CC BY
13
микробиология
УДК 616.932:579.24
С.П.Заднова, И.М.Крепостнова, Ю.В.Лозовский
сравнительный анализ способности к ферментации углеводов у типичных штаммов и геновариантов vibrio cholerae биовара эль тор
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов,
Российская Федерация
Проведено сравнительное изучение способности 6 типичных штаммов и 10 геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, завезенных на территорию России, ферментировать различные углеводы. Выявлено, что геновари-анты, как и типичные Эль Тор вибрионы, ферментируют маннозу, сахарозу, манит, но не активны в отношении к арабинозе и рамнозе. Однако показано, что у геновариантов по сравнению с типичными штаммами Эль Тор вибрионов снижена способность к ферментации глюкозы. Геноварианты, как и классические вибрионы, не растут на минимальной среде с 1 % содержанием глюкозы и не способны полностью ферментировать глюкозу до ацетилметилкарбинола в реакции Фогес-Проскауэра. Выдвигается гипотеза, что изменение метаболизма глюкозы в изученных штаммах геновариантов может быть связано с изменением механизма регуляции некоторых генов вирулентности.
Ключевые слова: холерный вибрион, генетически измененные варианты Эль Тор вибрионов, метаболизм глюкозы.
S.P.Zadnova, I.M.Krepostnova, Yu.V.Lozovsky
Comparative Analysis of the Ability to Ferment Carbohydrates in Typical Strains and Genovariants of Vibrio cholerae Biovar El Tor
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation
Carried out is a comparative analysis of the ability to ferment various carbohydrates in the 6 typical strains and 10 genovariants of V. cholerae biovar El Tor, imported to the territory of the Russian Federation. It has been revealed that genovariants, as well as typical El Tor vibrios, ferment mannose, saccharose, and mannite, but are inactive against arabinose and rhamnose. However, it is demonstrated that genovariants, as compared to typical strains of El Tor vibrios, possess lowered capacity to ferment glucose. Both, genovariants and classical vibrios, do not grow on the minimal media with 1 % content of glucose, and are unable to fully ferment glucose up to acetylmethylcarbinol in Voges-Proskauer reaction test. Put forward is a hypothesis that alteration of glucose metabolism in the studied strains of genovariants is probably due to changes in regulating mechanism of some virulence genes.
Key words: cholera vibrio, genetically altered variants of El Tor vibrios, glucose metabolism.
В настоящее время пристальное внимание исследователей всего мира привлечено к изучению новых генетически измененных вариантов V. с^1егае биовара Эль Тор с повышенной вирулентностью, появившихся в 1992 г. Данные штаммы в отличие от типичных эль тор вибрионов, вызвавших седьмую пандемию холеры, содержат в геноме профага СТХ классический аллель гена ОхВ и синтезируют холерный токсин классического типа. Во многих эндемичных по холере районах данные геноварианты вытеснили типичного возбудителя холеры эль тор и заняли доминирующее положение [2, 13, 14]. На сегодняшний день детально изучено строение генома геновариантов, выделенных в различных странах мира, проведено полногеномное секвенирование нескольких штаммов. При фенотипическом анализе выявлено, что геноварианты обладают всеми био-варспецифическими свойствами, характерными для Эль Тор вибрионов (растут на средах, содержащих 50 мкг/мл полимиксина В, агглютинируют куриные эритроциты, лизируются диагностическим фагом эльтор, дают положительную реакцию Фогеса-Проскауэра). При анализе продукции холерного токсина и вирулентности показано, что геноварианты, в отличие от типичных Эль Тор вибрионов, являются
более вирулентными, синтезируя повышенное количество холерного токсина, сопоставимое со штаммами классического биовара [5, 11, 13]. В то же время сведения об экспрессии генов жизнеобеспечения у геновариантов, в том числе о способности ферментировать углеводы, практически отсутствуют.
Как известно, углеводы играют важную роль в жизнедеятельности холерного вибриона, выполняя структурную функцию, участвуя в обеспечении клеток энергией, в процессах осморегуляции, устойчивости к стрессам и т.д. [3, 7, 12, 10]. Показано, что при отсутствии глюкозы в среде выращивания штаммы V. cholerae не продуцируют холерный токсин, у них снижается подвижность и способность колонизировать кишечник, а также нарушается функционирование системы «quorum sensing» [3, 7, 12]. кроме того, углеводы используются в диагностике V. cholerae. Например, ферментация глюкозы до кислоты без газа - тест, дифференцирующий холерные вибрионы от представителей Pseudomonadaceae. Способность утилизировать сахара, составляющие триаду Хейберга - манноза, сахароза и арабиноза, положена в основу определения рода Vibrio. Кроме того, ферментация сахарозы является единственным дифференциальным фенотипическим тестом, отли-
чающим V. ^о1егае от V. тткш [1, 8]. Установлено, что холерные вибрионы как классического, так и Эль Тор биоваров обладают большим набором ферментов и способны ферментировать глюкозу, сахарозу, мальтозу, галактозу, левулезу, маннозу, манит, гликоген и крахмал. В то же время арабинозу, дульцит, инозит, рамнозу, сорбит, раффинозу не усваивают. Отношение к лактозе непостоянное (±) [1]. С учетом важной роли углеводов в метаболизме, вирулентности, а также диагностике холерного вибриона цель работы состояла в проведении сравнительного анализа способности типичных штаммов и геновариантов V. с^1егае биовара эль тор ферментировать различные сахара.
Материалы и методы
В работе использовано 6 типичных штаммов V. сЫ1егае биовара Эль Тор и 10 геновариантов, завезенных на территорию России с 1970 по 2011 год, а также три штамма V. с^1егае классического биовара (таблица). Штаммы хранились в Государственной коллекции патогенных бактерий в лиофильно высушенном состоянии.
Исследования проведены с использованием
6 углеводов - арабинозы, рамнозы, маннозы, ман-нита, глюкозы и сахарозы. Способность штаммов усваивать углеводы изучали, культивируя штаммы на минимальном агаре (2 % Бакто агар, 0,1 - MgSO4, 0,5 - №С1, 0,1 - К2НР04, 0,1 - (N^^04, рН 7,6) с добавлением 0,4 % различных сахаров в качестве единственного источника питания. При положительном результате наблюдали рост культуры, при отрицательном - колонии отсутствовали.
Для определения продукции ацетилметилкарби-нола в реакции Фогес-Проскауэра (Ф-П) использовали методику, описанную G.Kovacikova а1. [9].
Для изучения белкового спектра штаммов холерного вибриона получали цельноклеточные лиза-ты клеток в дистиллированной воде, добавляли равный объем «буфера образца» (0,125 моль трис-НС1, рН 6,8; 4 % додецилсульфата натрия; 20 % глицерина; 2 % 2-меркаптоэтанола; 0,03 ммоль бромфеноло-вого синего) и кипятили на водяной бане в течение 5 мин. Полученные образцы исследовали методом ПААГ-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия. В работе использовали 12,5 % полиакрила-мидный гель. После электрофореза гелевую пластину фиксировали в растворе изопропанола и окрашивали 0,1 % раствором кумасси R-250 в изопропаноле. избыток красителя из геля вымывали диффузией в
7 % растворе уксусной кислоты.
Биосинтез токсинкорегулируемых пилей адгезии (ТКПА) изучали методом самоагглютинации бактерий в АК1 бульоне [6]. Ночную культуру изучаемых штаммов в количестве 105 КОЕ засевали в 10 мл АК1 бульона (рН 7,4-7,6) и культивировали 4 ч стационарно при температуре 37 °С. Затем 8 мл бульона выливали, а оставшиеся 2 мл культуры выращивали в условиях повышенной аэрации на шейкере при температуре 37 °С в течение 16 ч. Если штамм
продуцировал ТКПА, то за счет биосинтеза на поверхности клеток данных пилей наблюдалась самоагглютинация бактерий и выпадение их в осадок на дно пробирки. Если штамм не синтезировал пили, осадок клеток отсутствовал.
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы нами был проведен сравнительный анализ способности взятых для исследования штаммов V. с^1егае биовара Эль Тор усваивать различные углеводы. В результате проведенных исследований выявлено, что геноварианты, так же, как и типичные Эль Тор и классические вибрионы, не способны ферментировать арабинозу и рамнозу, но используют для метаболизма маннозу, сахарозу и маннит.
Далее была изучена способность геновариантов к ферментации глюкозы. Как известно, глюкоза является основным субстратом, который используется в качестве источника питания и получения энергии у большинства микроорганизмов, в том числе и у холерного вибриона. По данным зарубежных исследователей, установлено, что Эль Тор вибрионы способны хорошо расти в присутствии больших концентраций глюкозы (до 3 %), в то же время рост классических вибрионов на средах, содержащих 1 % глюкозы, отсутствует [15]. В результате проведенных нами исследований выявлено, что при концентрации глюкозы 0,4 % в среде выращивания все штаммы давали хороший рост. В то же время при увеличении концентрации глюкозы до 0,5 % у геновариантов наблюдался слабый рост, а при концентрации 1 % вырастали только типичные штаммы Эль Тор вибрионов, а геноварианты, как и классические вибрионы, не росли при данной концентрации углевода (таблица). На основе полученных результатов было высказано предположение, что у геновариантов снизилась способность к ферментации глюкозы.
Однако остается неясным способны ли генова-рианты как типичные Эль Тор вибрионы ферментировать глюкозу до ацетилметилкарбинола (аце-тоина) в реакции Фогес-Проскауэра. Как известно, метаболизм глюкозы в штаммах классического и Эль Тор биоваров происходит по различным путям [15]. Типичные Эль Тор вибрионы полностью ферментируют глюкозу до ацетилметилкарбинола и далее до диацетила или 2,3-бутандиона, который имеет нейтральный рН [4]: глюкоза ^ пируват ^ ацетолак-тат ^ ацетоин (ацетилметилкарбинол) ^ 2,3-бутан-дион. Классические вибрионы разлагают глюкозу до органических кислот, которые сильно закисляют среду: глюкоза ^ пируват ^ органические кислоты (молочная, уксусная, муравьиная).
Поскольку холерный вибрион является кисло-точувствительным организмом, то резкое снижение рН среды при росте в богатой углеводами среде (питательные среды с 1 % глюкозы и выше, кишечник человека, хитин-содержащие поверхности ракообразных в водной среде) оказывает ингибирующее влияние на рост и размножение классических вибри-
МИКРОБИОЛОГИЯ
ферментация глюкозы, продукция белков внешней мембраны и токсинкорегулируемых пилей адгезии штаммами V. еко1егае
Штамм V. cholerae Место и год выделения Характеристика штамма по содержанию гена ctxB Образование ацетоина в реакции Ф-П Рост на минимальном агаре с глюкозой* Продукция белков внешней мембраны Продукция ТКПА**
0,4 % 0,5 % 1 % OmpU OmpT
М818 Саратов, 1970
М713 Москва, 1970
М738 Пермь, 1970
М886 Астрахань, 1970
М1261 Пермь, 1990
М1013 Башкирия, 1972
М1264 Краснодар, 1993
М1272 Краснодар, 1993
М1270 Татарстан, 1993
М1297 Дагестан, 1993
М1266 Пермь, 1994
М1293 Дагестан, 1994
М1269 Магнитогорск, 1994
Р17644 Ачинск, 1997
Р17645 Иркутск, 1997
М1344 Казань, 2001
М1345 Казань, 2001
М1429 Башкирия, 2004
М1430 Тверь, 2005
Р18899 Мурманск, 2006
Л3226 Москва, 2010
Л4150 Москва, 2010
301 Таганрог, 2011
569В Индия, 1950
Дакка 35 Пакистан, 1958
В-1307 Пакистан, 1964
Типичный Эль Тор Типичный Эль Тор Типичный Эль Тор Типичный Эль Тор Типичный Эль Тор Типичный Эль Тор Геновариант Геновариант Геновариант Геновариант Геновариант Геновариант Геновариант Геновариант Геновариант Геновариант Геновариант Геновариант Геновариант Геновариант Геновариант Геновариант Геновариант Классический Классический Классический
+ + + + + +
с.р
с.р ср
ср ср
с.р с.р с.р с.р с.р с.р с.р с.р с.р с.р с.р с.р с.р с.р с.р
++ ++ + + ++ + ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ +
н.о н.о н.о
++ ++ ++ + + ++ + + ++ +
+ + + ++ + + +
н.о н.о н.о
н.о н.о н.о
*Рост штаммов на минимальном агаре с добавлением разных концентраций глюкозы, «+» - хороший рост, с.р. - слабый рост, «-» - рост отсутствует.
"Продукция токсинкорегулируемых пилей адгезии (ТКПА) определена методом самоагглютинации бактерий в АК1 бульоне, «+» - наличие самоагглютинации (штамм синтезирует ТКПА), «-» - отсутствие самоагглютинации; н.о. - не определяли.
Примечания: Ф-П - реакция Фогес-Проскауэра; «+» - положительная (малиновое окрашивание среды); «-» - отрицательная (желтое окрашивание среды); «±» - слабо положительная реакция (темно-розовое окрашивание среды).
онов [15]. В то же время Эль Тор вибрионы достигают высокой плотности в данных условиях существования, что дает им преимущества для выживания. Высказывается предположение, что продукция 2,3-бутандиона Эль Тор вибриона была эволюцион-но выгодной и явилась одной из причин вытеснения ими штаммов классического биовара и быстрого распространения холеры Эль Тор по всему миру [15].
При постановке реакции Фогес-Проскауэра было выявлено, что все изученные типичные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор давали положительную реакцию Ф-П (малиновое окрашивание), что указывает на их способность полностью разлагать глюкозу до ацетилметилкарбинола. Взятые для сравнения штаммы классических вибрионов не образовывали аце-тилметилкарбинол и давали отрицательную реакцию Ф-П. У геновариантов наблюдалось темно-розовое окрашивание среды, что учитывается как слабо положительная реакция. Полученные нами результаты согласуются с данными зарубежных исследователей, показавших, что штаммы измененных вариантов V. cholerae биовара Эль Тор, выделенные в Бангладеш (Матлаб, 2001-2005 гг.) и на Гаити (2010 г.), также давали слабо положительную реакцию Ф-П [14].
Таким образом, полученные экспериментальные данные показывают, что изученные нами штам-
мы геновариантов, в отличие от типичных Эль Тор вибрионов, не способны полностью ферментировать глюкозу до ацетилметилкарбинола и занимают промежуточное положение между классическими и Эль Тор вибрионами.
Согласно данным литературы продукция аце-тилметилкарбинола непосредственно контролируется белком AрhA, который является одним из центральных регуляторных генов вирулентности [5]. Данный белок повышает транскрипцию генов, кодирующих биосинтез холерного токсина, подавляя при этом образование ацетилметилкарбинола (2,3-бутандиона). В штаммах холерного вибриона классического биовара, отличающихся от Эль Тор вибрионов повышенным биосинтезом холерного токсина, AрhA более активно подавляет продукцию ацетилметил-карбинола [4,15]. Возможно, в результате приобретения геновариантами нового генетического материала (ген ctxB классических вибрионов) у них произошло изменение регуляторных механизмов, в том числе увеличилась продукция белка AрhA (и соответственно биосинтез холерного токсина), но снизилась способность к ферментации глюкозы и образованию ацетилметилкарбинола. Однако для подтверждения данного предположения необходимо проведение дополнительных исследований.
+
+
На следующем этапе работы, учитывая, что координированная экспрессия генов вирулентности возбудителя холеры происходит через регуляторный каскад, в котором кроме белка AрhA участвуют и другие регуляторные белки [5], нами был проведен анализ экспрессии двух других глобальных белков-регуляторов - ToxR и ToxT, непосредственно контролирующих продукцию основных факторов патоген-ности - холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии. При этом ToxR, независимо от других регуляторных белков, контролирует продукцию белков внешней мембраны OmpU и OmpT, активируя транскрипцию OmpU и репрессируя OmpT [5].
при анализе белкового спектра изучаемых штаммов различия между типичными изолятами и генетически измененными вариантами по биосинтезу белков OmpU/OmpT не выявлены. Все изученные типичные штаммы и 88 % геновариантов синтезировали белок OmpU, что указывает на активную экспрессию белка ToxR как в типичных изолятах, так и в штаммах геновариантов.
При анализе продукции ТКПА методом самоагглютинации было установлено, что ряд штаммов геновариантов (М1270, М1344, М1345 и Л4150), в отличие от типичных изолятов, давали положительную реакцию самоагглютинации, что указывает на повышенный биосинтез ТКПА у данных штаммов и повышенную экспрессию ТохТ. В то же время у большинства штаммов геновариантов изменений в продукции ТКПА не выявлено. Таким образом, для выявления изменений в экспрессии ТКПА, а также регуляторного белка ТохТ в штаммах геновариантов необходимо проведение исследований по количественному определению продукции данных белков.
Итак, при сравнительном анализе способности штаммов V. cholerae биовара Эль Тор ферментировать углеводы установлено, что у генетически измененных вариантов изменился метаболизм глюкозы, что, возможно, явилось последствием изменения некоторых механизмов регуляции генов вирулентности.
Работа выполнена по государственному контракту № 53-Д от 04.06.2012 г. в рамках федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации 2009-2014 гг.» и РФФИ № 12-04-00285-а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Лабораторная диагностика холеры. МУК 4.2.2218-07. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Ро спотребнадзора; 2007.
2. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Заднова С.П., Краснов Я.М., Лозовский Ю.В., Кутырев В.В. Генетическая характеристика клинических штаммов Vibrio cholerae, завезенных на территорию Российской Федерации в современный период. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2011; 3:3-10.
3. Callahan L.T., Richardson S.H. Biochemistry of Vibrio cholerae virulence. III. Nutritional requirements for toxin production and the effects of pH on toxin elaboration in chemically defined media. Infect. Immun. 1973; 7:567-72.
4. De S.N., Chatterjee D.N. Experimental study of mechanism of action of Vibrio cholerae on intestional mucous membrane. J. Path. Bacteriol. 1953; 66:559-62.
5. Faruque S.M., Nair G.B. Vibrio cholerae genomics and molecular biology. Caister Academic Press, Norfolk, UK; 2008. 218 p.
6. Iwanaga M., Yamamoto K., Higa N., Ichinose Y., Nakasone N., Tanabe M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 1986;
30:1075-83.
7. Liang W., Silva A.J., Benitez J.A. The cyclic AMP receptor protein modulates colonial morphology in Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73:7482-7.
8. Kaper J.B., Morris J.G., Levine M.M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8:48-86.
9. Kovacikova G., Lin W Skorupski K. Dual regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive LysR-type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 2005; 57:420-33.
10. Mustachio L.M., Aksit S., Mistry R.H., Scheffler R., Yamada A., Liu J.M. The Vibrio cholerae mannitol transporter is regulated posttranscriptionally by the MtlS small regulatory RNA. J. Bacteriol. 2012; 194:598-606.
11. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype EL Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40:3296-9.
12. Poncet S., Milohanic E., Maze A., Nait Abdallah J., Ake F., Larribe M., Deghmane A.E., Taha M.K., Dozot M., De Bolle X., Letesson J.J., Deutscher J. Correlations betWeen carbon metabolism and virulence in bacteria. Infect. Immun. 2009; 16:88-102.
13. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1):46-54.
14. Son M.S., Megli C.J., Kovacikova G., Qadri F., Taylor R.K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2011; 49:3739-49.
15. Yoon S.S., Mekalanos J.J. 2,3-butanediol synthesis and emergence of the Vibrio cholerae El Tor biotype. Infect. Immun. 2006; 74:6547-56.
References
1. [Laboratory diagnostics of cholera. Methodological recommendations]. MR 4.2.2218-07. M.: Rospotrebnadzor Federal Center of Hygiene and Epidemiology; 2007.
2. Smirnova N.I., Goryaev A.A., Zadnova S.P., Krasnov Ya.M., Lozovsky Yu.V., Kutyrev V.V. [Genetic characteristics of clinical Vibrio cholerae strains imported to the territory of the Russian Federation in the modern period]. Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 2011; 3:3-10.
3. Callahan L.T., Richardson S.H. Biochemistry of Vibrio cholerae virulence. III. Nutritional requirements for toxin production and the effects of pH on toxin elaboration in chemically defined media. Infect. Immun. 1973; 7:567-72.
4. De S.N., Chatterjee D.N. Experimental study of mechanism of action of Vibrio cholerae on intestional mucous membrane. J. Path. Bacteriol. 1953; 66:559-62.
5. Faruque S.M., Nair G.B. Vibrio cholerae genomics and molecular biology. Caister Academic Press, Norfolk, UK; 2008. 218 p.
6. Iwanaga M., Yamamoto K., Higa N., Ichinose Y., Nakasone N., Tanabe M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 1986; 30:1075-83.
7. Liang W., Silva A.J., Benitez J.A. The cyclic AMP receptor protein modulates colonial morphology in Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbiol. 2007; 73:7482-7.
8. Kaper J.B., Morris J.G., Levine M.M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8:48-86.
9. Kovacikova G., Lin W., Skorupski K. Dual regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive LysR-type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 2005; 57:420-33.
10. Mustachio L.M., Aksit S., Mistry R.H., Scheffler R., Yamada A., Liu J.M. The Vibrio cholerae mannitol transporter is regulated posttranscrip-tionally by the MtlS small regulatory RNA. J. Bacteriol. 2012; 194:598-606.
11. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype EL Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40:3296-9.
12. Poncet S., Milohanic E., Maze A., Nait Abdallah J., Ake F., Larribe M., Deghmane A.E., Taha M.K., Dozot M., De Bolle X., Letesson J.J., Deutscher J. Correlations between carbon metabolism and virulence in bacteria. Infect. Immun. 2009; 16:88-102.
13. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1):46-54.
14. Son M.S., Megli C.J., Kovacikova G., Qadri F., Taylor R.K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2011; 49:3739-49.
15. Yoon S.S., Mekalanos J.J. 2,3-butanediol synthesis and emergence of the Vibrio cholerae El Tor biotype. Infect. Immun. 2006; 74:6547-56.
Authors:
Zadnova S.P., Krepostnova I.M., Lozovsky Yu.V. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: [email protected]
об авторах:
Заднова С.П., Крепостнова И.М., Лозовский Ю.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: [email protected]
Поступила 02.09.13.
