CC BY
113
УДК 577.21;577.29;621.37
А. Р. Каюмов, М. И. Богачев, Е. О. Михайлова
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВЫХ ТОКСИНОВ ВОДНЫХ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Ключевые слова: токсины, факторы патогенности, анализ структуры, интервальные статистики, байесовские
статистики.
Проведен сравнительный статистический анализ первичной структуры токсинов белковой природы водных грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Идентифицированы аминокислоты, характеризуемые неслучайным распределением в последовательности полипептида, а также формирующие функциональный домен токсина.
Key words: toxins, factor ofpathogenesis, analysis of structure, return interval statistics, Bayessian statistics.
The comparative statistical analysis ofprimary structure ofprotein toxins from gram-positive and gram-negative microorganisms is performed. Amino acids exhibiting non-casual distribution in the polypeptide sequence are identified, their role in protein secondary structure and the toxins functional domain formation are discussed.
Токсины, биологически активные вещества, оказывающие токсическое действие на живые клетки, обнаружены на сегодняшний день практически у всех живых организмов. В ходе эволюции они были приобретены как средство борьбы за экологическую нишу между конкурирующими видами и оказывают влияние на важнейшие жизненные процессы, такие как синтез белка, клеточной мембраны, трансдукция сигнала, транспорт веществ и многие другие [1]. Токсины являются одними из основных факторов патогенности болезнетворных бактерий. Развиваясь в организме человека, патогенные микроорганизмы продуцируют экзотоксины (секретируемые живой клеткой) и эндотоксины (выделяющиеся после гибели клетки). В настоящее время различают следующие типы токсинов по механизму действия на клетки макроорганизма: 1-й тип — мембранотоксины (гемолизины, лейкоцидины); 2-й тип — функциональные блокаторы, или нейротоксины (тета-носпазмин, ботулинический токсин); 3й тип — энтеротоксины — активизируют клеточную аденилатциклазу, что приводит к нарушению энтеросорбции и развитию диарейного синдрома; 4-й тип — цитотоксины — токсины, блокирующие синтез белка на субклеточном уровне [2]. Многие бактерии образуют сразу несколько токсинов, относящихся к разным функциональным группам [3]. Токсины микроорганизмов из отдаленных родов и даже семейств, занимающих различные экологические ниши и вызывающие разнообразные по своему проявлению инфекционные заболевания, оказались весьма сходными по механизму действия и по критическим для проявления токсичности структурам (например, шигатоксин, коклюшный и холерный токсины) [2].
Целью данной работы был анализ структуры токсинов водных патогенных микроорганизмов с целью выявления общих структурных элементов для разработки методов их идентификации и детоксикации в установках систем водоснабжения и водоотведения [4].
Для составления выборок токсинов использовали базу данных факторов патогенности (http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm). Для проведения структурного анализа формировали выборки токсинов белковой природы грамотрицательных и грамположительных бактерий (таблица 1). Дополнительно были сформированы выборки токсинов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, классифицированных по характеру их мишеней в клетке на мембранотоксины, энтеротоксины и цитотоксины.
В качестве инструмента анализа были использованы методы выравнивания аминокислотных последовательностей BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) [4] и ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw) [5], осуществляющие поиск и идентификацию идентичных
последовательностей в структуре биомолекулы. Данные о высоком сходстве механизма действия на клетки человека токсинов различных бактерий [2] позволили выдвинуть гипотезу о наличии в них консервативных доменов, ответственных за проявление биологического эффекта на мишени. Анализ с помощью алгоритма BLAST первичных последовательностей токсинов, указанных в таблице 1, не позволил выявить их взаимной гомологии внутри класса. Однако множественное выравнивание аминокислотных последовательностей дало возможность идентифицировать некоторые консервативные домены, характерные для различных функциональных групп (табл. 2).
Таблица 1 - Классификация анализируемых бактериальных токсинов по механизму действия на клетки человека [2]
Функциональные группы токсинов Объем выборки токсинов грамотрицательных бактерий (Bordetella, Vibrio, Escherichia, Haemophilus, Helicobacter, Legionella, Neisseria, Salmonella, Shigella, Yersinia) Объем выборки токсинов грамположительных бактерий (Corynebacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, Listeria, Enterococcus)
Токсины белковой 411 532
природы
Мембранотоксины 29 130
Энтеротоксины 24 134
Цитотоксины 25 24
Таблица 2 - Консервативные аминокислотные последовательности,
идентифицированные в белковых токсинах
Функциональные группы токсинов Аминокислотные домены токсинов грамм отрицательных бактерий Аминокислотные домены токсинов грамм положительных бактерий
Мембранотоксины (гемолизины) Энтеротоксины Цитотоксины -P/TLE/H K-S-R -I/VR- -A/LD/Q -TL- MxK- -LIL- LxxKKS D/ExLxALxxxG
В результате множественного выравнивания с помощью алгоритма С1ш1а^ были выявлены консервативные треонин и лейцин в аминокислотных последовательностях гемолизинов грамположительных бактерий (таблица 2). Это согласуется с ранее полученными данными, что для проявления активности порообразующих мембранотоксинов грамположительных бактерий необходимы всего две аминокислоты - треонин и лейцин, расположенные в латеральной части третьей Т-петли белковой глобулы токсина и участвующие в распознавании холестерина клеточной мембраны [6]. Однако, как показал проведенный анализ, лейцин и треонин участвуют в формировании консервативного мотива также для этой группы белков грамотрицательных организмов. По всей видимости, данный мотив необходим для проявления биологического эффекта и характерен для всех белков данной группы [6].
Для другой группы белков - энтеротоксинов, также были идентифицированы консервативные аминокислотные остатки. Большинство этих белков образуется в виде неактивных предшественников, которые затем подвергаются аутопроцессингу благодаря наличию в них домена цистеиновой протеиназы [7]. Обнаруженные в токсинах грамотрицательных бактерий лизин, серин и аргинин соответствуют ключевым аминокислотам, участвующим в формировании функционального домена холерного энтеротоксина [8]. Для цитотоксинов в настоящее время не описаны консервативные участки. Однако наличие большого числа консервативных гидрофобных, незаряженных аминокислот в консервативном участке (таблица 2) позволяет предположить наличие функциональных доменов, характерных для этой группы соединений.
Кроме классического метода выравнивания последовательностей на основе байесовских статистик, для выявления вклада отдельных аминокислот в структуру молекул токсинов был использован альтернативный подход на основе интервальных статистик [10]. На основе анализа отклонения распределения интервалов между одинаковыми аминокислотами от экспоненциального распределения, характеризующего пуассоновский поток, он позволяет идентифицировать наличие статистической зависимости взаимного расположения аминокислот. Если во взаимном расположении отдельных аминокислот нет выраженной статистической зависимости, то при наличии достаточной статистики распределение интервалов между аминокислотами одного типа характеризуется экспоненциально убывающей плотностью вероятности Р(г}~ег. Напротив, плотность вероятности, убывающая медленнее экспоненциальной, свидетельствует о наличии статистической связи между расположением отдельных аминокислот данного типа. Из-за малой длины белковой молекулы вместо оценки плотности вероятности Р(г} удобно использовать оценку функции
1
между отдельными аминокислотами в белках часто может быть удовлетворительно аппроксимирована растянутой экспоненциальной функцией С(г) ~ ехр(-Лг/эф [9]. Путем несложных алгебраических преобразований можно показать, что в этом случае плотности вероятности может быть удовлетворительно аппроксимирована растянутым гамма-
распределением Р(г)~г¥эф ехр(-ЛгЛ'эф) [10]. Из последнего выражения видно, что при у ^ 1
плотность вероятности вырождается в экспоненциальную P ( г ) ~ e-г, что свидетельствует об отсутствии выраженной статистической взаимосвязи между расположением данных аминокислот. Напротив, значение у ^ 1 свидетельствует о выраженной статистической взаимосвязи между расположением данных аминокислот, причем чем меньше значение параметра у, тем данная взаимосвязь является более выраженной [11].
На рис. 1 приведены результаты эмпирической оценки усредненной функции С (г ) для общего пула токсинов грамотрицательных (а) и грамположительных (б) бактерий. Штриховыми линиями даны теоретические кривые - растянутые экспоненты С(г)~е-г? для значений у = 1,0.8,0.7,0.6,0.5е0.4. Данная аппроксимация ранее широко применялась для последовательностей с линейной статистической взаимосвязью положения отдельных элементов, характеризующейся степенным убыванием автокорреляционной функции (также нередко называемых в литературе монофрактальными последовательностями). В верхнем углу перечислены аминокислоты, для которых у < 0.8.
Далее, выборки бактериальных токсинов были классифицированы по мишеням (табл. 1) и проведен их сравнительный анализ (рис. 2). Полученные результаты позволили установить значимые различия в качественном составе аминокислот с растянутыми распределениями для токсинов одного класса у грамотрицательных и грамположительных бактерий. Так, для мембранотоксинов грамотрицательных бактерий характерно широкое
распределение интервалов для глицина, пролина и триптофана (рис. 2 а), тогда как для белков грамположительных бактерий - для глутамина, аспарагина и аспарагиновой кислоты (рис. 2 б). Энтеротоксины характеризуются неслучайным распределением лизина и треонина у грамотрицательных микроорганизмов (рис. 2 в), глицина, цистеина, гистидина, триптофана и тирозина у грамположительных (рисунок 2 г). Свойства статистической взаимозависимости в структуре аминокислотных последовательностей цитотоксинов грамотрицательных бактерий
Рис. 1 - Функции распределения интервалов между аминокислотными остатками общего пула белковых токсинов грамотрицательных (а) и грамположительных (б) бактерий
Таким образом, в результате анализа аминокислотных последовательностей бактериальных токсинов, были идентифицированы различия в их первичной структуре. Классическое выравнивание последовательностей на основе байесовского подхода позволило выявить функциональные домены токсинов, характеризующиеся общностью строения для белков всей группы. Однако, при таком подходе характеризуется лишь отдельный участок биомолекулы из нескольких аминокислот и не учитывается стороннее их окружение, а также первичная структура всего полипептида. Для решения этой задачи был применен метод интервальных статистик, анализирующий взаимное расположение мономеров всего биополимера.
Примечательно, что аминокислоты, характеризующиеся широким распределением интервалов в первичной структуре белка, не входят в состав идентифицированных консервативных доменов (табл. 2). На сегодняшний день остаются неясными функциональная роль и эволюционное значение наличия в молекуле белка аминокислот с растянутым экспоненциальным распределением, тогда как остальные аминокислоты имеют случайное распределение и согласуются с моделью пуассоновского потока. Вероятно, эти компоненты имеют большее значение в формировании вторичной и третичной структуры белковой глобулы, нежели в ее функциональной активности, о чем свидетельствует выделение в эту группу цистеина и гидрофобных аминокислот - лейцина, изолейцина, триптофана. Результаты анализов также показали существенную разницу в значимых аминокислотах одной функциональной группы токсинов из грамотрицательных и грамположительных бактерий.
Этот факт коррелирует с особенностями строения секреторного аппарата этих групп микроорганизмов, и позволяет утверждать, что данный подход может быть успешно использован для анализа функциональной организации белковых систем.
G—G ay а) D D Asp
Р Р йо N N Asn
W—W Тгр Q Q Gin
о
и
о
& л ч "
к\\
\ V4
r/R
л \
I У і____к.
r/R
Рис. 2 - Функции распределения интервалов между аминокислотными остатками общего пула белковых мембранотоксинов (а), энтеротоксинов (в) и цитотоксинов (д) грамотрицательных бактерий, а также мембранотоксинов (б), энтеротоксинов (г) и цитотоксинов (е) грамположительных бактерий
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках
ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы"
(государственный контракт № П2151 от 05.11.2009).
Литература
1. Fabbri, A. Bacterial protein toxins: current and potential clinical use / A. Fabbri [and others] // Curr Med Chem., -2008. -V.15. -P.1116-1125.
2. Finlay, B.B. Common themes in microbial pathogenicity / B.B. Finlay and S. Falkow // Micr Mol Biol Rev. -1997. -V.61. -P.136-169.
3. Zientz, E. Metabolic interdependence of obligate intracellular Bacteria and their insect hosts / E. Zientz, T. Dandekar, R. Gross // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2004. -V. 68. -P.745-770.
4. Храмова, И.А. Разработка лабораторных мембранных модулей для исследования очистки сточных вод / И.А. Храмова [и др.] // Вестник Казанского технологического университета. - 2010. - № 1. -С. 273-279.
5. Altschul, S.F. Basic local alignment search tool / S. F. Altschul [and others] // J. Mol. Biol. -1990. -V.215. -P.403-410.
6. Chenna, R. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs / R. Chenna [and others] // Nucleic Acids Res -2003. -V.31. -P.3497-3500.
7. Farrand, A.J. Only two amino acids are essential for cytolytic toxin recognition of cholesterol at the membrane surface / A. J. Farrand [and others] // Proc Natl Acad Sci U S A. -2010. -V.107. -P.4341-4346.
8. Reineke, J. Autocatalytic cleavage of Clostridium difficile toxin B / J. Reineke [and others] // Nature. -2007. -V.446. -P.415-419.
9. Lupardus, P.J. Small molecule-induced allosteric activation of the Vibrio cholerae RTX Cysteine Protease Domain / P. J. Lupardus [and others] // Science. -2008. -V.322. -P.265-268.
10.Богачев, М.И. Анализ структуры сигналов и функциональной организации биокаталитических систем с использованием математического аппарата интервальных статистик / М.И.Богачев, А.Р.Каюмов, Е.О.Михайлова // Известия ВУЗов России - Радиоэлектроника. -2010. -№3. -С. 8-16.
11.Богачев, М.И. Сравнительный анализ первичной структуры белков патогенных и непатогенных микроорганизмов при помощи математического аппарата интервальных статистик / М.И.Богачев, А.Р.Каюмов // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. -2010.-№ 11. С. 3-11.
12.Bogachev, M.I. Effects of multifractality on the statistics of return intervals / M.I.Bogachev, J.F.Eichner, A.Bunde // European Journal of Physics - Special Topics. -2008. -V.161. -P.181-193.
© А. Р. Каюмов - канд. биол. наук, ст. преп. каф. водоснабжения и водоотведения КГАСУ, [email protected]; М. И. Богачев - старший научный сотрудник каф. биотехнических систем СПбГЭТУ «ЛЭТИ», [email protected]; Е. О. Михайлова - канд. биол. наук, ст. преп. КГТУ, [email protected].
