CC BY
181
эпиднадзор России, 1996. — 80'с. - 37. Правила сбора, хранения й утилизации отходов ЛПУ. Санитарные правила и нормы. СанПин ¡2.1.7.728-99. - М.: Минздрав России, 1999. -9с.-38. Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору за холерой. Санитарно-эпидемические правила. СП 3.1.1086-02. - 39. Профилактика, чумы. Санитарно-эпидемиологические правила. СП 3.1.7.1380-03. - 40. Распоряжение Правительства Российской Федерации от 06.11.04 № 1421-р. - 41. Санитарная охрана территории Российской Федерации. Санитарно-эпидемиологические правила. СП 3.4.1328-03..- 42. Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств. СанПиН, утв. на XVII заседании Совета по сотруд. в обл. здрав. СНГ. -Душанбе, 2005 г. - 43. Stavsky Е.А., Johnson В., Hawley R.J. et al. Comparative Analysis of Biosafety Guidelines of the USA, WHO, and Russia (Organizational and Controlling, Medical and Sanitary-epidemiological aspects) //.; Applied Biosafety. -2003,-Vol. 8, N3.-P. 118-127..
G.G Onischenko, I.G.Drozdov, T.A.Maliukova, M.N.Lyapin, M.V.Pchelintseva, V.E.Bezsmertny, S.D.Krivulya, Yu.M.Feodorov, , S.V.Netesov, V.V.Kutyrev
Standardization as an Element of the System Guaranteeing Security to Professionals Working , . with Biologic Agents Pathogenicity Groups I and II
i Federal Service of Consumers'Rights and Human Welfare Protection;
' Rospotrebnadzor Plague Control Center, Moscow; Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov; Stale Research Center of Virology and.Biotechnology "Vector", Koltsovo .
The situation is, viewed as concerns standardization of the, rules and conditions to regulate the activities associated with the use of I—II groups pathogenic biologic agents (PBA) in the Russian Federation. Individual tasks, have been fixed and the ways to their perfection appointed. •
, . • ■ Поступила 17.10.05.
УДК 576.8
С.П.Заднова, Ю.В Лозовский МЕХАНИЗМЫ СЕКРЕЦИИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
В обзоре рассмотрены пять систем секреции, присутствующие у патогенных грамотрицательных бактерий, с. помощью которых происходит транспорт белков на поверхность бактериальной клеткиили внутрь клеток хозяина. У многих микроорганизмов гены, кодирующие секретируемые белки и систему секреции, расположены на островах патогенности, что указывает на их важную роль в патогенности. При повреждении секреторных систем бактерии становятся авирулентными.
Как известно, секретируемые белки необходимы для жизнедеятельности патогенных и непатогенных бактерий, так как они участвуют в метаболизме клетки, построении клеточной оболочки, жгутика, пилей, выполняют защитную функцию, взаимодействуют с системами макроорганизма и т.д. В грамположительньлх бактериях внеклеточные и поверхностные белки транспортируются по «генеральному секреторному пути» или GSP (от англ. general secretory pathway) с использованием sec системы непосредственно во внешнюю среду. Наличие внешней мембраны у грамотрицательных микроорганизмов привело в процессе эволюции к формированию различных по структуре и функциям системам секреции [8]. Некоторые исследователи даже выделяют в особую группу системы транспорта, участвующие в переносе белков только через внешнюю мембрану [31].
Термин «секреция» обозначает активный транспорт белков из цитоплазмы, где они синтезируются во внешнюю среду через цитоплазматическую и внешнюю мембраны. У грамотрицательных бактерий секреция белков на поверхность клеток или внутрь клеток хозяина осуществляется с использованием пяти основных типов секреторных механизмов. Первый тип (I) или ATP-binding cassette (ABC, по классификации транспортных систем (transporter classification) обозначается как ТС #3.А. 1); II тип, включающий генеральный секреторный путь (Sec, ТС #З.А.5) и «главную терминальную ветвь» (от англ. main terminal branch) (МТВ,-ТС #З.А.15); III
тип секреторной системы (от англ. type three secretion systems - TTSSs), связанный с системой экспорта субъединицы (Fla) жгутика (ТС #З.А.6); IV тип секреции (TFSSs), включающий систему конъ-югативного переноса плазмид, иногда объединяют с V типом секреции (ТС #З.А.7). Для транспорта белков по II, IV и V типам секреции необходима sec система, тогда как для I и III механизмов секреции данная система не требуется. Первый тип секреции, Fla-система и TFSSs присутствуют как у грамотрицательных, так и у грамположительных бактерий, а III тип и МТВ система только у грамотрицательных' [11, 31, 36]. У многих микроорганизмов гены, кодирующие систему секреции, расположены на островах патогенности, чаще всего с островами патогенности ассоциированы гены Ш-го и IV-го типа секреции [18].
Первый тип секреции впервые описан и хорошо изучен у уропатогенной Escherichia coli (UPEC) при продукции а-гемолизина. Лейкотоксин Pasteurelia haemolytica, протеаза Pseudomonas aeruginosa, аде-нилат циклаза Bordetella pertussis также транспортируются через данный путь [3, 11, 18]. По первому типу секретируются в основном ферменты, которые не подвергаются аминотерминальному, процессингу, т.е. протеолитическому расщеплению и сигналом для секреции является набор из 60 аминокислот внутри карбонатной области секретируемых белков. Гены, кодирующие аппарат секреции I типа, и гены секретируемых белков расположены на хромосоме рядом, образуя кластер [18]. Рассмотрим систему
секреций I типа, в которой присутствует три основных белка, на примере продукции а-гемолизина (рис. 1). Во внешней мембране из белка-порина TolC с молекулярной массой 53,9 kDa формируется канал или пора [2]. Белок TolC идеально подходит для формирования пор, имеет кристаллическую структуру и образует скрученный ß-цилиндрический домен во внешней мембране и а-спиральный домен в периплазме [23]. В цитоплазматической мембране располагается белок (HlyB), выполняющий несколько функций. Во-первых, участвует в гидролизе АТФ, т.е. выполняет функцию АТФ-азы, обеспечивая процесс транспорта энергией. Во-вторых, образуя пору, способствует прохождению белков через цитоплазматическую мембрану. Третий белок (HlyD), имея вытянутую форму, участвует в соединении внешней и внутренней мембран. Данный белок связан с белком HlyB, расположенным в цитоплазматической мембране, и с TolC во внешней мембране (рис. 1).
Третий тип секреции присутствует у представителей рода Yersinia, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, P. aeruginosa, энтеропатогенных (ЕРЕС) и энтерогеморрагических (EHEC) E. coli, хламидиях, патогенов растений и т.д. [7, 16]. Как и в I типе секреции, белки, секретируемые по III типу, не подвергаются аминотерминальному процессингу, и сигналом для секреции служит последовательность из 15-20 аминокислот внутри аминотерминальной области секретируемых белков [21]. Третий тип секреции включает более 20 белков, в основном локализованных в цитоплазматической мембране [18]. Для данного типа характерно присутствие в цитоплазме небольших белков, выполняющих функцию шаперонов, которые индивидуальны для каждого секретируемого белка.
Гены, кодирующие белки III типа секреции, гомологичные у разных микроорганизмов, расположены кластером у некоторых патогенов на плаз-
‘Туро !
Type 11 •
Type III.,
PP ГійуО >.
№:
YscD.F і YuR і : .
v.<c-u
U»P. • ;ІШЩ
Рис. 1. Схематическое изображение I типа секреции при продукции а-гемолизина Е. coli, II типа при экспрессии фермента пулланазы Klebsiella oxytoca,
III типа при секреции Yop белков Yersinia [21]:
ОМ - внешняя мембрана; РР - периплазматическое пространство;
IM - цитоплазматическая мембрана; СР - цитоплазма;
N - аминотерминальный домен белка; С - карбоксильный домен. Белки HlyB, SecA,,YscN являются АТФ-азами. SecB, Syc -шапероны (в III секреторной системе индивидуальны для каждого секретируемого белка). Во П типе - периплазматическая препелин пептидаза LspA отщепляет аминотерминальную последовательность от секретируемого белка после транспорта через цитоплазматическую мембрану ,
миде (Yersinia, Shigella) или на хромосоме, часто в составе островов патогенности. Большинство этих островов патогенности наряду с генами секреторного аппарата содержат гены секретируемых, вспомогательных белков, а также гены, кодирующие регуляторные белки. Некоторые патогены имеют две системы III типа. Например, у Y. enterocolitica гены секреторного аппарата расположены на хромосоме и на плазмиде. У сальмонелл на острове патогенности SPI-1 расположены гены, кодирующие белки, необходимые для первого этапа - преодоления слизистого барьера кишечника, а на SPI-2 присутствуют гены, кодирующие белки, участвующие в последующем развитии инфекции и выживании внутри макрофагов (18). Необходимо отметить, что и в хромосоме У. pestis обнаружены гены системы секреции Ш типа, но в отличие от плазмидных генов другого происхождения, возможно, данный хромосомный локус необходим возбудителю чумы при нахождении в переносчике (грызун, блоха) [36].
Секреторный аппарат ЕРЕС и ЕНЕС штаммов расположен на острове патогенности LEE (от англ. locus enterocyte effacement). Данный остров содержит еще Два функциональных домена. Один участок включает гены (еае), кодирующие интимин (бактериальный адгезин), который не секретируется через III тип, но функционирует совместно с гена секреторного аппарата, и гены рецептора интими-на - Tir (от англ. translocated intimin receptor), который транслоцируется в оболочку эукариотических клеток. Второй домен содержит гены, кодирующие эффекторные Esp белки (от англ. ЕРЕС secreted proteins), разрушающие клетки хозяина, и гены бел-ков-помощников (espА, В, D, F) [8]. На рис. 2 представлена схема аппарата секреции энтеропатоген-ной кишечной палочки, который представляет собой жесткое образование, пронизывающее внешнюю и цитоплазматическую мембрану. Из белка EspF формируется иглоподобная структура на поверхности клетки. К данной структуре крепится фи-ламентозное образование, состоящее из субъединиц белка Esp А. Указанная фимбриальиая структура сначала используется как канал для транспорта белков-помощников EspB/D, образующих пору в эукариотических клетках, а в дальнейшем по данному каналу начинает транслоцироваться рецептор инти-
Bacterial cytosol
|Ш ner * m étáb rano.
Ти.
Needle
complex
SMSSP*
EscF-v needle
EspA filament
Protein : translocation
"-Host ceil membrane . ■■ ♦ &
••.' Translocated' Tir’ . ; . ; . .
Effector proteins
HspB/D . .
- translocation pore
n ' n
Host ceil cytosol
*
no sec системе
Рис. 2. Схематическое изображение III типа секреции у энтеропатогенных E. coli [8]
мина - Tir и эффекторные Esp белки [18, 22].
Гены Ш типа секреции патогенных Yersinia расположены кластером на 70 kb плазмидах (pYV, pIB, pCad), кодирующих вирулентные белки, которые продуцируются при снижении концентрации ионов Са+ в среде (так называемый регупон вирулентности LCR-low calcium response). LCR плазмиды Yersinia spp. имеют схожую структуру и содержат гены, кодирующие белки с гомологичными функциями. Кроме генов секреторного аппарата LCR, плазмиды содержат ген, кодирующий V антиген, гены регуляторных и секретируемых Yop белков (от англ. Yersinia outer proteins) [38]. При контакте бактерий с макрофагами Yop белки транслоци-руются внутрь клеток хозяина (YopH, обладающий тирозинфосфатазной активностью и разрушающий белки макрофагов, YopM - связывающийся с а-тром-бином, YopE и YopT - индуцирующие цитотоксиче-ский эффект в клетках и т.д.). Секреторный аппарат Yersinia активируется при уменьшении концентрации ионов Са+2 в среде и контакте бактерий с эукариотическими клетками. Сигналом для секреции служит определенная последовательность аминокислот в N-терминальной (5; mRNA) части белка и домене, контактирующем с шапероном [28].
В секрецию и транслокацию эффекторных белков у Yersinia вовлечено около 35 генов. У Y. entero-colitica гены секреции объединены в 4 локуса - virA, virB, virG, virC. Оперон virC состоит из 13 ysc (от англ. yop secretion) генов (от yscA до yscM). Функция белков YscA/B из данного оперона не изучена. Ген yscC кодирует белок внешней мембраны YscC, входящий в семейство белков-секретинов. Из данного белка формируется пора во внешней мембране. Белок YscD формирует пору в цитоплазматической мембране (рис. 1). YscJ является липопротеином. Ген yscH кодирует белок YopR с молекулярной массой 18,3 kDa, который не только необходим для секреции Yop белков, но и вовлечен в патогенез (мутация в данном гене приводит к 100-кратному повышению 50 % летальной дозы). Ген yscF кодирует белок YscF, принимающий участие в секреции белков YopB/D, которые формируют поры в эукариотических клетках. Внутри данного гена у Y. pes-tis находится Са2+-регулируемый промотер. Ген yscM (lcrQ Y. pseudotuberculosis и Y. pestis) является негативным регулятором экспрессии и секреции Yop белков, у Y. pseudotuberculosis данный ген находится в моноцистронном опероне. К virC оперону примыкает ген virF, который кодирует транскрипционный регулятор VirF (у Y. pseudotuberculosis и Y. pestis данный белок обозначается как LcrF), относящийся к семейству АгаС белков-регуляторов. Белок VirF .регулирует не только синтез, но и секрецию Yop белков. Между virF й virB опероном находится ген virG (yscW Y. pestis), кодирующий липо-протеин VirG. Функция данного белка заключается в стабилизации белка-порина YscC во внешней мембране! (рис. 1). Оперон virB содержит восемь генов! (от \yscN до yscU). Белок YscN является АТФ-азой,! обеспечивающей процесс транспорта энергией, и расположенной на цитоплазматической мембране ,со стороны цитоплазмы (рис. 1). Белки YscR и YscU находятся в цитоплазматической мем-
бране и совместно с белками YscO, Р, Q, S, Т участвуют в формировании аппарата секреции (рис. 1). Локус virA содержит семь генов (yopN, tyeA, sycN, yscXY, IcrD/yscV, IcrR). Белки YscX и YscY имеют небольшие размеры и необходимы для секреции Yop белков. Белки. LcrD/YscV являются трансмембранными и связывают внешнюю и цитоплазматическую мембраны (рис. 1). Ген IcrD формирует опе-рон с геном IcrR, кодирующим белок с неизвестной функцией. Белок YopN (LcrE) выполняет важную функцию - совместно с белком ТуеА в присутствии ионов Са2+ блокирует секретируемую пору. Белок ТуеА, в свою очередь, при функционировании секреторной системы взаимодействует с белками YopD и YopN и. участвует в транслокации секретируемых белков YopE и YopH в эукариотические клетки. Белок SycN является шапероном белка YopN. К virA оперону примыкает оперон IcrGVsycDyopBD, принимающий участие в транслокации Yop белков в эукариотические клетки. Белок LcrG регулирует продукцию Yop белков in vitro и Необходим для их эффективной транслокации in vivo. Белки YopB/D формируют поры в эукариотических клетках, а белок YopQ(YopK) участвует в регуляции транслока-цйи белков через образованную пору, изменяя размер поры. Штаммы, имеющие мутацию в гене уорК, обладают ¡ усиленной транслокацией. Белок SycD (LcrH) является шапероном белков YopB/D. Ген IcrV из этого кластера кодирует протективный V антиген, выполняющий несколько функций, во-первых, является регуляторным белком, во-вторых, как составная часть аппарата транслокации способствует секреции и сборке белков YopB/D в поровую структуру ¡ при контакте с эукариотическими клетками [9, 21, 28, 38].
В общих чертах система секреции III типа действует как поршень или шприц с иглой, впрыскивая эффекторные белки внутрь клеток хозяина, а по структуре схожа с аппаратом жгутика [18]. На основании этого большинство исследователей придерживается мнения, что TTSS система эволюционировала из аппарата жгутика, приобретая при горизонтальном переносе дополнительные гены, но существует и другая точка зрения, что у этих систем был общий предок, но эволюция каждой шла независимым образом [17, 31]. '
Система секреции II типа детально изучена у К. oxytoca при транспорте фермента пулланазы. В данном процессе участвуют 14 белков, большинство из которых локализовано в цитоплазматической мембране. Гены, кодирующие аппарат секреции II типа, расположены кластером, как и в III типе, но в коровой части хромосомы, а не на островах патогенности. Гены секретируемых белков не связаны с этим кластером, часто расположены далеко друг от друга или даже на другой хромосоме, или на островах патогенности [36]., Через II тип секретируются эластаза, фосфолипаза С и А, токсин P.aeruginosa, амилаза и протеаза Aeromonas hydrophila [21], значительное количество белков Vibrio cholerae и т.д. У некоторых микроорганизмов система секреции изучена, но секретируемые данной системой белки не известны. Например, у энтерогеморрагической кишечной палочки на вирулентной плазмиде р0157
так же, как у Е. coli К-12 на хромосоме, обнаружены гены II типа секреторной системы, но белки, секре-тируемые этой системой, не выявлены [18].
Во II типе секреции транспорт белков осуществляется в два этапа. Первый этап - это перенос белков из цитоплазмы через цитоплазматическую мембрану в форме препротеинов с N-терминальными сигнальными пептидами по sec системе. В пери-плазматическом пространстве сигнальная последовательность отщепляется препелин пептидазой [36], и затем «зрелый» белок проходит через пору во внешней мембране в окружающую среду (рис. 1). Белки sec системы имеют небольшие размеры (примерно 30 аминокислот) и при переносе взаимодействуют с сигнальными пептидами транспортируемых белков. У К. oxytoca данная система включает белки внешней мембраны (SecD, F, Y), АТФ-азу (SecA), связанную с рибосомами и цитоплазматической мембраной, шаперон (SecB) и периплазмати-ческую пептидазу (LspA) (рис. 1) [28]. Секретируе-мые белки переносятся через цитоплазматическую мембрану в виде визикул или липосом, становясь в таком виде не доступными для протеаз, накапливаются в периплазме, иногда соединяются в более крупные молекулы и затем переносятся через внешнюю мембрану [25, 28]. -
У холерного вибриона секреция также осуществляется по II типу [5, 34]. Секреторный механизм V. cholerae кодируется eps опероном (от англ. extracellular protein secretion), расположенным на первой (большой) хромосоме и содержит примерно 13-15 генов, кодирующих белки, которые проявляют высокую степень гомологии с белками II типа секреции у других бактерий [1, 5, 19, 33]. В отличие от большинства транспортных систем II типа, которые у многих грамотрицательных бактерий участвуют в транспорте одного-двух белков и очень специфичны, у холерного вибриона II тип секреторной системы вовлечен в секрецию большого количества белков и комплексов [1,4, 26, 33]. Через данный тип происходит секреция холёрного токсина, гемагглЮ-тинин/протеазы, липазы, нейраминидазы, хитиназы, внеклеточного экзополисахарида, гемолизина, белков, участвующих в сборке жгутика, белков внешней мембраны и т.д. Для того чтобы произошел перенос белка из периплазматического пространства через внешнюю мембрану, необходимо присутствие в нем сигнальной последовательности или ETS (от англ. extracellular transport signal). Например, для транспорта хитиназы необходимо наличие в аминотерминальной части белковой молекуле определенной последовательности аминокислот, локализованной между 75 и 555 аминокислотными остатками [14], секреция холерного токсина происходит только при образовании комплекса [34]. На рис. 3 представлена схема секреции холерного токсина и показано, что сначала А и В-субъединицы транслоцируются через цитоплазматическую мембрану в форме мономеров, в периплазматическом пространстве мономеры с помощью дисульфит изомеразы (DsbA) собира: ются в токсиновый комплекс - пять В-субъединиц и одна А и только после этого комплекс, имеющий определенный сигнал для секреции в составе В-субъ-единицы, поступает в систему секреции [34].
В формировании пор во внешней мембране у холерного вибриона принимает участие белок EpsD (обозначенный буквой D на рис. 3). Данный белок относится к семейству белков-секретинов, которые участвуют в биогенезе пилей IV типа, продукции филаментозных фагов и в секреторной системе III типа [34]. Как известно, белки-секретины имеют консервативный домен в С-терминальной части [9]. Мутация в гене epsD приводит к полному отсутствию секреции [4, 26]. Для образования одной поры необходимо 12-18 мономерных D белков. В стабилизации данного комплекса принимает участие ли-попротеин S, который не обнаружен у V. cholerae, но присутствует у других микроорганизмов [ 10, 34]. В регулировании размера поры участвует несколько белков. Во-первых, EpsA, расположенный в цитоплазматической мембране и связанный с белком D посредством белка В, во-вторых, цитоплазматические белки EpsÇ и N, взаимодействующие с комплексом белков EpsL,M,E. Важная роль в секреции принадлежит белку G, который совместно с белками H, I, J (не показаны на рис. 3), формирует пиле-подобную структуру. Данная структура выполняет в аппарате секреции роль поршня, сокращаясь или вытягиваясь, выталкивает секретируемые белки на-ружу [15, 33, 34].
Энергия для работа пилевой структуры и поры поступает от цитоплазматического белка EpsE, выполняющего роль АТФ-азы, который для предотвращения протеолитической деградации формирует стабильный комплекс с белками EpsL и EpsM. Высказывается предположение; что такой трипептид-ный комплекс вовлечен также в регуляцию открытия/закрытия секретируемой поры [33].
Как известно, гены одного из основных факторов вирулентности V. cholerae - холерного токсина ctxAB расположены на мобильном генетическом элементе филаментозном фаге СТХф, который подобен филаментозным колифагам f 1, fd и М13 [13]. Под действием ультрафиолетового излучения, ми-томицина С может происходить репликация и продукция частиц СТХ фага во внешнюю среду через II тип секреции [12, 40]. В отличие от колифагов, которые содержат гены, кодирующие белок-секретин, образующий канал во внешней мембране для выхода частиц фага, СТХ освобождается через поры, об-
ËxtracèHutar milieu
с
. 'і . г ■* ) > 1 І
№;яАл""лАк' ‘Ш'чАі1 'ПДА'
®?є®
:
tssnxpf* ттяйхтмра»«
Cytoplasm
AiX’iVf*.!
Рис. 3. Схематическое изображение секреции холерного токсина (слева) и фага СТХф (справа) с использованием II типа секреторной системы [34]:
ОМ - внешняя мембрана; СМ - цитоплазматическая мембрана
разованные белком EpsD, входящим в систему секреции II типа (рис. 3). Холерные вибрионы продуцируют СТХ фаг в низком титре (107), что не сказывается на транспорте белков. При секреции частиц фага белок EpsD взаимодействует с белком. Zot (от англ. zonula occludens toxin), гены которого содержатся в СТХ фаге. Высказывается предположение, что при секреции фага белок Zot функционирует как АТФ-аза и выполняет функцию, подобную комплексу белков EpsE, L, М [34]. Свободные частицы фага, при наличии соответствующих рецепторов на поверхности клетки, могут участвовать в горизонтальном переносе генов, играющем главную роль в эволюции большинства патогенных бактерий [13].
Системе секреции отводится важнейшая роль при выживании V. cholerae в различных условиях внешней среды и в организме хозяина [1, 14, 32, 33]. При повреждении секреторной системы не происходит продукции холерного токсина, вызывающего развитие диареи: нарушается сборка жгутика, бактерии становятся неподвижными и не могут преодолеть слизистый барьер в кишечнике для прикрепления к ворсинкам. При отсутствии секреции гемагглютйнин/протеазы, способствующей откреплению холерных вибрионов от эпителиальных клеток, не происходит диссеминации возбудителя. При нарушении включения во внешнюю мембрану белка OmpU, содержание которого может составлять до 60 %, приводит к ее повреждению и дефекту роста бактерий и т.д. [32].
; Необходимо отметить, что у многих грамотри-цательных бактерий существует еще одна важная секреторная система, белки которой выполняют функции, гомологичные белкам II типа секреции, это система сборки пилей IV типа или «терминальная ветвь» главного секреторного пути (GSP) [5, 29]. Пили IV типа синтезируются штаммами Е. coli, V. cholerae, P. aeruginosa и другими бактериями. В системе секреции II типа и сборки пилей присутствуют подобные препелин-пептидазы, в образовании пор во внешней мембране участвуют белки из семейства секретинов, на цитоплазматической мембране со стороны цитоплазмы расположены белки,
участвующие в гидролизе АТФ (АТФ-азы) [5]. Во II секреторной системе роль поршня выполняет пиле-подобная структура, состоящая из белков (G, H, I, J), относящихся к IV типу (белки IV типа имеют одинаковую аминотерминальную последовательность). Считается, что процесс эволюции секреторного аппарата II типа и системы сборки пилей, IV типа происходил одинаковым образом [34].
Высказывается предположение, что в клетках микроорганизмов процесс образования пилей и секреция белков взаимосвязаны и формируют макро-молекулярную супраструктуру (рис. 4). В бактериях, синтезирующих однонитчатые пили (рис. 4, А), секретируемая пора окружена порами, через кото-pbie происходит сборка пилей. Если бактерии продуцируют пучки пилей (рис. 4, В), например, ток-син-корегулируемые пили холерного вибриона (TCP) и BFP-пили кишечной палочки, то секрети-руемые поры расположены вокруг поры, через которую выталкивается пучок пилей. Эта модель предполагает, . что продукция пилей является сигналом для последующей секреции белков, являющихся факторами вирулентности [34, 35]. Например, у V. cholerae сначала происходит продукция TCP и колонизация кишечника, а затем секреция холерного токсина [24], у S. typhimurium и энтеропатоген-ных E. coli в начале инфекции на поверхности клеток образуются филаментозные структуры, через которые затем внутрь клеток хозяина транслоциру-ются эффёкторные белки, повреждающие эукариотические клетки и т.д. [35].
, Четвертый тип секреции впервые обнаружен у агробактерий - патогенов растений и так же, как и в
III типе секреции гены IV секреторной системы тесно связаны с островами патогенности [6]. Данный тип секреции используется для передачи плазмид и экспрессии токсинов в эукариотические клетки [39]. У Helicobacter pylori гены IV типа секреции расположены на острове патогенности Cag (cytotoxin-associated! antigen), который содержит 31 ген, в том числе и гён, кодирующий Cag антиген, транслоци-руемый в клетки хозяина и изменяющий их рост [37, 41]. У Brucella suis белки, транспортируемые по
Cell surface
Рис. 4. Модель макромолекулярной супраструктуры, функционирующей в клетках грамотрицательных бактерий [34]:
А; - клеточная поверхность микроорганизмов, продуцирующих одиночные пили. В данном случае центральная секретируемая пора окружена порами, через которые синтезируются пили. В - клеточная поверхность микроорганизмов, формирующих на поверхности клетки пучки пилей. Сек-
ретируемые поры расположены вокруг канала для экспорта пучка пилей
IV типу секреции, участвуют в развитии инфекционного процесса [30], у В. pertussis с помощью данного секреторного механизма коклюшный токсин продуцируется в эпителиальные клетки, у Legionella pneumophila происходит передача плазмидной ДНК в эукариотические клетки [18]. По IV типу секреции, так же, как и по II происходит транспорт белков, содержащих N-терминальные сигнальные пептиды с использованием sec системы. В настоящее время установлено, что у некоторых различных микроорганизмов функционирует секреторный аппарат IV типа с гомологичными белками. Например, у облигатного внутриклеточного патогена Coxiella burnetii гены секреторного аппарата гомологичны генам секреции факультативного внутриклеточного патогена L. pneumophila, поэтому последний используется для изучения продукции факторов вирулентности С. burnetii [39].
Через аппарат секреции V типа, который иногда объединяют с IV типом, транслоцируется группа так называемых самотранспортируемых белков, и секреторный аппарат V типа состоит из одного гена [20]. Данный тип секреции используется для транслокации протеазы иммуноглобулина A Neise-ria gonörrhoeae, пертактина В. pertussis, вакуоли-рующего цитотоксина А H. pylori, белков, обладающих протеолитической активностью - SepA S.flexneri и EspC энтеропатогенных кишечных палочек. Транспорт данных белков осуществляется из цитоплазмы по sec системе, затем из С-терминаль-ной части белка формируется ß-цилиндрическая структура во внешней мембране, выполняющая роль поры, через которую проходит остальная часть секретируемого белка. Некоторые белки так и остаются связанными с поверхностью клетки через С-терминальный домен, а другие после протеолити-ческого расщепления выходят во внеклеточное пространство [18, 36].
В заключение отметим, что, несмотря на значительные успехи, достигнутые в изучении механизмов секреции грамотрицательных бактерий, структура и функция некоторых белков до сих пор не исследованы. С другой стороны, постоянно происходящий процесс превращения непатогенных и условно-патогенных бактерий в патогенные, а также возникновение в ходе эволюции новых вирулентных клонов приводит и к изменению в системах секреции, что необходимо учитывать при решении вопросов диагностики и профилактики инфекционных заболеваний.
Работа выполнена при частичной поддержке гранта Президента РФ (НШ-1531.2003.4) и гранта РФФИ (03-04-48438).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ali A., Johnson J.A., Franco A.A. et al. II Infect. Immun. - 2000. - Vol. 68, N 4. - P. 1967-1974. - 2. Bina J.E., Mekalanos J.J. // Infect. Immun. - 2001. - Vol. 69, N 7. -P. 4681-4685. - 3. Binet R., Létoffé S., Ghigo J.M.etal.ll Gene.- 1997. - Vol. 192. - P. 7-11. -4. Bitter W., Koster M., Latijnhouwers M. et al. // Mol. Microbiol. - 1998. - Vol. 27. -P. 209-219. - 5. Bose N., Payne S.M., Taylor R.K. //J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184, N 8. - P. 2305-2309. - 6. Bums
D.L. //Curr. Opin. Microbiol. - 1999. - Vol. 2. - P. 25-29. -7. Chang J.H., Goel A.K., Grant S.R. et al. II Curr. Opin. Microbiol. - 2004. - Vol. 7. - P. 11-18. - 8.Chen H.D., Frankel G. // FEMS Microbiol. Rev. - 2005. - Vol. 29. - P. 83-98. - 9. Cornelis G.R., Boland A., Boyd A.P. et al. II Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 1998. - Vol. 62, N 4. - P. 1315-1352. -lO.Daefler S., Guilvout I., Hardie K.R. et al. II Mol. Microbiol. - 1997. - Vol. 24. - P. 465—475. - 11. Davidson
A.L, Chen J. // Annu. Rev. Biochem. - 2004. - Vol. 73. -P. 241-268. - 12. Davis B.M., Lawson E.H., Sandkvist M. et al. // Science. - 2000. - Vol. 288. - P. 333-335. - 13. Davis
B.M., Waldor M.K. // Curr. Opin. Microbiol. - 2003. -Vol. 6. - P. 35-42. - 14. Folster J.P., Connell T.D. // J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184, N 8. - P. 2225-2234. - 15. Fullner K.J., Mekalanos J.J.//Infect. Immun. - 1999. - Vol. 67, N 3. -P. 1393-1404. - 16.Galan J.E., Collmer A. // Science. -1999. - Vol. 284. - P. 1322-1328. - 17. Gophna U., Ron E.Z., Graur D. // Gene. - 2004. - Vol. 3, N12. - P. 151-163. -18. Hacker J., Kaper J.B.//Annu. Rev. Microbiol. - 2000. -Vol. 54. - P. 641-679. - 19. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. II Nature. - 2000. - Vol. 406. - P. 477-483. -20.Henderson I.R., Navarro-Garcia F., Nataro J.P. // Trends Microbiol. - 1998. - Vol. 6. - P. 370-378. - 21.Hueck
C. II Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 1998. - Vol. 62, N 2. - P. 379-433. - 22. Knutton S., Rosenshine I., Pallen M.], etal.ll EMBO J. - 1998. - Vol. 17. - P. 2166-2176.'- 23. Koronakis V., Sharf A., Koronakis E. et al. II Nature. - 2000. -Vol. 405. - P. 914-919. - 24. Krukonis E.S;, DiRifa V.J.// Curr. Opin. Microbiol. - 2003. - Vol. 6. - P. 186-190. - 25. Lee C. A. // Trends Microbiol. - 1997. - Vol. 5, N4. - P. 148-153. -26. Linderoth N.A., Model P., Russel M.//J. Bacteriol.-1996. - Vol. 178. - P. 1962-1970. - 27.Nguen L., Paulsen I.T., Tchieu J. et al. II J. Mol. Microbiol. Biotechnol. - 2000.-Vol. 2, N2. - P. 125-144. - 28. Perry R.D., Straley S.C., Fetherston J.D. et al. // Inf. Immun. - 1998. - Vol. 66, N 10. -P. 4611-4623. - 29. Pugsley A.P. // Microbiol. Rev. - 1993. -Vol. 57, N l.-P. 50-108.-30. Roy C., Sansonetti P.//Curr. Opin. Microbiol. - 2004. - Vol. 7. - P. 1-3. - 31. Saier M.H. // Trends in Microbiology. - 2004. - Vol. 12, N 3. - P. 113-115. -32. Sandkvist M., Michel L.O., Hough L.P. et al. II J. Bacteriol. - 1997. - Vol. 179, N22. - P. 6994-7003. -33.Sandkvist M., Hough L.P., Bagdasarian M.M., Bagdasarian M. // J. Bacteriol. - 1999. - Vol. 181, N 10. -P. 3129-3135. - 34. Sandkvist M. // Mol. Microbiol. - 2001. -Vol. 40, N 2. - P. 271-283. - 35. Sauvonnet N., Vignon G. Pugsley A.P., Gounon P. // EMBO J. - 2000. - Vol. 19. -P. 2221-2228. - 36. Schmidt H., Hensel M. // Clinical Microbiol. Rev. - 2004. - Vol. 17, N 1. - P. 14-56. - 37. Sega 1
E.D., Cha J., Lo J. et al. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -
1999.- Vol.96. - P. 14559-14564. - 38.Snellings N.J., Popek M., Lindler L.//Infect. Immun. - 2001.-Vol. 69, N 7. - P. 4627^-638. - 39. Vogel J.P. // Trends Microbiol. - 2004. -Vol. 12, N3.- P. 103-105. - 40. Wagner P.L., Waldor M.K. // Infect. Immun. - 2002. - Vol. 70, N 8. - P. 3985-3993. -41.Yeo H.J., Savvides S.N., Herr A.B. et al. II Mol. Cell. -
2000. - Vol. 6. - P. 1461-1472.
S.P.Zadnova, Yu.V.Lozovsky Secretion Mechanisms of Gram-Negative Bacteria
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov
Considered in the paper, are five secretion systems functioning in pathogenic Gram-negative bacteria involved in protein transport lo the surface of bacterial cells or into the host cells. In a majority of microorganisms, genes coding for secreted proteins and the system of secretion itself are located in pathogenicity islands, emphasizing a most important role of the latter for pathogenic properties. Bacteria may loose their virulence as a result of damaged secretion systems.
Поступила 29.06.05.
