Сроки выведения остаточных количеств празиквантела и ивермектина из организма поросят, обработанных монизеном

Русаков С.В.

Биохимия, биотехнология и диагностика

УДК 619:615.015.4

СРОКИ ВЫВЕДЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПРАЗИКВАНТЕЛА И ИВЕРМЕКТИНА ИЗ ОРГАНИЗМА ПОРОСЯТ, ОБРАБОТАННЫХ МОНИЗЕНОМ

С.В. РУСАКОВ кандидат биолгических наук

Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, Россия, 123002, Москва, Звенигородское шоссе, д. 5, e-mail: [email protected]

Методом хроматографии на жидкостном хроматографе высокого давления установлены сроки выведения остаточных количеств празиквантела и ивермек-тина из организма поросят, обработанных монизеном. Сроки ожидания составили 28 суток.

Ключевые слова: ивермектин, празиквантел, хроматография, поросята.

О широком распространении гельминтозов свиней на территории России и стран СНГ имеются многочисленные сообщения отечественных и зарубежных исследований. В настоящее время проблема борьбы с гельминтозами свиней остается актуальной, хотя и предложено много препаратов [1-3].

Особого внимания заслуживает новый комплексный препарат монизен («Научно-внедренческий центр Агроветзащита»), в состав которого входят ивермектин и празиквантел. Препарат активен против нематод, цестод, возбудителей оводовых болезней и т. д.

Целью наших исследований было изучение фармакокинетики и остаточных количеств монизена в крови, молоке и органах сельскохозяйственных животных.

Материалы и методы

Исследования по выявлению остаточных количеств монизена проводили на 10 поросятах, из которых сформировали 3 опытные группы (по 3 поросенка в группе). Поросятам опытных групп препарат задавали однократно перо-рально в дозе 1 мл/15 кг массы животного. Одно животное служило контролем и препарат не получало.

За сутки до опыта и через 10, 20 и 28 сут после применения препарата от каждого поросенка при убое брали пробы органов и тканей (печени, почек, мышечной ткани, сердца, селезенки, легких и жира) массой 20 г и помещали в этикетированные пластиковые пакеты.

Определение празиквантела в органах и тканях заключается в хромато-графировании на жидкостном хроматографе высокого давления с использованием обращеннофазовой колонки экстрактов органов и тканей, полученных после мацерации и твердофазной экстракции празиквантела при помощи SPE-картриджей, и обработки полученных данных с помощью программы «Мультихром».

2 г предварительно измельченных образцов печени, почек, мышц, сердца, селезенки, легких и жира гомогенизировали в течение 1 мин, после чего к пробам добавляли по 1 см3 0,2 Н гидроокиси натрия и по 5 см3 0,025 М фос-

фатного буфера с рН = 5,0. Полученные смеси наносили на предварительно активированные картриджи OASIS SPE 60 mg (активация: последовательное промывание в 4 см метанола, 4 см3 воды, 4 см3 0,025 М фосфатного буфера с рН = 5,0 со скоростью ~ 2 капли/мин). Картриджи с нанесенными пробами последовательно промывали в 4 см3 0,025 М фосфатного буфера с рН = 5,0 и 2 см3 5%-ного водного раствора метанола, после чего просушивали под током азота в течение 10 мин. Сорбированные на картриджах пробы элюировали в 4 см3 смеси этилацетата/диэтилового эфира (в соотношении 70 : 30) в кругло-донные колбы вместимостью 50 см3 для последующего упаривания на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Полученные сухие остатки растворяли в 0,9 см3 ацетона, переносили в пробирки Эппендорфа и также упаривали досуха под током азота. Сухие остатки растворяли в 1 см3 элюента для последующего анализа полученных экстрактов методом жидкостной хроматографии высокого давления.

Определение ивермектина в органах и тканях поросят основано на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуорометрическим детектированием после экстракции из анализируемых проб органов и тканей свиней этилацетатом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, превращения ивер-мектина во флуорогенное производное и последующей очистки на патронах для твердофазной экстракции Varían Bond Elut® С18.

Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки. Для определения уровня извлечения ивермектина из печени, почек, мышц, сердца, легких, селезенки и жира свиней в гомогенаты образцов массой 4 г, полученных от контрольных животных, внесли по 1 см3 стандартного калибровочного раствора ивермектина с концентрацией 40 нг/см3.

К пробам гомогенизированных образцов (по 4 г печени, почек, мышц, сердца, легких, селезенки и ^жира), помещенных в колбы вместимостью 250 см , приливали по 100 см этилацетата, тщательно перемешивали путем встряхивания, выдерживали на ультразвуковой бане в течение 5 мин, помещали на встряхиватель на 30 мин, дополнительно выдерживали на ультразвуковой бане 5 мин и снова помещали на встряхиватель на 30 мин.

Надосадочные жидкости переносили в круглодонные колбы вместимостью 250 см , фильтруя их через тампоны из стекловаты, помещенные в конусные химические воронки (после фильтрации тампоны промывали дополнительно в 10 см3 этилацетата). Растворители упаривали на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °С. Сухие остатки растворяли в 10 см3 ацетонитрила, переносили в пробирки с герметичными пробками вместимостью 50 см3, добавляли 20 см3 гексана, интенсивно встряхивали в течение 1 мин. После полного разделения фаз (расслаивания эмульсии) верхние гексановые слои отбрасывали. В пробирки добавляли новые порции гексана объемом 20 см3, вновь интенсивно встряхивали в течение 1 мин. После полного разделения фаз фракции гексана также отбрасывали, а нижние аце-тонитрильные слои сливали в круглодонные колбы и упаривали досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °С. Сухие остатки растворяли в 30 см3 смеси «ацетонитрил-вода» (1 : 1), помещая на ультразвуковую баню на 1 мин. Растворы переносили в делительные воронки вместимостью 250 см3, добавляли по 10 см3 насыщенного раствора хлористого натрия, 70 см3 гексана и интенсивно встряхивали воронки в течение 1 мин. Верхние органические слои собирали в круглодонные колбы вместимостью 250 см3. Водно-ацетонитрильные фазы вновь переносили в делительные воронки и повторяли операцию экстракции, используя 70 см3 гексана.

Объединенные органические фазы упаривали досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °С. Сухие остатки растворяли в 1 см3 ацетонитрила и подвергали дериватизации.

Результаты и обсуждение Для определения процента извлечения празиквантела при пробоподго-товке органов и тканей свиней в приготовленные образцы от контрольного поросенка, искусственно внесли стандартные растворы празиквантела из расчета 2500 нг/г биосубстрата (табл. 1).

1. Результаты анализа образцов

Биосубстрат с празиквантелом Площадь пика стандарта празиквантела, mV*s Площадь пика празиквантела в экстракте, mV*s Извлечение, %

Селезенка 38,086 71,25

Легкие 36,578 68,43

Печень 42,528 79,56

Почки 53,454 43,907 82,14

Мышцы 40,139 75,09

Сердце 41,486 77,61

Жир 46,168 86,37

Предел (порог) определения празиквантела в стандартном растворе равен 100 нг/см3. На основании этой величины и с учетом процента извлечения по методу Eckschlag, Danzer (1994) были рассчитаны пороги определения для органов и тканей. Пределы определения празиквантела по биосубстратам приведены в таблице 2.

2. Пределы определения празиквантела по биосубстратам

Орган, ткань

Порог определения, нг/г

Селезенка Легкие Печень Почки Мышцы Сердце Жир

70,175 73,067 62,845 60,871 66,586 64,424 57,890

Площадь пиков ивермектина рассчитывали при помощи компьютерной программы «БигосЬгоше». Предел (порог) определения флуорогенного производного ивермектина в стандартном растворе равен 2 нг/см . Пороги определения ивермектина для проб органов и тканей приведены в таблице 3.

3. Расчетные пороги оп] ределения ивермектина в органах и тканях

Орган, ткань Порог определения, нг/г

Печень 2,27

Почки 2,38

Мышцы 2,34

Сердце 2,29

Легкие 2,24

Селезенка 2,43

Жир 2,41

Таким образом установлено, что остаточные количества празиквантела и ивермектина депонируются, в основном, в жировой ткани, печени и почках (табл. 4, 5).

Период выведения остаточных количеств празиквантела и ивермектина из организма свиней после применения монизена в терапевтической дозе составляет 28 сут.

4. Результаты определения содержания празиквантела в органах и тканях свиней

Орган, ткань

Показатель

Сроки отбора проб, сут

10

1

2

3

20

4

5

6

7

28

8

9

Печень