CC BY
23
УДК 616.9.022.083.31.078.23
Маслянко Р. П., д.б.н., професор;
Левкчвськнй Д. М. к.вет.н., доцент;
Сторчак Ю.Г., астрант © Лъв\всъкий нацюналънийутеерситет еетеринарногмедицини та бютехнологт ¡мет С.З. Гжицъкого
СТАН НЕЙТРОФ1Л1В КРОВ1 ТА МОЖЛИВОСТ1 НСТ-ТЕСТУ
У ВИЗНАЧЕНН1 ПАТОЛОГ11 НОВОНАРОДЖЕНИХ ТВАРИН
На тдстав1 анал1зу лтературних даних показан/ нов/ можливост1 застосування НСТ-тесту в д1агностыц1 захворюванъ / стану оргашзму новонароджених. Наведет особлывост1 проведения та резулътат1в, ям одержуютъ пор1вняно з дорослымы оргашзмамы. Проанал1зоваш зм1ны вм1сту субпопуляцт нейтрофшв, що визначаютъся за допомогою НСТ-тесту, а також юнетичт параметры процесу.
Ключов1 слова: нейтрофыи, субпопуляцп, активтстъ, НСТ-тест.
Для визначення р1вня неспециф1чно! резистентносп оргашзму тварин \ людини широко використовують реакцш вщновлення нейтрофшами та шшими фагоцитами кров1 штросинього тетразолш (НСТ-тест) [8, 12, 13, 16]. Однак, у вщношенш до самих нейтрофшв д1агностичш можливост1 НСТ-тесту ще далеко не вичерпаш. Це пов'язано передуам з наявшстю функцюнально! неоднорщност1 нейтрофшьних лейкоцит1в [1-6, 19, 24]. Кл1тини одше! субпопуляци - нейтрофши-кшери (Нк) - потенщйш фагоцити, складають маргшальний пул, \ !х часка (близько 60%) мае менш проникш для НСТ мембрани, активно взаемодшть з субстратом, продукують за необхщност1 активш форми кисню (АФК), внаслщок чого шактивуються, стають рН- \ Ка -, К -залежними та можуть пщдаватися апоптозу. Нейтрофши шшо! популяцп (Не) поглинають чужорщш частинки, мабуть, з метою доставки 1х до компетентних оргашв, входять до циркуляцп (приблизно 40%), володшть бшьш проникними мембранами, не взаемодшть з субстратом, менш активно продукують АФК, функцюнують незалежно вщ рН та вмкту в середовищ1 Ка+ та К+ в широких межах очевидно, не залучаються в апоптоз. Отже, при р1зних станах поведшки Не \ Нк ¿стотно вщр1зняються [1], що проявляеться в тому числ1 в НСТ-тест1 [2-7].
Практично проведения НСТ-тесту дае можливють пщраховувати не лише частку так званих активних нейтрофшв (ДАН), але й кшькють (процентне стввщношення частки) Не \ Нк. У перших ¿з них - вщкладання диформазану заповнюють кл1тину не бшьше шж наполовину. Друп - Нк - або мютять поодиною вкрапления диформазану, або не мають його зовам (Нк0), або заповнеш диформазаном практично повшетю (Нка). Однак, представлена ситуащя в1рна лише у випадку, коли умови проведения НСТ-тесту дотримаш
© Маслянко Р. П., Левшвський Д. М., Сторчак Ю.Г., 2013
150
таким чином, що активуються yci Не i частина Нк. Як правило, Не можуть активуватися спонтанно, тод1 як для активаци Нк потр1бна стимулящя. У випадку дорослих i новонароджених, при тому що сшввщношення м1ж популящями нейтрофшв у них не р1зняться, умови, в яких активуються yci Не, виявляються р1зними [14].
KpiM врахування сшввщношення м1ж субпопуляцшми нейтрофшв ще один важливий аспект розширення д1агностичних можливостей НСТ-тесту полягае в дослщженш юнетики процесу вщновлення нейтрофшами HCT [1-6]. При цьому пщ час проведения реакци i3 реакцшно! cyMimi з певною перюдичшетю вщбираються проби, в яких, як звичайно, пщраховуеться частка кл1тин з р!зним ступенем вщкладеного диформазану. Залежшсть ДАН чи Не або Нка вщ часу обробляються згщно з реакщями, описаними в роботах [3, 7].
За даними [9. 10, 14, 15], HOBi можливост1 застосування НСТ-тесту в плат розширення можливостей диференщально! д1агностики деяких сташв i захворювань новонароджених.
Вщомо, що д1агностичн1 критер11 НСТ-тесту при його класному проведенн1, як у випадку спонтанного, так i стимульованого вар1анту, добре визначен1 для дорослих. Що стосуеться орган1зм1в неонатального пер1оду, то в цьому питанш немае едино! думки [11, 21, 22, 26]. Основш причини протир1ч обговорен! в робот1 [14] i зумовлен1 умовами визначення НСТ-тесту (часом, що пройшов в1д забору кров1 до початку реакцй' та концентращею гепарину та HCT). При цьому виявлеш ¿стотн! особливост1 активацй' нейтрофшв новонароджених пор1вняно з дорослими: спонтанна актившеть нейтроф1л1в у перших мае той же порядок, що i стимульована активн1сть в останн1х [12, 13] (ДАН 30% i бшьше). В1дпов1дно, швидк1сть спонтанно! реакц1! вщновлення HCT нейтроф1л1в новонароджених призводить до нормальних значень ДАН порядку 90% i б1льше, що дозволяе застосовувати цей вар1ант НСТ-тесту в д1агностищ лише виражених патолог1й, коли актившеть непрофшьно! ланки ¿мун1тету сильно пригшчена. Однак, в так1й ситуацй' для новонароджених спонтанний НСТ-тест навряд чи виявиться менш ¿нформативним, н1ж стимульований. За такими причинами проведения стимульованого НСТ-тесту стосовно новонароджених в д1агностищ будь-яко! патолог1! буде, CKopim за все, недоцшьним.
Умови проведения спонтанного НСТ-тесту у новонароджених, при яких ДАН не дуже велика i активуються Не, наведен! в роботах [14, 15]. Як виявилося, i в цьому ж випадку результата (наприклад, ДАН) залежать принаймн1 ще вщ двох фактор1в: маси тша i в1ку новонароджених, при чому мають м1сце важлив1 р1зниц1 м1ж значениями показник1в у доношених i недоношених д1тей i тварин. У доношених новонароджених ДАН збшьшуеться в nepmi 7 д1б життя, а вщтак поступово знижуеться, що узгоджуеться з результатами ¿нших автор1в [17]. При цьому вщм1чалася кореляц1я, але не м1ж ДАН i вком, як можна було оч1кувати, а м1ж масою т1ла i ДАН (0,72, р<0,01) про що вказують також iHmi автори [18, 23, 25].
У недоношених д1тей залежшеть ДАН в1д часу життя аналопчна, однак значения показника завжди менше, н1ж у доношених д1тей, що вщповщае
151
лп-ературним даним [20], i корелящя м1ж ДАН i масою тша (г=0,2, р<0,5). 3 врахуванням сказаного, для пщвищення д1агностично! значимости НСТ-тест доцшьно проводити, суворо дотримуючись зв'язку з в1ком новонароджених, наприклад, вщразу теля народження (1-й день життя) i/або в юнщ перинатального перюду (7-й день життя).
У багатьох роботах [10, 14, 15], де новонароджет д1ти були обстежеш, починаючи з першого дня теля народження з р1зним термшом гестацп та з наявшетю бактер1ально! шфекци, були встановлеш достов1рт р1знищ (р<0,05) за показниками Нк1 або Нка м1ж здоровими та хворими пневмошею та ентерокол1том. Анал1з Bcix отриманих даних у сукупност1 дозволяе виявити icTOTHi р1знищ та тенденцп. Так, збшьшення ДАН у хворих д1тей з р1зною бактер1альною шфекщею пор1вняно з клмчно здоровими (контролем), як правило, забезпечуеться зростанням серед нейтрофшв частки кл1тин (Не) i вщповщно, зниженням частки Нк. Отже, в ситуащях, як1 вимагають посилення неспециф1чних фактор1в ¿мунного захисту, нейтрофши, що здшенюють лжвщацш патогенного чинника in situ (Нк), виявляються малоефективним i вони замщаються нейтрофшами, здатними доставити патогенних збудниюв до компетентних оргатв (Не). KpiM цього, при 3Mim частки нейтрофшв-кшер1в (Нк) частка активних кл1тин (Нка) серед них змшюеться незаконом1рно: з ростом числа Нк кшьккть Нка може як збшьшуватись, так i зменшуватись, i навпаки. TaKi взаемозв'язки, очевидно, зумовлеш специфжою то! чи шшо! хвороби, а з'ясування причин спрямованост1 змш показниюв вимагае предметних дослщжень у кожному конкретному випадку.
Що стосуеться дослщжень кшетики НСТ-тесту, то розрахунок параметр1в пор1внянь дозволяе отримати додатков1 характеристики вщносно активност1 нейтрофшв у цьому процесс Збшьшення констант швидкостей вщновлення НСТ (наприклад, к0 чи к1) вказуе на бшьш високу метабол1чну актившеть нейтрофшв по вщношенню до продукци АФК [3-7]. Навпаки, зменшення цих показниюв евщчить про зниження швидкост1 продукци АФК нейтрофшами. При цьому, привертае увагу тиск нтозами CTi змш показниюв: збшьшення значения Нка вщповщае зменшенню к1 i, навпаки, зниження величин Нка супроводжуеться збшьшенням к1. Така зворотна взаемозалежшеть пояснюеться тим, що зменшення швидкост1 продукци АФК yciMa нейтрофшами компенсуеться ростом числа активних нейтрофшв-кшер1в (Нка). Навпаки, зниження ix частки серед нейтрофшв компенсуеться ростом швидкост1 продукци АФК yciMa нейтрофшами. У зв'язку з виявленою законом1ршстю виникае питания про необхщшеть дослщження кшетики вщновлення НСТ нейтрофшами. Вщповщь на це питания - безумовно позитивна: враховуючи низью значения Нка (поодиною кл1тини на 100 нейтрофшв), к1 - виявляеться бшьш надшною характеристикою стану одшею i3 ланок неспециф1чно! резистентност1 оргашзму новонароджених. Як показник в багатьох дослщженнях, погр1шност1 визначення Нка i к1 ктотно вщр1зняються. В першому випадку вщносна norpimmcTb ([ш1/ш]х100%) може досягти 50% i бшьше, тод1 як в другому випадку вона, як правило, складае близько 100%.
152
KpiM цього, при наявносп шших патологш також може виникати ситуащя, коли дослщження юнетики процесу вщновлення НСТ виявиться необхщним засобом постановки диференщального д1агнозу.
Таким чином, кшькюне визначення вмкту серед нейтрофшв кл1тин двох субпопуляцш - нейтрофшв (Не) i нейтрофшв-кшер1в (Нк), а також числа серед останшх активних нейтрофшв, i швидкост1 процесу вщновлення НСТ суттево пщвищуе д1агностичш можливост1 НСТ-тесту.
Л1тература
1. Герасимов И.Г. Оптимизация условий определения холинэстеразы / И.Г. Герасимов // Клин. Лаб. Диагностика.- 2004.- №5. - С. 35-38.
2. Герасимов И.Г. Функциональная неоднородность нейтрофилов/И.Г. Герасимов //Клин. Лаб. Диагностика.- 2006.- №2.- С. 34-36.
3. Герасимов И.Г. Функциональная неравнозначность нейтрофилов крови человека: генерация активных форм человека / И.Г. Герасимов, Д.Ю. Игнатов // Цитология.-2001.- №5.- с. 432-436.
4. Герасимов И.Г. Особенности активации нейтрофилов in vitro / И.Г. Герасимов, Д.И. Игнатов // Цитология.- 2004.- №2.- С.155-158.
5. Герасимов И.Г. Свертывание крови активирует нейтрофилы к респираторному взрыву / И.Г. Герасимов, Д.Ю. Игнатов // Бюлл. Экспер. Биол. И медицины.- 2005.- №7.- С. 88-90.
6. Герасимов И.Г. Особенности восстановления нитросинего тетрозолия нейтрофилами человека / И.Г. Герасимов, Д.Ю. Игнатов, М.А. Котельницкий // Цитология.- 2005.- №6.- С. 549-553.
7. Кишкун А. А. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике / А.А. Кишкун // М.- 2006.- 536 с.
8. Клименко Т.М. Тест восстановления нейтрофилами нитросинего тетразолия в диагностике некротизирующего энтероколита у недоношенных новорожденных /Т.М.Клименко // Здоровье ребенка.- 2008.- №3.- С. 104-107.
9. Линчевский Г.Л. Диагностическая значимость реактивности лейкоцитов крови при бактериальной инфекции у новорожденных / Г.Л. Линчевский, О.В. Воробьева // Перинатология и педиатрия.-2008.- №3. - С.17-20.
10. Маслянко Р.П. Функцюнальна активнють нейтрофАлАв у здорових телят раннього в1ку / Р.П. Маслянко, О.М. Даньк1в // Вкник аграрно! науки.-2002.- №8.- С. 67-72.
11. Маслянко Р.П. Нейтрофшьш гранулоцити, структура i функцп / Р.П. Маслянко, Р.Й. Кравщв // Б1олог1я тварин. - 2003.- в.5.- №1-2.- С. 52-58.
12. Маслянко Р.П. Функцюнальна активнють нейтрофшьних гранулоцит1в у протшнфекцшному захист1 тварин / Р.П. Маслянко, Ю.Р. Кравщв // Наук.в1сник ЛНАВМ таБТ.-2007.- т.9 (33).- С. 185-193.
13. Миллер И. Иммунитет человеческого плода и новорожденного / И. Миллер // Прага.-1983.- 186 с.
14. Никулин Б.А. Оценка и корреляция иммунного статуса / Б.А. Никулин // М.- 2007.- 376 с.
153
15. Татарченко В.В. Тест восстановления нейтрофилами нитросинего тетразолия в диагностике бактериальной инфекции новорожденных / В.В. Татарченко, Г.А. Линчевский // Клин. Лаб. Диагност. -2008.- №4.- С. 12-14.
16. Татарченко В.В. Особенности спонтанного НСТ-теста у новорожденных / В.В. Татарченко, Д.Ю. Игнатов // Лаб. Диагностика.- 2007.- т. 20.-С. 57-59.
17. Abuharfeil N. The effect of sodium nitrite on some parameters of the immune system / N. Abuharfeil, E. Sarnur // Food Chem. Tasi cal.- v.39.- P. 119-124.
18. Anderson D.C. Complement levels and leukocyte phagocytosis in newborn babies / D.C. Anderson, L.K. Pickering, R.D. Feigin // J. Pediatr.- 1974.-v.85.- P. 420-425.
19. Arinola O.G. Complement levels and leukocyte phagocytosis in neworn babies / O.G. Arinola, K.A. Obisesan // Afr. J. Med. Sci.- 2003.- v.32.- P. 401-404.
20. Clement L.T. Identificant on of neutrophyl subpopulation with monoclonal antibodies / L.T. Clement, J.F. Lehmeger//Blood.-1983.-v.61.-P.326-332.
21. Drohous V. Impact of prematurity, stress and sepsis on the neutrophyl respiratory burst in term and preterm neonates without signs of infection and in those with increased levels of C-reactive protein/V. Drohous//Biol.Neonate.-1997.-v. 72.-P.2001-2009.
22. Gessler P. Neutrophil respiratory burst in term and neonates without signs of infection and in those with increase levels of reactive protein / P. Gessler, T. Nebeh // Pediatr. Res. -1996.-v.95.- P.843-848.
23. Katamoto H. Nitroblue tetrazolium reduction of neutrophyls in heat stressed goats is not influenced by vitamin E infection/ H. Katamoto, H. Hukuda // J. Vet. Med. Sci.- 1998.- v.60.- P.1243-1249.
24. Metha R. Intrapartum magnesium sulfate oxposare attenuates neutrophyl function in preterm neonates / R. Metha, A. Petrova // Biol. Neonate.- 2006.- v.89.-P.99-103.
25. Tenner A.J. Stimulatio of a human polynuclear leukocytes oxidative response by tine C Ig subunit of the first complement / A.J. Tenner, N.R. Cool // J. Immunol.- 1982.- v.128.- P.2547-2552.
26. Wu Y.C. Detection of defective granulocyte function with flow cytometry in newborn infants / Y.C. Wu, Y.R. Huang, C.H. Ling // Microbiol. Immunol. Infect. -2005.- v.38.- P. 17-24.
27. Zhu X.D. Non-mieloperoxidase-mediated system activity of тиск нтоз in newborn infants / X.D. Zhu, T.X. Chen, R.X. Ji // Zhonghua. Er. Ke. Za. Zhi.-2003.- v.41.- P.286-289.
Summary
On the basis of the analysis of literature data new possibilities of the NBT-test in diagnostics of diseases and conditions of newborn are shown. Features of carrying out and results received thus in compare son to adults are specified. Changes in the maintenance of subpopulations neutrophyls, defined by means of the NBT-test, and also kinetic parameters of process are analyzed.
Рецензент - к.б.н., доцент Турко 1.Б.
154
