CC BY
52
© КОЛОДЯЖНАЯ Т. А., ЗАЙЦЕВА О.И., ТЕРЕЩЕНКО В.П., МАНЧУК В.Т.
СТРУКТУРНО-МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ МЕМБРАН У ЗДОРОВЫХ ДЕТЕЙ РАЗЛИЧНОГО ВОЗРАСТА СРЕДНЕЙ ШИРОТЫ СИБИРИ
Т. А. Колодяжная, О.И. Зайцева, В.П. Терещенко, В.Т. Манчук Учреждение СО РАМН НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, директор - чл.-корр. РАМН В. Т. Манчук.
Резюме. Изучены структурно-функциональные свойства мембран эритроцитов, липидный спектр, физико-химические свойства и уровень жирорастворимого витамина а-токоферола у практически здоровых детей от 4-х до 12 лет жизни г. Красноярска в количестве 65 человек. Выявлены возрастные различия структуры мембран у детей от 4-х до 7 лет по сравнению с детьми 8-12 лет, свидетельствующие о напряжении антиокислительной защиты и роли свободного холестерина в стабилизации мембран эритроцитов.
Ключевые слова: эритроцитарные мембраны, липидный обмен, физикохимические свойства мембран, дети от 4-х до 12 лет.
Колодяжная Т.А. - к.б.н., сотрудник НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН; e-mail: [email protected], тел. 8(391) 2502194.
Зайцева О.И. - д.м.н., сотрудник НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН; тел. 8(391)220-08-73.
Терещенко В.П. - д.м.н., проф., сотрудник НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН; 8 (391)2201733.
Состояние здоровья подрастающего поколения составляет фундаментальную основу для формирования потенциала здоровья общества в целом, и является фактором национальной безопасности страны. Между тем, растет число детей, имеющих различные отклонения в состоянии здоровья, что свидетельствует о снижении их адаптивно-приспособительных реакций [1]. Первичным звеном адаптивно-регуляторной деятельности растущего организма ребенка являются биомембраны [2]. Строение и функционирование биомембран с возрастом ребёнка существенно изменяются. Изменения обусловлены становлением их функциональных систем [4]. Изучение вопросов особенностей метаболизма у детей и подростков на клеточно-молекулярном уровне в основном рассматривается по отношению к патологии [4,7]. Имеются отдельные работы, изучающие данную проблему [11]. Однако в них отсутствуют исследования по изучению способности эритроцитарных мембран к энергозависимому переносу кальция и уровня мембранного витамина а-токоферола, оценивающие транспортную и антиокислительную функции мембран. Эти параметры, рассматриваемые совместно с изучением фосфолипидного матрикса дают наиболее полное представление о метаболических изменениях в мембранах и являются важным аспектом в формировании адаптивных реакций ребёнка [12]. Вследствие этого, комплексное изучение липидной структуры мембран эритроцитов, их физико-химических характеристик с определением у детей и подростков уровня внутримембранного липидрастворимого витамина а-токоферола и выявлением ионно-транспортной функции эритроцитарных мембран даст наиболее полную характеристику метаболических изменений в онтогенезе, что позволит неоднозначно подходить к проведению профилактических мероприятий. Универсальной моделью для изучения состояния клеточных мембран является эритроцит [9]. Целью настоящего исследования является выявление особенностей структуры и функции
эритроцитарных мембран у детей различных возрастных групп, проживающих в средних широтах Сибири.
Материалы и методы
Были обследованы практически здоровые организованные дети от 4-х до 7 лет (30 человек) и дети от 8 до 12 лет (35 человек), проживающие в г. Красноярске. Кровь забирали из локтевой вены в утренние часы после 12часового голодания. В качестве консерванта использовали гепарин из расчета 0,1 мл на 10 мл крови. Эритроцитарные мембраны предварительно выделялись по методу J.T. Dodge [15].
В мембранах эритроцитов определяли: липидный спектр методом
тонкослойной хроматографии [10], уровень жирорастворимого витамина а-токоферола - флуориметрическим методом [13], физико-химические свойства теней эритроцитов - методом измерения флюоресценции спектров взаимодействия биомембран с зондами (пирен, 1-анилино-нафталин-8
сульфонат (АНС), хлортетрациклин гидрохлорид (ХТЦ). Данные измерения производились на спектрофлуориметре фирмы Hitachi-MPF-4 (Япония) в
кварцевой кювете 0,1 x 0,1 см, при ширине щели монохроматоров возбуждения и испускания 8 нм.
Оценивались следующие показатели физико-химического состояния эритроцитарных мембран: уровень флуоресценции триптофанилов,
микровязкость глубокого и поверхностного слоев мембран эритроцитов, степень связывания зонда АНС с поверхностным белок-липидным слоем эритроцитарных мембран, кальций аккумулирующая способность и степень оптической лабильности эритроцитарных мембран. Флуоресценцию триптофановых групп белков оценивали по свечению суспензии мембран эритроцитов при длине волны возбуждения 284 нм и длине волны флуоресценции 300 нм. Текучесть (обратная величина микровязкости) была определена с помощью зонда пирена. Рассчитывали отношение интенсивностей флюоресценции J470/J370, характеризующее микровязкость среды, окружающей зонд [5]. Микровязкость молекул поверхностного белок-
липидного поля оценивалась по величине коэффициента анизотропии зонда АНС в поляризованном свете на границе белок - поверхностные липиды. Суммарный электрический заряд поверхностного слоя мембран эритроцитов оценивался по степени связывания отрицательно заряженного зонда АНС с поверхностным слоем мембран эритроцитов в области белок-липидных контактов [5]. Показатель флуоресценции зонда АНС измерялся при длине волны испускания - 400 нм, возбуждения - 360 нм [5]. Кальций аккумулирующую способность мембран эритроцитов определяли по степени связывания двухвалентных катионов с флуоресцентным зондом хлортетрациклином (ХТЦ) [16]. Данный показатель количественно отражает аккумуляцию кальция мембранным насосом, что позволяет контролировать скорость перемещения кальция через мембрану [3].
Степень оптической лабильности эритроцитарных мембран оценивали по соотношению фоновой поляризации и деполяризации [14]. Этот показатель собственной беззондовой флуоресценценции, измеряемый с применением фильтров, поляризующих свет, регистрировался при длине волны испускания - 500 нм и длине волны возбуждения - 493 нм.
Математическую обработку полученных результатов проводили с использованием статистической программы “StatBase” Достоверность различий между группами устанавливали с использованием t-критерия Стьюдента. Анализ зависимости признаков проводился с помощью расчета и оценки значимости параметрического коэффициента линейной регрессии и корреляции.
Результаты и обсуждение
Результаты исследования, представленные в табл. 1, показали, что у здоровых детей от 4-х до 7 лет, по сравнению с детьми 8-12 лет, в мембранах эритроцитов были выявлены отчетливые возрастные изменения структурно-метаболических показателей. Они заключались в физиологически обусловленном напряжении функционирования антиокислительной системы у младших детей (4-7 лет). Это выражено в накоплении эритроцитарными
мембранами детей младшей возрастной группы деструктивных фракций лизофосфатидитлхолина (ЛФХ) (р<0,001) и свободных жирных кислот (СЖК) (р<0,001) и сравнительно пониженной концентрации а-токоферола (р<0,010) в структуре их эритроцитарных мембран. Наряду с этим повышение (в 4 раза) у данной группы детей показателя величины соотношения лизофосфатидилхолина к фосфатидилхолину (ЛФХ/ФХ) (р<0,001)
свидетельствует о более выраженной степени обновляемости фосфолипидов в их эритроцитарных мембранах и, следовательно, о повышении липидного метаболизма в строме эритроцитарных мембран у младших детей (4-7 лет). Установленные у детей 4-х -7 лет по сравнению со старшими детьми (8-12 лет) преобладание функционально активного фосфолипида ФХ по отношению к инертному сфингомиелину в 3,5 раза (р<0,001) (повышение величины коэффициента ФХ/СМ) и по отношению к
фосфатидилэтаноламину на 20,5% (р<0,001) (ФЭА) (повышение величины коэффициента ФХ/ФЭА) подтверждает выше изложенное и соответствует литературным данным.
Оценка поверхностной и глубокой архитектоники мембран эритроцитов у младших детей (4-7 лет) позволила выявить очевидные изменения в их матриксе. Так было отмечено статистически значимое (относительно детей 8-12 лет) повышение степени упорядоченности эритроцитарных мембран как в гидрофобном углеводородном (снижение показателя текучести) (р<0,010), так и в поверхностном белок-липидном слоях (повышение показателя микровязкости белок-липидного слоя мембран) (р<0,001). При этом белковый компонент (уровень триптофанилов) не имел возрастных различий. На этом фоне у младших детей (по отношению к старшим) отмечено повышение энергозависимого переноса кальция через мембрану (Р<0,050). Следует подчеркнуть, что в данном случае выявленная нами упорядоченность молекулярных структур эритроцитарных мембран не оказывает ингибирующего действия на их ферментативную функцию, в частности, ионный обмен, как это было отмечено при изучении патологических
модификаций в биомембранах [9]. Усиленный обмен кальция предполагает некоторое накопление его ионов в поверхностной области биомембран. Поверхностный кальций по всей вероятности, при отсутствии явных деструктивных изменений способствует нейтрализации отрицательных зарядов (кислых) головок фосфолипидов [12], инициируя при этом
смещение суммарного поверхностного заряда в электроположительную сторону [5]. Данный факт подтверждается повышенной (на 20%) степенью связывания отрицательно заряженного зонда АНС с поверхностным слоем эритроцитарных мембран у младших детей (4-7 лет) по сравнению с детьми 8-12 лет (р<0,001).
При исследовании уровня неферментативного антиокислителя мембранного липидрастворимого витамина а-токоферола установлено, что его концентрация у младших детей (4-7 лет) на 11% ниже, чем у старших детей (8-12 лет) (р<0,010). Выявленная обратно направленная
корреляционная взаимосвязь а-токоферола с показателем величины оптической лабильности, отражающей степень их структурной дезорганизации (г = - 0,41, р<0,050), свидетельствует о его стабилизирующих действиях по отношению к эритроцитарным мембранам у младших детей. При этом величина показателя оптической лабильности у этих детей остается достаточно высокой и повышена на 26% (по отношению к детям 8-12 лет) (р<0,001). Вследствие этого необходимым дополнительным звеном антиоксидантной системы у младших детей (4-7 лет), по всей видимости, является мембраносвязанный восстановленный свободный холестерин (СХС). Методом парных корреляционных взаимосвязей нами получены неоспоримые доказательства, подтверждающие литературные данные о его антиокислительных функциях в эритроцитарных мембранах у младших детей (4-7 лет) [8].
Установлены умеренные прямые корреляционные связи СХС с показателями фосфолипидов: ФХ (г= 0,40, р<0,050), ФЭА (г= 0,40, р<0,050), СМ (г= 0,40, р<0,050), свидетельствующие об участии СХС в сохранении
этих важных для эритроцитарной мембраны фосфолипидов. Следует подчеркнуть, что с так называемыми деструктивными показателями (ЛФХ/ФХ, СЖК) свободный мембранный холестерин имел обратно направленную сопряженность: с величиной соотношения ЛФХ/ФХ ( г= -
0,49, Р<0,010), с уровнем СЖК (г= - 0,50, р<0,010). Наряду с этим, стабилизационные свойства свободного мембранного холестерина у младших детей (4-7 лет) подтверждаются обратной корреляционной взаимозависимостью уровня СХС с показателем оптической лабильности их эритроцитарных мембран (г= - 0,65, р<0,001).
Выявленные возрастные особенности структурно-метаболической организации эритроцитарных мембран у здоровых детей, обусловлены особенностями их метаболизма, соответствующего уровню функционального развития ребёнка. Они заключаются в создании условий у детей младшей возрастной группы для функциональной активности биомембран за счет повышения метаболически активных и одновременно устойчивых к окислению фосфолипидов ФХ, величины коэффициента ЛФХ/ФХ, скорости переноса энергозависимого кальция через мембрану, смещения заряженности биомембран в сторону электроположительности. В этой связи включение в антиоксидантную защиту холестерина наряду с липидрастворимым мембранным витамином а-токоферолом является дополнительным существенным звеном в сохранении структуры и функции биомембран у младших детей. У здорового ребенка обеспечиваются прочность структуры клеточной мембраны, повышение упорядоченности молекулярных групп, как в области поверхностно расположенных, так и углеводородных участков фосфолипидов.
Биомембраны у детей в период препубертата на фоне снижения их функциональной активности (липидов и транспортных функций) постепенно становятся жидкостными как в области поверхностно расположенных функционально активных молекулярных групп (переносчиков метаболитов, рецепторных субъединиц, ферментных групп), так и в области
углеводородных участков фосфолипидов. Это в совокупности обеспечивает достаточную активность названных функционирующих элементов мембраны и обеспечивает ионно-транспортную функцию биомембран.
Таблица І
Сравнительные данные показателей, отражающих возрастные отличия в структуре и функциях эритроцитарных мембран у здоровых детей, проживающих в средней широте Сибири (M ± т)
Параметры Показатели эритроцитарных мембран в возрастных группах, лет
4-7 8-12
Свободный холестерин, ммол/л 4,190±0,186 4,725±0,103 P<0,05
Свободные жирные кислоты, ммоль/л 0,828±0,139 0,258±0,023 P<0,001
Лизофосфатидилхолин, ммоль/л 0,060±0,008 0,011±0,001 P<0,001
Сфингомиелин, ммоль/л 0,108±0,070 0,272±0,012 P<0,001
Фосфатидилхолин, ммоль/л 1,211±0,049 0,933±0,024 P<0,001
ФХ/ФЭА, отн.ед. 2,095±0,126 1,666±0,060 P<0,001
ФХ/СМ 12,503±1,064 3,556±0,114 P<0,001
А-токоферол, мкмоль/л 10,257±0,353 11,530±0,293 P<0,010
Триптофанилы, мг% 0,328±0,015 0,346±0,011
Текучесть мембран, отн.ед. 0,470±0,026 0,552±0,015 P<0,010
Микровязкость белок-липидного слоя мембран, отн.ед. 0,465±0,011 0,411±0,007 P<0,001
Степень связывания зонда АНС с поверхностным слоем мембран, фл.ед. 45,303±2,503 36,015±0,722 P<0,001
Кальций аккумулирующая способность мембран, отн.ед. 5,053±0,867 3,101±0,363 P<0,050
Показатель оптической лабильности мембран, отн.ед. 9,371±0,572 6,937±0,161 P<0,001
Литература
1. Баранов А.А., Щеплягина Л.А., Ильин А.Г., Кучма В.Р. Состояние здоровья детей как фактор национальной безопасности // Российский педиатрический журнал. - 2005.- № 2. - С. 4-8.
2. Бичкаева Ф. А., Бойко Е. Р., Власова О. С., Жилина Л. П. Физиологические особенности липидного, углеводного и белкового обменов у жителей южных районной Архангельской области // Экология человека. -2006. - №3. - С. 7-11.
3. Болдырев А. А. Введение в биохимию мембран. - М.: Высшая школа, 1986. - 109 с.
4. Вельтищев Ю.Е., Ермолаев М.В., Ананенко А.А., Князев Ю.А. Обмен веществ у детей. - М.: Медицина, 1983. - 461 с.
5. Владимиров Ю.А. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран, - М.: Наука, 1980. - 320 с.
6. Данилова Р.И. Физиологические особенности липидного обмена у жителей Европейского Севера СССР: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М., 1986. - 16 с.
7. Караченцева Н.В. Возрастная динамика клинических
проявлений и липидов плазматических мембран клеток периферической крови при атопическом дерматите у детей. Автореф. дис. ... канд. мед. наук.
- Красноярск, 2004. - 24 с.
8. Крылов В.И., Вельтищев Ю.Е., Петрушина А.Д., Чимаров В.М. Липидный обмен у детей. Красноярск: Красн. Университет, 1985. -128 с.
9. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е. А. Физиология и патофизиология эритроцита. - Томск: изд-во Том. ун-та, 2004. - 202 с.
10. Ростовцев В.Н. Резник Г.Е. Количественное определение липидных фракций плазмы крови // Лабораторное дело. - 1982. - № 4. - С. 26-29.
11. В.П. Терещенко, Зайцева О.И., Колодяжная Т.А., Яворская Н.В. Характеристика липидной структуры мембран эритроцитов у детей Сибири //
Вопросы профилактической медицины в регионах крайнего Севера: Сб. тезисов Четвертой Республиканской научно-практической конференции, Надым, 13-14 сентября 2006. - Надым, 2006. - С. 161-162
12. Ченцов, Ю. С. Введение в клеточную биологию . - М.: ИКЦ Академ. кн., - 2004. - 486 с.
13. Черняускене Р.Ч. Варнекявичене З.З., Грибаускас П.С. Одновременное флуориметрическое определение концентрации витаминов Е и А в сыворотке крови // Лабораторное дело. - 1984. - № 6. - С. 362-365.
14. Якубова Р.Р., Мурин А.В. Способ оценки дестабилизации мембран эритроцитов // Лабораторное дело. - 1990. - № 5. - С. 26-29.
15. Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan D.J. The preparation and chemical characteristics if hemoglobin - free chosts of human erythrocytes // Acrh. Biochem and Biophis. - 1963. - Vol. 100, № 1. - P. 119-130.
16. Nigel Gains. The limitations of clorotetracycline as a fluorescent probe of divalent cations associated with membranes // Biochem. - 1980. -111.
- P. 199-202.
