CC BY
39
Лечение и профилактика
УДК 619:616.995.1-085
СРОКИ ВЫВЕДЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЕНБЕНДАЗО-ЛА ИЗ ОРГАНИЗМА КАБАНОВ ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ ВИГИСОЛА
С.В. РУСАКОВ кандидат биологических наук Н.Б. ЕМЕЛЬЯНОВА соискатель И.А. АРХИПОВ доктор ветеринарных наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии
имени К.И. Скрябина, 117218, г. Москва, ул. Б. Черемушкинская, д. 28, тел./факс 8-499-124-56-55, [email protected]
Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием изучены сроки выведения фенбендазола и его метаболита из организма кабанов после дегельминтизации вигисолом. Максимальная концентрация фенбендазола и его метаболита сульфоксида в органах и тканях кабанов находится в течение 3 сут после дачи вигисола. Фенбендазол полностью выводится из организма кабанов через 7 сут после лечения.
Ключевые слова: кабаны, нематоды, жидкостная хроматография, фенбендазол, остаточные количества.
В предыдущие годы была разработана лекарственная форма фенбендазола - вигисол для дегельминтизации кабанов при гельминтозах [1]. Препарат показал высокую эффективность при аскаридозе, метастронгилезе, эзофа-гостомозе и макраканторинхозе кабанов в условиях охотоведческих хозяйств. Однако для дальнейшего внедрения препарата в практику необходимы знания сроков выведения фенбендазола и его метаболита из организма кабанов с целью установления срока убоя и использования мяса после лечения кабанов. Для определения остаточных количеств фенбендазла и его метаболита -оксфендазола в органах и тканях животных используют в основном метод жидкостной хроматографии высокого давления с ультрафиолетовым детектированием [2-5].
Целью нашей работы явилось изучение сроков выведения остаточных количеств фенбендазола и его метаболита - оксфендазола из организма кабанов после обработки их вигисолом.
Материалы и методы
Изучение сроков выведения фенбендазола из организма кабанов провели на 12 головах в возрасте 9-13 мес. Вигисол - лекарственную форму фенбендазола задавали кабанам с кормом (овсом) однократно перорально в дозе 20 мг/кг по ДВ из расчета 100 г вигисола на 50 кг массы тела кабанов. Животных по 3 головы убивали через 1, 3, 5 и 7 сут после дачи препарата. Для исследований на содержание фенбендазола и его метаболита - оксфендазола после убоя кабанов брали кусочки печени, почек, мышечной и жировой ткани (околопочечной), легких, селезенки, сердца, а также кровь. До исследования пробы органов и тканей хранили в холодильнике при температуре - 20 оС.
104
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
Определение фенбендазола и его метаболита - оксфендазола в органах и тканях кабанов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием. За основу взяли широко используемые методики экстракции и очистки проб [4, 5]. Параметры хроматографирования были подобраны в процессе работы с учетом особенностей имеющегося хроматографа, хроматографической колонки и реактивов.
Принцип метода основан на хроматографировании с использованием жидкостного хроматографа высокого давления с ультрафиолетовым детектором, обращеннофазовой колонки и программы «Мультихром» (версия 1.52) достаточного анализа количества экстрактов, полученных после экстракции этилацетатом проб сыворотки крови, печени, почек, сердца, легких, селезенки, мышечной ткани, жировой ткани, очистки экстрактов в системе «ацетонитрил-гексан» и концентрирования очищенных экстрактов.
Для работы использовали необходимое оборудование, посуду и реактивы:
- стандарт фенбендазола с активностью 99,8 % («Jangsu Jabang Group»);
- стандарт оксфендазола с активностью 95,4 % («Jangsu Jabang Group»);
- жидкостной хроматограф высокого давления Hewlett Pacard 1090 A с УФ-детектором;
- хроматографическая обращеннофазовая колонка LUNA C18 (250 х 4,6 мм) с диаметром сорбента 5 мкм;
- весы лабораторные, ГОСТ 24104;
- рН-метр Hanna рН 213;
- вакуумный ротационный испаритель IKA RV 06 ML 1-B;
- центрифуга лабораторная ОПН-3;
- ультразвуковая ванна Branson B 8510 DTH;
- встряхиватель Elmi (Шейкер S-3.01);
- посуда мерная, лабораторная стеклянная, ГОСТ 1770;
- углекислый аммоний двузамещенный А 9516 («Sigma»);
- Водный раствор аммиака 30 % 22,122-8 («Sigma-Aldrich»);
- Этилацетат х.ч., ГОСТ 22300-76 («Борис-Авогадро»);
- ацетонитрил, ч.д.а., ТУ 6-09-5497 («Криохром»);
- гексан, ч., ТУ 6-09-337578 («Мосреактив»).
Предварительно проводили подготовку оборудования к работе и готовили раствор элюента.
0,05 М раствор углекислого аммония (4,8045 г /100 мл воды) смешивали с ацетонитрилом в соотношении 65 : 35 и фильтровали через бумажный фильтр непосредственно перед использованием. Затем проводили подготовку хроматографа к анализу. Для ввода хроматографической системы в рабочий режим колонку LUNA C (250-4,6 мм) промывали элюентом в количестве 15 свободных объемов колонки при скорости протекания элюента 0,3 см3/мин. После окончательного уравновешивания колонки устанавливали УФ-волну анализа на 290 нм. После этого определяли хроматографические параметры стандартных образцов фенбендазола и оксфендазола и готовили растворы стандартных образцов фенбендазола и оксфендазола для построения калибровочного графика. На аналитических весах взвешивали по 10,0 мг (точные навески с учетом активности) фенбендазола и оксфендазола, навески переносили в общую мерную колбу объемом 100 см3, добавляли 50 см3 элюента и тщательно перемешивали до полного растворения. Затем объем раствора доводили водой до метки. Полученная концентрация исходного раствора составила 100 мкг/см3 по каждому из компонентов. Из исходного раствора методом последовательных разведений готовили стандартные растворы с концентрацией 10; 5; 2,5 и 1 мкг/см3 по фенбендазолу и оксфендазолу.
Затем определяли оптимальные хроматографические параметры, которые составили:
105
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
- обращеннофазовая хроматографическая колонка LUNA С 18 (250 х 4,6 мм) с диаметром сорбента 5 мкм;
- элюент: ацетонитрил/0,05 М раствор углекислого аммония в соотношениях 35 : 65;
- скорость протекания элюента - 0,5 см3/мин;
- давление - 18,4 МПа;
- объем вводимой пробы - 50 мл;
- спектр УФ-волны - 290 нм.
В последующем готовили пробы к анализу. В образцы (сыворотки крови, печени, почек, сердце, легких, селезенки, мышечной ткани, жировой ткани) массой 1 г (сыворотки крови 1 мл) добавляли 10 см3 физиологического раствора и гомогенизировали в течение 3-5 мин при 5000 об./мин. Полученный гомогенат количественно переносили в делительную воронку и помещали в резервуар с льдом. В охлажденный гомогенат вносили 2 г бромида калия и титровали рН до 8-9 при помощи 25%-ного водного аммиака, после чего пробу тщательно перемешивали. Далее, к гомогенату добавляли 10 см3 этилацетата, пробу экстрагировали при постоянном перемешивании в течение 1
ч. Для разделения слоев полученную эмульсию центрифугировали в течение 5 мин при 5000 об./мин. Экстракцию каждой пробы этилацетатом с последующим центрифугированием проводили трехкратно. После центрифугирования слой этилацетата переносили в круглодонную колбу для последующего выпаривания. Объединенные этилацетатные экстракты упаривали досуха на ротационном испарителе при температуре +40 оС. Полученный после упаривания сухой остаток растворяли в 10 см3 ацетонитрила при одновременной обработке ультразвуком. Ацетонитрильный раствор переносили в пробирку объемом 25 см3 и промывали 3-5-кратно порциями по 8 см3 гексана. Гексановые фракции отбрасывали, а ацетонитрильную фракцию, промытую гексаном, переносили в круглодонную колбу объемом 50 см3 и упаривали досуха на ротационном испарителе при температуре +50 оС. Сухой остаток растворяли в 0,5 см3 элюента при одновременной обработке ультразвуком для последующего анализа методом жидкостной хроматографии высокого давления.
Для проведения качественного и количественного анализа полученных экстрактов применяли процедуру градуировки хроматографических данных в компьютерной программе «Мультихром vs 1.52».
Для построения графика корреляции пика и концентрации использовали ряд стандартных разведений фенбендазола и оксфендазола 10; 5; 2,5 и 1 мкг/см3, приготовленных по схеме, приведенной выше.
Результаты и обсуждение
Результаты, полученные при определении корреляции «площадь пи-ка/концентрация» представлены в таблице 1.
Таблица 1
Зависимость площади пика от концентрации
Площадь пика фенбендазола, mV х s Концентрация стандартного раствора фен-бендазола, мкг/см3 Площадь пика оксфендазола, mV х s Концентрация стандартного раствора оксфендазола, мкг/см3
902,011 10 827,903 10
415,208 5 388,412 5
224,653 2,5 203,146 2,5
89,785 1 78,235 1
106
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
Уравнения, полученные для линий тренда фенбендазола и оксфендазола, и в частности, величины достоверности аппроксимации (R2), приближенные к единице, свидетельствуют о высокой степени линейной зависимости площади пика от концентраций компонентов, и следовательно, о высокой достоверности получаемых результатов.
Содержание фенбендазола и оксфендазола (Y) в экстрактах рассчитывали по уравнению калибровки, полученному с помощью программы «Мультихром vs 1.52». Полученные значения корректировали с учетом уровня извлечения фенбендазола и оксфендазола из сыворотки крови, печени, почек, сердца, легких, селезенки, мышечной ткани, жировой ткани, а также коэффициента концентрирования проб.
Определение уровня извлечения фенбендазола и оксфендазола проводили на контрольных пробах. В сыворотку крови объемом см3, а также гомогенаты проб органов и тканей массой 5 г внесли по 1 см3 стандартного раствора фенбендазола и оксфендазола с концентрацией 5 мкг/см3. После внесения стандартных растворов пробы тщательно перемешивали. Пробоподготовку проводили по отработанной методике. Объем конечных экстрактов модельных проб составлял 1 см3 (табл. 2, 3).
Таблица 2
Определение уровня извлечения фенбендазола
Концентрация фенбендазола, мкг/см3 Площадь пика стандарта фенбендазола, mV х s Проба Площадь пика фенбендазола в пробе, mV х s Уровень извлечения, Кэ
Сыворотка 325,184 0,78
Печень 377,035 0,91
Почки 348,004 0,84
Мышцы 306,481 0,74
5 415,208 Сердце 311,033 0,75
Легкие 385,216 0,93
Жировая 367,248 0,88
ткань
Селезенка 320,142 0,77
Таблица 2
Определение уровня извлечения оксфендазола
Концентрация оксфендазола, мкг/см3 Площадь пика стандарта оксфендазола, mV х s Проба Площадь пика оксфендазола в пробе, mV х s Уровень извлечения, Кэ
Сыворотка 304,277 0,78
Печень 346,144 0,89
Почки 341,820 0,88
Мышцы 326,158 0,84
5 388,412 Сердце 320,903 0,83
Легкие 340,652 0,88
Жировая 300,854 0,77
ткань
Селезенка 338,279 0,87
Пределы детектирования фенбендазола и оксфендазола в экстрактах определяли хроматографированием модельных проб с внесенными стандартными образцами различной концентрации. В результате получили следую-
107
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
щие значения пределов детектирования фенбендазола и оксфендазола в экстрактах (табл. 4).
Таблица 4
Показатели пределов детектирования фенбендазола и оксфендазола в экстрактах тканей
Экстракт ткани Лимит детектирования, нг/г
фенбендазол оксфендазол
Сыворотка крови 10 нг/см3 15 нг/см3
Печень 10 10
Почки 10 10
Мышцы 10 10
Сердце 15 15
Легкие 15 15
Жир 10 10
Селезенка 20 15
При помощи процедуры градуировки, выполненной в соответствующем разделе компьютерной программы «Мультихром vs 1.52», определили относительные коэффициенты отклика детектора для анализируемых экстрактов и получили следующие формулы расчета концентраций фенбендазола и оксфендазола в экстрактах (табл. 5).
Таблица 5
Формулы расчета концентраций фенбендазола и оксфендазола в экстрактах тканей
Экстракт ткани Формула
фенбендазол оксфендазол
Сыворотка крови Y=0,0684573 х Х Y=0,0515566 х Х
Печень Y=0,0677122 х Х Y=0,0612401 х Х
Почки Y=0,0692222 х Х Y=0,0546498 х Х
Мышцы Y=0,0612250 х Х Y=0,0532932 х Х
Сердце Y=0,0579928 х Х Y=0,0621300 х Х
Легкие Y=0,0620158 х Х Y=0,0645628 х Х
Жир Y=0,0617087 х Х Y=0,0637852 х Х
Селезенка Y=0,0565277 х Х Y=0,0543179 х Х
Результаты, полученные при анализе экстрактов сыворотки крови, органов и тканей кабанов, представлены в таблицах 6 и 7.
Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее активный в антипаразитарном отношении метаболит фенбендазола - фенбендазол сульфоксид (оксфендазол) создает достаточно высокие концентрации в тканях печени и почек через 3 сут после окончания обработки.
Фенбендазол присутствует в органах и тканях, в основном, в начальные сроки (1-3 сут после обработки) в меньших количествах по сравнению с метаболитом.
Период полного выведения остаточных количеств фенбендазола, фен-бендазола сульфаксида из органов и тканей кабанов составляет 7 сут после окончания обработки.
108
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
Таблица 6
Содержание остаточных количеств оксфендазола в организме кабанов после обработки вигисолом
Орган, ткань Номер жи- Сроки отбора проб, сутки
нг/г вотного 1 3 5 7
Сыворотка 1 467,329 285,491 Но. Но.
крови, нг/см3 2 395,580 220,316 Но. Но.
3 492,645 247,085 Но. Но.
1 130,205 493,451 51,006 Но.
Печень 2 178,293 550,264 38,245 Но.
3 154,387 576,123 43,201 Но.
1 189,566 348,557 36,614 Но.
Почки 2 103,712 420,384 28,517 Но.
3 190,175 343,565 40,623 Но.
1 55,490 86,004 Но. Но.
Мышцы 2 46,752 83,278 18,329 Но.
3 53,051 78,602 Но. Но.
1 51,613 96,827 25,453 Но.
Сердце 2 48,247 85,481 32,005 Но.
3 54,802 99,022 Но. Но.
1 70,460 96,801 Но. Но.
Легкие 2 57,349 74,928 18,045 Но.
3 64,008 78,559 21,342 Но.
1 Н.о.* 67,635 21,425 Но.
Жир 2 Но. 48,824 26,068 Но.
3 Но. 52,116 25,504 Но.
1 38,412 135,279 26,391 Но.
Селезенка 2 30,499 127,530 31,465 Но.
3 33,534 131,469 22,176 Но.
* Н.о. - не обнаружено (концентрация ниже предела детектирования LOD).
Таблица 7
Содержание остаточных количеств фенбендазола в организме кабанов после обработки вигисолом
Орган, ткань, Номер жи- Сроки отбора проб, сутки
нг/г вотного 1 3 5 7
Сыворотка 1 265,015 56,382 Но. Но.
крови, нг/см3 2 238,416 54,361 Но. Но.
3 270,527 43,211 Но. Но.
1 480,419 172,036 Но. Но.
Печень 2 453,600 153,520 Но. Но.
3 491,730 160,275 Но. Но.
1 415,160 129,483 Но. Но.
Почки 2 393,424 116,231 Но. Но.
3 380,534 123,045 Но. Но.
1 38,037 46,544 Но. Но.
Мышцы 2 29,562 59,813 Но. Но.
3 34,011 65,747 Но. Но.
1 45,389 63,970 Но. Но.
Сердце 2 51,307 57,206 Но. Но.
3 48,628 69,013 Н.о. Н.о.
109
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
1 20,592 44,732 Но. Но.
Легкие 2 27,823 39,530 Но. Но.
3 34,258 35,258 Но. Но.
1 Но* 25,089 Но. Но.
Жир 2 Но. 31,425 Но. Но.
3 Но. 28,047 Но. Но.
1 48,625 34,825 Но. Но.
Селезенка 2 52,396 27,068 Но. Но.
3 42,000 21,260 Но. Но.
* Н.О. - не обнаружено (концентрация ниже предела детектирования LOD).
Литература
1. Архипов И.А., Архипова А.И., Кошеваров Н.И. // Рос. паразитол. журнал. - 2008. - № 1. - С. 82-92.
2. Ожигина С.Ф., Новик Т.С. // Бюл. Всес. ин-та гельминтол. - 1991. -Вып. 55. - С. 116-117.
3. Русаков С.В., Диденко П.П., Зуев Д.В. // Тр. Всерос. ин-та гельминтол. - 2006.- Т. 42. - С. 280-285.
4. DelatourP. // Vet. Res. Commun. - 1983. - V. 7, № 1. - P. 125-131.
5. Marriner S., Bogan J. // Vet. Parasitol. - 1980. - V. 108, № 1. - P. 177179.
The term of excreting of residual quantities of fenbendazole from body of wild-boar after treatment by vigisol
S.V. Rusakov, N.B. Emeljanova, I.A. Arkhipov
The term of excreting of residual quantities of fenbendazole and it’s metabolite oxfendazole from body of wild-boar after treatment by vigisol is investigated. The residual quantities of fenbendazole is definited by liquid chromatography a high pressure with UF-detection. Highest concentration of fenbendazole and oxfendazole in organs and tissues of wild-boar were during 3 days after treatment by vigisol. The drug excreted completely from the body of animals during 7 days after treatment.
Keywords: wild-boars, nematodes, liquid chromatography, fenbendazole, the residual quantities.
110
Российский паразитологический журнал, 2009, № 3
