поверхнi МПБ формували плiвку (25,62%).
На МПА культури формували ркт у виглядi круглих, Ырувато-бших колонiй з гладкою, блискучою поверхнею. На середовищi Ендо бшьшють iзолятiв утворювали яскраво-червонi з металевим блиском колонi! (72,76%).
У бiохiмiчному вiдношеннi iзольованi культури були активними: зброжувались, з утворенням кислоти та газу, або тшьки кислоти, сахари та багатоатомних спирав; 76,3% iзольованих ешерихiй мали типовi бiохiмiчнi властивостц 23,7% були атиповими, якi мали вщхилення по одному чи декшькох показниках.
При вивченнi антигенних властивостей iзолятiв ми встановили, що вони належать до сероварiв 01, 02, 04,078 - 13,11% культур не типувалися ш однieю з сироваток набору.
186
Патогенш властивост iзольованих ешерихш ми вивчали на бших мишах вагою 14-16 г. Ми вщм^или, що iзольованi ешерихи викликали стовiдсоткову загибель бiлих мишей. У дослщних мишей вiдмiчали втрату координаци руху, тремор м'язiв голови та кшщвок, на розтиш вiдмiчали серозно-катаральний ентерит, катаральнi пневмони .
Морфолопчно культуральнi та серологiчнi дослiдження культур ешерихш, яю були реiзольованi вщ дослiдних тварин, дозволили встановити ïx iдентичнiсть з культурами, якi були взят для зараження.
Мiкроорганiзми роду Klebsiella були представлен паличками овальноï форми, грамнегативнi, неруxомi. На МПБ формували ркт з утворенням гомогенноï каламутностi, 24,3% культур утворювали осад. На МПА вони утворювали пишний рiст, великi, вологi колонiï округлоï форми але у 84,5% випадюв вiдмiчали колони, що зливались дуг з другом. На середовищi Ендо лактозопозитивш клебсieли утворювали чорно-червонi колони з металевим вiдтiнком (48,9%), лактозонегативш - давали рiст, схожий з сальмонелами (51,1%). З метою диференщаци вiд сальмонел ми проводили виави на середовище Сiменса, де клебЫели утворювали куполоподiбнi блискучi колонн що було характерним для цього виду бактерш. Крiм того робили переЫви на середовище Плоскiрева де клебаели утворювали жовтi колони. Iзольованi культури не утворювали Ырководень i не розкладали сечовину.
При вивченнi патогенних властивостей ми встановили, що iзольованi культури клебсiел були патогеннi для лабораторних тварин i викликали 85% загибель бших мишей.
У бших мишей ми реестрували серозно - катаральш пневмони i осередковий набряк легень, останне ми пов'язуемо з штоксикацею оргашзму дослщних тварин.
З метою iзоляцiï мiкроорганiзмiв роду Proteus ми використовували метод Шукевича. На середовищi Плоскiрева iзольованi мiкроорганiзми формували рют у виглядi великих, натвпрозорих колонiй, що мали характерний запах. На вкмут-сульф^ному агарi колонiï мали чорно-коричневий колiр. На МПА утворювали "повзучий рют". Бiльшiсть iзольованиx культур нами були вщнесеш до Proteus mirabilis (89,8%) i тшьки 10, 2% культур були вщнесеш до Proteus vulgaris. При зараженш лабораторних тварин iзольованими збудниками загибель бших мишей склала - 90% (таблиця 1).
Захворювання проходило гостро, вiдмiчали пронос, фекалiï утримували велику кшькють слизу, зеленого кольору, з неприемним запахом. При розтиш загиблих тварин спостер^али явища iнтоксикацiï (кров погано згорталася, набряк легень та шше), катаральнi, катарально-геморагiчнi та ерозивнi змши кишок.
187
Кокова мжрофлора була у виглядi грампозитивних коюв. На глюкозо-кров'яному агарi стрептококи мали picT у виглядi дрiбних, росяних колонш, якi мали зону гемолiзу. Стафiлококи утворювали кpуглi, опуклi колони лимонно-жовтого кольору. Stаphylococcus aureus на МПБ утворював слизовий осад, який при струшуванш пiднiмавcя у виглядi косички. утворював характерний рют на cеpедовищi з 40% жовчi та викликав pедукцiю метиленового блакитного. На МПБ Streptococcus fecalis давав придонний ркт, який при струшуванш розбивався на плас^вщ. Stаphylococcus aureus диференцшвали вiд Streptococcus pyogenes за допомогою каталазно! проби та росту на МПБ з додаванням 10% хлориду натрш. Streptococcus pyogenes на даному cеpедовищi не давав росту, а Stаphylococcus aureus викликав помутншня з утворенням слизового осаду.
При зараженш лабораторних тварин Streptococcus pyogenes викликав загибель у бших мишей у 80% випадках. Stаphylococcus aureus викликав загибель 70% бших мишей..
Таблиця 1
Патогенш властивосп мпкроорганпмпв, польованих з уражених _кшщвок_
Igemu^ÎKOBam MÎKpoopraHÎ3MH Кiлькiсть бiлих мишей у rpyni, гол. Кшьюстъ бших мишей, що загинули
Абсолютне число, гол. %
Staphylococcus aureus 20 14 70
Streptococcus pyogenes 20 16 80
Streptococcus fecalis 20 16 80
Escherichia coli 20 18 90
Fusebacterium necrophorum 20 16 80
Proteus vulgaris 20 18 90
Proteus mirabilis 20 16 80
Dichelobacter (Bacteroides) nodosus 20 11 55
Klebsiella pneumoniae 20 17 85
Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes 20 16 80
Clostridium septicum 20 18 90
Clostridium oedematiens 20 18 90
Clostridium perfringens 20 16 80
188
При зараженш Staphylococcus aureus, мишi були адинамiчнi, спостер^ався пронос, фекали жовто-зеленого кольору. На розтиш виявляли явища штоксикаци. При зараженш S. pyogenes реестрували катаральний ентерит, фекали були помаранчевого кольору з шною та домiшками кровг У кишках вiдмiчали геморагiчнi та ерозивно - виразковi явища.
Clostridium perfringens фарбувались за Грамом позитивно, мали вигляд товстих паличок з круглими кшцями, були нерухома. На середовищi Кггт-Тароццi виникали помутншня та iнтенсивне газоутворення, на глюкозо -кров'яному агарi Цейслера утворювала круглi, гладкi, випуклi, сiрувато-зеленi колони, яю викликали сильний гемолiз брудно-коричневого кольору.
З метою iзоляцil чисто! культури використовували метод посiву по Вейону-Вшьялю. Iзольованi культури Clostridium perfringens на 2-4 добу розрщжували желатин, не видшяли сiрководень, молоко швидко зсiдалося, ферментували манiт.
При зараженш бших мишей iзольованими культурами клостридш ix загибель спостерiгали через 15-18 годин. У хворих помiчали кволють, вiдмовляння вiд корму, важке дихання. Через 24 години гинуло 80-90% бших мишей.
Для щентифжаци та вивчення морфолопчних властивостей F. necrophorum та D. nodosus використовували бульйон Кггт-Тароцщ, середовища Цейслера i кров'яний цукровий агар.
Для приготування кров'яного агару Цейслера до 3%-му МПА додавали 1% глюкози, встановлювали рН 7,2, розливали у флакони по 100 мл, стерилiзували при тиску 0,5 атм. На протязi 30 хв. Перед застосуванням до розплавленого i охолодженого до 450С середовища додавали 20% свiжоl дефiбринованоl кровi барана i розливали в стерильнi чашки Петрг
Для приготування кров'яного цукрового агару в 100 мл бульйону Хоттшгера розплавляли 2% агар-агару i автоклавували при 0,7 атм. На протязi 40 хв. Середовище охолоджували до 450С, пiсля чого додавали 10-15 мл свiжоl дефiбринованоl кровi барана, 10 мл 20%-го стерильного розчину глюкози i розливали в стерильш чашки Петрi.
Посiви шкубували в анаеростатi. Повiтря вiдкачували насосом Комовського протягом 40 хв i впускали вуглекислий газ. Поави шкубували протягом 3 дiб, пiсля чого !х переглядали вiзуально за допомогою лупи. При цьому звертали увагу на дрiбнi безбарвнi колони з гладкою поверхнею, рiвними округлими краями i з певною зоною гемолiзу.
При виявленнi характерних для збудниюв некробактерiозу колонiй виробляли вiдсiв на середовище Кггт-Тароцщ. Для ll приготування яловичу печшку нарiзували шматочками (2-3 г), заливали потршною кiлькiстю МПБ з рН 7,4-7,6, кип'ятили 30 мш i фiльтрували. Шматочки печшки промивали на ситi водопровiдною водою, просушували, розподiляли по пробiркаx 1 -3 шматочка в 8-9 мл МПБ. Стерилiзували при 1 атм. протягом 30 хв.
Перед поЫвом середовище Kirr-Тароцщ кип'ятили на водянш лазнi 45 хв. i швидко охолоджували для видалення кисню, що накопичився в нш.
189
ВщЫяш культури зазвичай через 24-36 годин давали задовшьний ркт на середовищi Кггт-Тароцщ.
При мжроскопи мазюв з суспензи бiоматерiалу, а також з первинних посiвiв у всiх випадках виявляли змшаш культури. Велику частину мiкробiв представляли коки та нехарактерш одиночнi палички i лише зрiдка виявлялися характерш для F. necrophoram палички та нитки.
Слщ зазначити, що не iз всiх проб бiоматерiалу удавалося видiлити F. necrophorum.
Для видшення чисто! культури F. necrophorum i вивчення И патогенних властивостей заражали бших мишей бшя кореня хвоста.
Загиблих мишей розтинали i з внутршшх органiв робили висiв на середовище Кiтт-Тароццi. Чисту культуру отримували, як правило, з кровi серця. Всього таким чином отримано 16 культур, яю були щентифжоваш як F. necrophorum. Бiологiчнi властивостi детально вивчеш у 6 штамiв.
У мазках зi свiжих культур переважали довгi, зернисто забарвленi, нитки, що перепл^аються. Деякi нитки мали кулевидш i колбоподiбнi здуття, якi знаходилися в середиш або в кшщ нитки i перевищували И товщину в 4-5 раз.
У мазках iз старих культур F. песгор^шт мала форму грамнегативних паличок завдовжки 0,7-3 мкм i шириною 0,3-0,5 мкм i коротких ниток з 4-5 паличок.
Видшеш i вивченi нами штами спор i капсул не утворювали, були нерухомi, росли лише в анаеробних умовах. По Граму фарбувалися негативно. Як правило, забарвлювалися вони нерiвномiрно, по всiй довжиш паличок зустрiчалися не пофарбованi (безбарвш) дiлянки, створюючи видимiсть зернистостi.
При вивченш культуральних властивостей видiлених штамiв на кров'яному агарi Цейсслера через 2-3 доби тсля посiву вщзначали рiст у виглядi росинок, а в подальшому колони збiльшувалися до 3 мм в дiаметрi i мали добре обкресленi форми i кра!
На середовищi Кiтт-Тароццi культури давали рют через 24-36 годин спочатку у виглядi помутнiння в нижшх шарах, а потiм всього середовища. В деяких культур реестрували газоутворення. У всiх культур через 36-48 годин вщбувалася самоаглютинацiя: шматочки печiнки покривалися сiрим нальотом. Через 7-10 доби наставало повне прояснення середовища.
При визначенш протеолiтичних властивостей культур вивчали !х здатнiсть утворювати iндол i сiрководень, розрiджувати желатин.
Наявшсть iндолу визначали шляхом заЫву випробовуваних культур на середовище Ютт-Тароцщ, iз смужками фiльтрованого паперу, просоченого гарячимо насиченим розчином щавлево! кислоти, а для визначення арководню iз смужками фiльтрувального паперу, просоченими насиченим розчином оцтовокислого свинцю. 1нкубували в термостаи при 36°3 в течш 24-36 годинника. Поява рожевого кольору вказувала на наявнiсть iндолу, а
190
почорншня кшця паперу над поверхнею середовища бшьше 3 мм вважалися позитивною реакщею на Ырководень.
Для визначення розрiдження желатину культуру, що виросла в нашврщкому середовища вносили до 20% гель желатину в пробiрках, а згортання молока - у пробiрках iз знежиреним стерильним молоком i шкубували в термостат при 36-37°3 протягом 30 дiб з щоденним облжом результатiв.
При вивченнi бiохiмiчних властивостей культури заЫвали на середовище Ютт-Тароцщ в пробiрках з 0,5% вщповщного вуглеводу або багатоатомного спирту (арабшоза, лактоза, левулеза, глюкоза, галактоза, мальтоза, сахароза, ксилоза, шулш, глiцерин, машт, сорбiт). Посiви витримували в термостат при 36-37°С протягом 20 дiб.
Всi вивченi штами утворювали шдол i сiрководень, але не розрщжували желатин i не згортали молоко. Три штами ферментували з утворенням кислоти i газу сахарозу, мальтозу, арабшозу, глюкозу i галактозу.
3 метою визначення патогенних властивостей видшеними культурами заражали 20 бших мишей в дозi 0,5 мл добово! культури, що мютить в 1 л 1 млн. мiкробiв. Майже вс вивченi культури були патогенш для бших мишей. Основна маса мишей загинула в термши вщ 6 до 10 дiб тсля зараження. Три мишi пропали на 5-у добу, 4 - на протязi 11-15 доби i 2 мишi залишилися живими.
Dichelobacter nodosus в мазках пофарбованих за Грамом була представлена грамнегативними великими, прямими та дещо зiгнутими паличками довжиною 6-8, шириною 1 мкм. Бшьшкть з них мали потовщення на кшцях, були розташованi поодиноко, рiдше по двг Таких паличок нараховували по 6-12 у полi зору мжроскопа.
Бiльшiсть культур Dichelobacter nodosus при вирощуванш на щiльних поживних середовищах утворювали два види колонiй:
- плосю, безбарвнi, дiаметром бiля 3 мм з вдавленим центром i нерiвними краями, бугристою, iнколи шероховатою поверхнею (68%);
- дрiбнi, дiаметром до 1 мм, прозорi або Ыруват з конусовидно припiднятим центром i рiвними краями, що не вростають в середовище (32%).
При культивуванш i зберiганнi культур Dichelobacter nodosus iнколи спостерiгали змiни морфологи мжробних клiтин, зявлялися грубi,здутi, шаровидш орми. Такi змiни морфологи спостер^али при тривалому вирощуваннi мiкроорганiзму в термостат при темпе5ритурi 370С, а також у старих культурах.
1зольоваш штами Dichelobacter nodosus не розщеплювали вуглеводи i багатоатомнi спирти, розрiджували стовпчик середовища, яке мютить 10% желатини, згортали молоко. Ус дослiджуванi культури D. nodosus не володiли гемолiтичною актившстю, не утворювали зони гемолiзу на середовищах з кров'ю.
191
Висновки. У виникненш та розвитку гншно-некротичного запалення дистального вiддiлу кiнцiвок KopiB значну роль вдаграе умовно-патогенна мiкрофлора, яка е патогенною для лабораторних тварин.
Л^ература
1. Балабанов В.А. Некробактериоз / В.А. Балабанов. -М.: Колос, 1971. - 136 с.
2. Джупина С.И. Некробактериоз - инфекция факторная / С.И. Джупина // Ветеринария. - 1999. - № 2. - С. 9-11.
3. Левченко В.И. Некоторые проблемы и перспективы изучения внутренних болезней высокопродуктивных коров в Украине / В.И. Левченко // Ученые записки ВГАВМ. - Витебск, 1999. - Т. 35, ч. 1. - С. 194-196.
4. Литвин В.П. Факторш хвороби сшьськогосподарських тварин / В.П. Литвин, Л.В. Олшник, Л.£. Коршенко. - К.: Аграрна наука, 2002. - 400 с.
5. Панько 1.С., Петрик М.В. Гншно-некротичш хвороби пальщв у високопродуктивних корiв // К.: Бiблiотека ветеринарно! медицини, 2007. - 63 с.
6. Панасик С.Д. Специфическая профилактика инфекционных заболеваний конечностей КРС и овец / С.Д. Панасюк, Л.Д. Кирилов, А.А. Сидорчук и др. // Сб. науч. тр. ВГНКИ - 2005 - Т. 66 - С.265-279.
Summary
Fotina T.I., doctor of veterinary sciences, professor, TiF [email protected] Ulko L.G., candidate of veterinary sciences, docent, [email protected] Sumy national agrarian university, Sumy STUDY OF KULTURAL, MORPHOLOGICAL AND PATHOGENIC PROPERTIES OF MICROORGANISMS ISOLATED FROM PYO-NECROTIC AREAS OF THE EXTREMITIES IN COWS Studyd of kultural, morphological and pathogenic properties of Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes Streptococcus fecalis Escherichia coli Fusebacterium necrophorum Proteus vulgaris Proteus mirabilis Dichelobacter (Vacteroides) nodosus Klebsiella pneumoniae Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes Clostridium septicum Clostridium oedematiens Clostridium perfringens isolated from pyo-necrotic foci of the distal extremities cows.
Стаття надшшла до редакцИ 21.09.2009
192
