CC BY
19
23. Shakh Makhmud R., Garifulina K.I., Nikitina E.V., Il'inskaya O.N. Isolation of bacterial viruses from natural ecological nishes of Tatarstan Republic. Vestnik Kazanskogo tekhnologicheskogo universiteta. 2013; 16 (10): 173-8. (in Russian)
24. Massardo D.R., Borrelli G.M., Di Fonzo N., Alifano P., Del Giudice L. An efficient method for preparing high quality DNA from plant DNA libraries in lambda phage. Biotech. Let. 2002; 24 (14): 1199202.
25. Makarov A.A., Ilinskaya O.N. Cytotoxic ribonucleases: molecular weapons and their targets. FEBSLett. 2003; 540 (1-3): 15-20.
26. Ulyanova V., Vershinina V., Ilinskaya O. Barnase and binase: twins with distinct fates. FEBS J. 2011; 278 (19): 3633-43.
27. Shah Mahmud R., Ulyanova V., Malanin S., Dudkina E., Vershinina V., Ilinskaya O. Draft whole-genome sequence of Bacillus altitudinis strain B-388, a producer of extracellular RNase. Genome Announc. 2015; 3 (1): e01502-14. D0I:10.1128/genomeA.01502-14.
28. Seed K.D., Lazinski D.W., Calderwood S.B., Camilli A. A bacterio-phage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity. Nature. 2013; 494 (7438): 489-91.
29. Ilinskaya O.N., Shah Mahmud R. Ribonucleases as antiviral agents. Molecul. Biol. (Moscow). 2014; 48 (5): 615-23.
30. Alekseeva I.I., Kurinenko B.M., Kleyner G.I., Skuya A.Zh., Pen-zikova G.A., Oreshina M.G. Comparative study of the antiviral activity of pancreatic and microbial RNAse. Antibiotiki. 1981; 26 (7): 527-32. (in Russian)
Поступила 28.11.16
Shah Mahmud R, Garifulina KI, Ulyanova V.V., Evtugyn V.G., Mindubaeva L.N., Khazieva L.R., Dudkina E.V., Vershinina VI, Kolpakov AI, Ilinskaya O.N.
BACTERIOPHAGES OF SOIL BACILLI: NEW MULTIVALENT PHAGE OF BACILLUS ALTITUDINIS
Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan (Volga Region) Federal University, 420008, Kazan, Russian Federation
Bacillus bacteria are soil saprophytes, facultative anaerobes that develop in the temperature range of 28-37°С. 16S rRNA cataloging shows that these bacteria form a coherent class with broad variability of virulence. Bacillus phages can be extensively used for phagotyping bacteria in the process of soil, water, and food monitoring. Bacillus phages can also be used as vectors in horizontal
gene transfer and potential therapeutic agents. Thus, description of the biological diversity of the Bacillus phages can prove useful for further development of tools used in molecular biology and bio-medicine. In this work, the scheme for isolation of soil bacteriophages was unified, which allowed 10 bacillus phages to be isolated from different types of soil. It was shown that the number of phages depended on the soil fertility, decreasing as the soil changes from black earth to brown earth to gray forest soil to uncontaminated urban soil to oil-contaminated urban soil. A new polyvalent DNA-containing bacteriophage SRTOlhs of B. altitudinis (it is also able to infect B. subtilis, B. cereus, B. pumilus, but not B. licheniformis and B. atrophaeus) was described in detail. It has a typical structure: total length, 360 nm; icosahedrons-shaped head, 100 nm in diameter. several phages simultaneously attack a B. altitudinis cell by increasing the level of intracellular low-molecular RNA. Infection with the phage virtually eliminates the stationary growth phase of infected bacilli and leads to a permanent increase in the number of phages in cultural liquor, with the exception of the time period of high activity of the secreted ribonuclease.
Key words: soil phages, Bacillus, B. altitudinis, bacteriophage of B. altitudinis, intracellular RNA, secreted ribonuclease
For citation: Shah Mahmud R., Garifulina K.I., Ulyanova V.V., Evtugyn V.G., Mindubaeva L.N., Khazieva L.R., Dudkina E.V., Vershinina V.I., Kolpakov A.I., Ilinskaya O.N. Bacteriophages Of Soil Bacilli: New Multivalent Phage of Bacillus altitudinis. Molekulyar-naya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology 2017; 35(2):59-64. (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-2-59-64.
For correspondence: Raihan Shah Mahmud, Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan (Volga Region) Federal University, 420008, Kazan, Russian Federation; E-mail: raihan.shah@gmail. com
Acknowledgments. This work was performed within the framework of the Program of Competitive Growth of Kazan Federal University and partially supported by the Russian Science Foundation Grant No. 14-14-00522 (research into the interaction between bacteriophages and bacteria). Isolation and characterization of bacteriophages was performed within the framework of studies supported by the Russian Foundation for Basic Research Grant No. 15-04-07864 using the equipment of the Interdisciplinary Center for Collective Use of the Kazan Federal University.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 579.843.1:579.222]:577.21.08
Заднова С.П., Челдышова Н.Б., Крицкий А.А., Адамов А.К., Девдариани З.Л., Кутырев В.В.
сравнительный анализ метаболизма глюкозы в штаммах VIBRIO
CHOLERAE биовара эль тор
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"», 4100005, Саратов
Проведен сравнительный анализ ферментации глюкозы у типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, выделенных в Российской Федерации в 1970-1990 гг., и высоко вирулентных штаммов геновариантов, завезенных в 1993-2012 гг. Показано, что у геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с приобретением профага СТХ классического типа (или только его гена ctxB) и повышением вирулентности изменился метаболизм глюкозы, что фенотипически выражается в отсутствии роста на минимальной среде с добавлением 1 % углевода и сниженной способности к его ферментации до ацетоина в реакции Фогеса-Проскауэра. Возможные причины сниженного метаболизма глюкозы связаны с присутствием SNP в гене alsD, кодирующем фермент ацето-
Для корреспонденции: Заднова Светлана Петровна - д-р биол. наук, вед. науч. сотр. ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», 410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46; E-mail: [email protected]
лактат декарбоксилазу и входящим в als оперон, участвующим в образовании ацетоина, а также с увеличенной экспрессией регу-ляторного белка AphA, контролирующего биосинтез ацетоина. Ключевые слова: Vibrio cholerae; геноварианты; метаболизм глюкозы; образование ацетоина; экспрессия генов.
Для цитирования: Заднова С.П., Челдышова Н.Б., Крицкий A.A., Адамов А.К., Девдариани З.Л., Кутырев В.В. Сравнительный анализ метаболизма глюкозы в штаммах Vibrio cholerae биовара Эль Тор. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017; 35 (2): 64-69. DOI 10.18821/0208-0613-2017-352-64-69.
Начиная с 1961 г. и по настоящее время продолжается 7-я пандемия холеры, самая длительная (55 лет) из всех известных, вызванная типичными токсигенными штаммами Vibrio cholerae О1 серогруппы Эль Тор био-
вара [1]. В результате эволюции возбудителя в 90-х годах прошлого столетия появились и получили глобальное распространение высоко вирулентные генетически измененные варианты (или геноварианты) V. cholerae биовара Эль Тор. Геноварианты содержат в опероне ^АБ, кодирующем биосинтез холерного токсина (ХТ), ген с1хБ возбудителя предыдущей, 6-й, пандемии холеры - V сЫ1егае О1 серогруппы классического биовара [2]. Начиная с 1993 г., геноварианты V. сЫ1егае биовара Эль Тор завозятся на территорию России, вызывая как единичные случаи холеры, так и локальные вспышки болезни [3].
В организм человека возбудитель попадает с зараженной водой (пищей), проникает в тонкий кишечник и, продуцируя токсин-корегулируемые пили адгезии (ТКПА), колонизирует его. Затем начинается выработка ХТ, ответственного за развитие профузной диареи, приводящей к обезвоживанию организма. Биосинтез основных факторов патогенности - ХТ и ТКПА контролируется сложным каскадом, включающим ряд регуляторных белков (ТохЯ^, ТохТ, ТсрР/Н, AphA/B) и управляемым различными сигналами внешней среды [4,5]. Одной из важных сигнальных молекул является глюкоза [6]. Показано, что при отсутствии глюкозы в среде выращивания штаммы V. ^о1егае не продуцируют холерный токсин и у них снижается способность колонизировать кишечник [7, 8].
Кроме того, разная ферментация данного углевода штаммами классического и Эль Тор биоваров является одним из диагностических признаков, дифференцирующим биовары. Большинство типичных штаммов V. ^о1егае Эль Тор вибрионов полностью ферментируют глюкозу до ацетилметилкарбинола (ацетои-на), который выявляется в реакции Фогеса-Проскауэра (Ф-П). Классические вибрионы не способны ферментировать глюкозу до ацетои-на (Ф-П - отрицательная) [1]. В то же время вопросы ферментации глюкозы и образование ацетоина штаммами геновариантов V. ^о1егае биовара Эль Тор остаются малоизученными.
Учитывая важную роль глюкозы в проявлении вирулентных свойств и диагностике возбудителя холеры, цель нашей работы состояла в проведении сравнительного анализа метаболизма глюкозы в штаммах V с^1егае О1 серогруппы Эль Тор биовара, завезенных в разные годы на территорию Российской Федерации.
Материал и методы
Бактериальные штаммы и питательные среды. Исследования были проведены на 6 типичных штаммах и 19 штаммах геновариантов V с^1егае биовара Эль Тор. В качестве контрольных были использованы 3 штамма V сЫ1егае классического биовара (см. таблицу). Штаммы хранились в Государственной коллекции патогенных бактерий при ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов) в лиофильно высушенном состоянии. Для культивирования бактерий использовали агар ЬВ (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% ПС1, рН 7,0), бульон АК1 (1,5% бакто пептон, 0,4 % дрожжевой экстракт, 0,5% ПС1, 0,3% №НС03, рН 7,8) и минимальный агар (2% бакто агар, 0,1 % Mg S04, 0,5% ШС1, 0,1% К2НР04, 0,1% (ПН^04, рН 7,4).
Способность штаммов V Ло1егае ферментировать глюкозу
Штамм V. ско1вгав Место и год выделения Реакция Фогес-Проскауэра* Рост на минимальной среде с глюкозой**
0,4% 0,5% 1%
Типичные Эль Тор вибрионы
М818 Саратов, 1970 полож. + + +
М713 Москва, 1970 полож. + + +
М738 Пермь, 1970 полож. + + +
М888 Астрахань, 1970 полож. + + +
М1261 Пермь, 1990 полож. + + +
М1013 Башкирия, 1972 полож. + + +
Геноварианты Эль Тор
М1264, М1272 Краснодар, 1993 с/п. + ± -
М1270 Татарстан, 1993 с/п. + ± -
М1275, М1297 Дагестан, 1993 с/п. + ± -
М1293 Дагестан, 1994 отр. + ± -
М1266 Пермь, 1994 с/п. + ± -
М1269 Магнитогорск, 1994 с/п. + ± -
Р17644 Ачинск, 1997 с/п. + ± -
Р17645 Иркутск, 1997 с/п. + ± -
М1344, М1345 Казань, 2001 с/п. + ± -
М1429 Башкирия, 2004 с/п. + ± -
М1430 Тверь, 2005 с/п. + ± -
Р18899 Мурманск, 2006 с/п. + ± -
Л3226, Л4150 Москва, 2010 с/п. + ± -
301 Таганрог, 2011 с/п. + ± -
М1509 Москва, 2012 отр. + ± -
Штаммы классического биовара
М29 Астрахань, 1942 отр. + ± -
569В Индия, 1950 отр. + ± -
Дакка 35 Пакистан, 1958 отр. + ± -
Примечание. * - полож. - положительная реакция, с/п - слабо положительная, отр. - отрицательная реакция; ** - «+» - хороший рост; «±» - слабый
рост; «-» - рост отсутствовал.
Ферментация глюкозы. Способность ферментировать глюкозу изучали, культивируя штаммы на минимальном агаре с добавлением различных концентраций данного углевода (0,4, 0,5, 1%) в качестве единственного источника питания. При положительном результате наблюдали рост культуры, при отрицательном - его отсутствие.
Образование ацетоина. Наличие ацетоина в среде определяли путем постановки реакции Ф-П. Исследуемые штаммы выращивали в глюкозо-фосфатном бульоне Кларка (0,5% пептон, 0,5% глюкозы, 0,5% К2НР04). Если штамм ферментировал глюкозу до ацетилметил-карбинола, то последний давал специфическую реакцию с а-нафтолом и выявлялся в присутствии щелочи. При положительной реакции среда окрашивалась в малиновый цвет, при отрицательной - оставалась светло-желтой [9].
Определение продукции холерного токсина. Исследуемые штаммы выращивали в условиях оптимальных для биосинтеза ХТ штаммами Эль Тор вибрионов - в колбах объемом 100 мл с 10 мл АК1 бульона, стационарно при температуре 370С в течение 16-19 ч [10]. Для количе-
18-1
Штаммы
Рис. 1. Продукция холерного токсина штаммами V. cholerae биовара Эль Тор при выращивании в среде без добавления глюкозы (левый столбик) и в присутствии 1% глюкозы (правый столбик).
MS1S, М712, М1261 - типичные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор; М1266, М1270, М1345, Л3226,М1509, М1429 - штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор. По оси абсцисс - названия штаммов; по оси ординат - количество холерного токсина (XT мкг/мл).
ственного определения продукции XТ применяли метод иммуноферментного анализа GMj-ELISA [11], используя 96-луночные пластиковые планшеты. В качестве контроля использовали очищенный холерный токсин («Sigma», США) известной концентрации. В иммуноферментном анализе применяли кроличьи антитоксические антитела и антикроличьи IgG, конъюгированные пероксидазой (Biomedicals). В качестве субстрата использовали AВТS (2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) в цитратном буфере (рН 4,0,) с добавлением перекиси водорода. Измерение оптической плотности проводили на фотометре «Stat Fax 2100» (США) при длине волны 405 нм.
Изучение экспрессии генов методом ОТ ПЦР в режиме реального времени. Выделение тотальной РНК из биомассы проводили с помощью набора SV Total RNA Isolation System («Promega», США). Концентрацию и степень очистки полученных препаратов РНК определяли на спектрофотометре Biowave DNA (BioChrom Ltd, Англия). Обратную транскрипцию для получения кДНК на матрице мРНК проводили с использованием комплекта реагентов «Реверта» (InterLabServis, Россия). В качестве стандартов для построения калибровочной кривой использовали разведения плазмидной ДНК (от 107 до 103 копий/мкл) штамма E. coli T0P10, содержащего плазмиду pCR2.1 с клонированным участком гена aphA (праймеры: GATGCAACCGGGTACGATATAA/ TCTGGTTTGCCTTCCTGTG, зонд aphAF/R - (FAM)-ACGATATACCTGCTGATGGCTGGC-(BHQ1)). В качестве референсного гена был использован recA (праймеры recA-F/R ACGGGTAACCTCAAGCAATC/TATC-CAAACGAACAGAAGCG; зонд recA-F/R - (FAM) CCACTGGCGGTAACGCACTGA-(BHQ1). Определение экспрессии генов проводили на приборе Rotor-Gene Q5 plex (QiagenInc, GMBH, Германия) с праймерами и Taq-Man зондами, синтезированными в ЗАО «Синтол» (Россия). Программа амплификации включала: 1 цикл 95oC 5 минут; 35 циклов - 95oC - 15 с, 60oC - 60 с. Оценку экспрессии исследуемых генов проводили методом 2ДДСт [12]. ПЦР проводили в двух повторах на независимо полученных трех образцах кДНК. Для статистической обработки использовали программу Microsoft Excel 2010.
Результаты и обсуждение
Влияние глюкозы на рост штаммов V сЫ1егае биовара Эль Тор и биосинтезХТ. На первом этапе работы было изучено влияние глюкозы на рост штаммов V. ^о1егае. Как известно, глюкоза является основным субстратом, который используется в качестве источника питания и получения энергии у большинства микроорганизмов, в том числе и у холерного вибриона. Согласно данным литературы типичные штаммы Эль Тор вибрионов хорошо растут в присутствии больших концентраций глюкозы (до 3%), в то же время штаммы классических вибрионов очень чувствительны к содержанию глюкозы и при концентрации 1% их рост прекращается [8]. Сведения о влиянии глюкозы на рост штаммов геновариантов V сЫ1егае биовара Эль Тор и биосинтез холерного токсина в литературе отсутствуют. Для изучения влияния глюкозы штаммы помещали в среды с разным содержанием данного углевода. В результате установлено, что при концентрации глюкозы 0,4% в минимальной среде выращивания все штаммы давали хороший рост. В то же время при увеличении концентрации глюкозы до 0,5% у геновариантов наблюдался слабый рост, а при концентрации 1% вырастали только типичные штаммы Эль Тор вибрионов, а геноварианты, как и классические вибрионы, не давали роста (см. таблицу). Однако культивирование штаммов геновариантов в богатых питательными веществами средах (бульон ЬВ + 1% глюкозы) не оказывало существенного влияния на их рост. Возможно, присутствие высоких концентраций глюкозы во внешней среде (что является маловероятным событием) приведет к снижению роста штаммов геновариантов, в то время как при попадании в кишечник человека, содержащего высокие концентрации глюкозы, популяция данных изо-лятов будет активно увеличиваться.
Далее было изучено влияние глюкозы на биосинтез холерного токсина. В результате установлено, что в присутствии глюкозы биосинтез ХТ в штаммах геновариан-тов, так же как и у типичных Эль Тор вибрионов, увеличивается. При этом у типичных штаммов продукция ХТ возрастала в 1,2—1,7 раза, у геновариантов - в 1,3-1,8 раза (рис. 1).
Необходимо отметить, что глюкоза наряду с электролитами (соли) входит в состав растворов для перораль-ной регидратации, используемых для лечения больных холерой, способствуя активному усвоению воды и солей ворсинками кишечника [13]. Эффективность перораль-ной регидратации при холере доказана и позволяет предотвратить сильное обезвоживание организма и ацидоз. Однако при лечении больные получают большие объемы регидратационного раствора (РР) с глюкозой, что создает благоприятные условия для повышения вирулентности штаммов V. с^1егае, находящихся в кишечнике [6,14]. Важно, что еще в 2002 г. ВОЗ рекомендовала уменьшить содержание глюкозы в РР до 75 мМ (вместо применяемых 111 мМ) [15] Однако даже снижение концентрации глюкозы до 50 мМ (примерное содержание данного углевода в кишечнике) не приводит к снижению экспрессии генов холерного токсина, поэтому зарубежные исследователи предлагают заменить глюкозу в РР на другие углеводы, в том числе крахмал, который не оказывает влияние на биосинтез ХТ [16,6]. Показано, что использование крахмала в регидратационных растворах при эпидемии холеры на некоторых территориях Республики Гаити приводило к снижению случаев заболевания в сравнении с местностью, где были использованы обычные РР на основе глюкозы [6]. Учитывая данные о влиянии глюкозы на повышение биосинтеза ХТ ис-
Рис. 2. Результаты реакции Фогеса-Проскауэра (образование
ацетилметилкарбинола) штаммами V. Ло1егае. 1 - V. с^1вгав 569В классического биовара (светло-желтое окрашивание среды - отрицательная реакция); 2 - штамм геноварианта V. сЬоЫгав М1293 биовара Эль Тор (светло-желтое окрашивание среды - отрицательная реакция); 3 - штамм геноварианта V. с^1вгав М1275 биовара Эль Тор (темно-розовое окрашивание среды - слабоположительная реакция); 4 - типичный штамм V. с^1вгав М1261 биовара Эль Тор (малиновое окрашивание среды - положительная реакция).
следуемыми штаммами геновариантов V. сквкгае биовара Эль Тор, мы также считаем целесообразным замену глюкозы на крахмал в регидратационных растворах.
Способность образовывать ацетилметилкарбинол. На следующем этапе работы была исследована способность штаммов геновариантов образовывать ацетилметилкарбинол из глюкозы в реакции Фогес-Проскауэра. Как известно, метаболизм глюкозы у классических и Эль Тор вибрионов отличается. Типичные Эль Тор вибрионы полностью ферментируют глюкозу до ацетилметилкарбинола (и далее до диацетила или 2,3-бутандиона), который имеет нейтральный рН. Классические вибрионы разлагают глюкозу до органических кислот (молочная, уксусная, муравьиная), которые сильно закисляют среду. Поскольку холерный вибрион является кислото-чувствительным организмом, снижение рН среды при росте в богатой углеводами среде (кишечник человека, хитин-содержащие поверхности ракообразных в водной среде) оказывает ингибирующее влияние на рост и размножение классических вибрионов [8]. Наоборот, Эль Тор вибрионы достигают высокой плотности в данных условиях существования, что дает им преимущества для выживания. Было высказано предположение, что продукция ацетоина Эль Тор вибрионами была эволюцион-но выгодной и явилась одной из причин вытеснения ими штаммов классического биовара и быстрого распространения холеры Эль Тор по всему миру [4, 8].
В результате проведенных исследований выявлено, что все изученные типичные штаммы V. скв1егае биовара Эль Тор давали положительную реакцию Ф-П (малиновое окрашивание), что указывает на их способность полностью разлагать глюкозу до ацетилметилкарбинола (см. таблицу, рис. 2, дорожка 4). Штаммы классического биовара не образовывали ацетилметилкарбинол и давали отрицательную реакцию Ф-П (см. таблицу, рис. 2, дорожка 1). Исследованные штаммы геновариантов V сНв1егае биовара Эль Тор формировали две группы. Изоляты первой группы (М1293, М1509), как и штаммы классических вибрионов, не ферментировали глюкозу до ацетилметил-карбинола и давали отрицательную реакцию Ф-П (см. таблицу, рис. 2, дорожка 2). У второй, наиболее многочисленной группы штаммов, наблюдали темно-розовое окрашивание среды, что учитывается как слабоположительная реакция (см. таблицу, рис. 2, дорожка 3). Полученные на-
ми результаты согласуются с данными зарубежных исследователей, показавших, что штаммы геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор, выделенные в Бангладеш (Матлаб, 2001-2005 гг.) и на острове Гаити (2010 г.), также давали слабо положительную реакцию Ф-П [17].
Итак, полученные нами результаты показывают, что у изученных штаммов геновариантов, завезенных как в период их появления (1993 г.), так и в настоящее время, изменен процесс ферментации глюкозы, что фенотипи-чески выражается в отсутствии роста на минимальной среде с добавлением 1% глюкозы и сниженной способности к ферментации данного углевода до ацетоина в реакции Фогеса-Проскауэра.
Анализ кластера генов, участвующих в образовании ацетоина. Для установления причины слабой ферментации глюкозы штаммами геновариантов нами проведен анализ нуклеотидной последовательности генов, участвующих в биосинтезе ацетоина. Как известно, als оперон, необходимый для биосинтеза ацетоина, расположен на I хромосоме и включает 6 генов (рис. 3). Роль транскрипционного регулятора принадлежит гену alsR, гены alsD и alsS кодируют соответственно ацетолактат декарбоксилазу и синтазу, alsO — оксидо-редуктазу. Гены acgA и acgB отвечают соответственно за биосинтез белков с EAL (фосфодиэстеразным) и GGDEF (дигуанилат циклазным) доменами и не требуются для продукции ацетоина. Данные белки регулируют содержание циклического дигуанилата (c-di-GMP) и необходимы для формирования биопленки, а также подвижности. Между генами alsO и acgA расположен ро-зависимый терминатор, останавливающий транскрипцию генов. Необходимо отметить, что делеция в генах alsR и alsS в типичном штамме V cholerae С6706 Эль Тор биовара приводила практически к полному отсутствию биосинтеза ацетоина. В то же время при повреждении alsD и отсутствии ацетолактат декарбок-силазы возможно спонтанное декарбоксилирование ацетолактата в ацетоин, что выражается в наличии слабоположительной реакции Ф-П [9].
Анализ нуклеотидных последовательностей полных генов секвенированных ранее штаммов V. cholerae М29 (Астрахань, 1942) и Дакка 35 (Пакистан, 1958) классического биовара, а также референс-штамма V. cholerae О395 классического биовара относительно референс-штамма V. cholerae N16961 Эль Тор биовара показал, что штаммы классического биовара имеют 2 несинонимические замены в гене alsR (G/A в позиции 202 со сменой аминокислоты аланина на треонин и С/Т в позиции 334 со сменой аргинина на цистеин) и 1 несинонимичную замену в гене alsS (G/A в позиции 430 со сменой аминокислоты изолейцина на валин). Таким образом, вполне вероятно, что выявленные SNP в генах, кодирующих регуляторный белок и оксидоредуктазу, привели к отсутствию способности штаммов классического биовара продуцировать ацетоин.
Далее был проведен анализ нуклеотидных последовательностей als кластера у штаммов V. cholerae биовара Эль Тор. В результате выявлено, что у типичного
TATACACACAGATTCATA
Рис. 3. Структура als оперона [9].
Выделен сайт связывания с регуляторным белком AphA, расположенный между генами alsR и alsD.
Штаммы
Рис. 4. Относительный уровень транскрипции гена aphA в штаммах V. cholerae. М818, М713 - типичные штаммы V. cholerae биовара Эль Тор. М1264, М1429, М1509, М1275 - геноварианты V cholerae биовара Эль
Тор.
569В - V. cholerae классического биовара. По оси абсцисс - штаммы; по оси ординат - относительное количество
мРНК.
штамма V. cholerae М888 (Астрахань, 1970) Эль Тор биовара последовательность генов была идентична референс-штамму V cholerae N16961 Эль Тор биовара. В то же время в штаммах геновариантов, завезенных в разные годы на территорию России - М1275 (Дагестан, 1993), М1293 (Дагестан, 1994), М1429 (Башкирия, 2004), Р18899 (Мурманск, 2006), Л3226 (Москва, 2010), М1509 (Москва, 2012) в позиции 315 гена alsD выявлена делеция одного тиминового нуклеотида, что приводит к сдвигу рамки считывания и биосинтезу фермента со сниженной биологической активностью (Ф-П в данном случае будет слабоположительной). Возможно также, что при отсутствии ацетолактат де-карбоксилазы происходит процесс спонтанного декар-боксилирования ацетолактата. Таким образом, один из механизмов сниженной способности штаммов гено-вариантов V cholerae биовара Эль Тор к ферментации глюкозы связан с выявленной SNP в гене alsD, кодирующим ацетолактат декарбоксилазу.
Однако нельзя исключить и присутствие других механизмов, оказывающих влияние на биосинтез аце-тоина в штаммах геновариантов. Согласно данным литературы, продукция ацетилметилкарбинола непосредственно контролируется белком АрhA, который является одним из центральных регуляторов экспрессии генов вирулентности [9]. Данный белок повышает транскрипцию генов, кодирующих биосинтез холерного токсина, подавляя при этом образование ацетилме-тилкарбинола. Промоторный регион для связывания АрhA находится между генами alsR и alsD (см. рис. 3). В штаммах холерного вибриона классического биовара, отличающихся от Эль Тор вибрионов повышенным биосинтезом холерного токсина, АрhA более активно подавляет продукцию ацетилметилкарбинола [8]. Ранее установлено, что геноварианты, в отличие от типичных Эль Тор вибрионов, синтезируют повышенное количество холерного токсина, приближаясь по данному показателю к классическим вибрионам [18-20]. Возможно, у геновариантов произошло изменение ре-гуляторных механизмов, в том числе увеличилась продукция белка АрhA, но снизился биосинтез ацетоина. Для проверки высказанного предположения был про-
веден сравнительный анализ экспрессии гена aphA методом ОТ ПЦР в режиме реального времени.
Анализ экспрессии гена aphA. Для проведения сравнительного анализа экспрессии гена aphA у штаммов V. cholerae биовара Эль Тор было исследовано 4 штамма геноварианта (М1264, М1275, М1429, М1509), завезенных в разные годы на территорию России, а также 2 типичных штамма (М888 и М713) (см. таблицу). В качестве контроля использовали штамм V. cholerae 569В классического биовара. В результате было установлено, что максимальная экспрессия гена aphA, как и ожидалось, наблюдалась у классического штамма (рис. 4). У штаммов геновариантов экспрессия гена aphA превышала экспрессию данного гена у типичных штаммов М888 и М713 на 17-49% (см. рис. 4). Таким образом, экспрессия гена aphA у исследованных штаммов геновариантов V cholerae биовара Эль Тор выше, чем у типичных Эль Тор вибрионов. Возможно, это также явилось одной из причин снижения биосинтеза ацетоина данными изолятами.
Итак, в результате проведенных исследований показано, что у геновариантов V. cholerae биовара Эль Тор с приобретением профага СТХ классического типа (или только гена ctxB) и повышением вирулентности изменились процессы метаболизма, в том числе способность к ферментации глюкозы. При этом выявлены два предполагаемых механизма, приводящие к снижению метаболизма глюкозы: 1) наличие SNP в гене alsD, кодирующем фермент ацетолактат декарбоксилазу; 2) повышение экспрессии регуляторного белка AphA.
Благодарности. Авторы выражают благодарность ст. науч. сотр. лаборатории геномного и протеомно-го анализа Гусевой Н.П. за проведение исследований по фрагментарному секвенированию гена alsD в штаммах геновариантов.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕ РАТ У РА / REFERENCES
1. Kaper J.B., Morris J.G., Levine M.M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8: 48-86.
2. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A., Kamruzzaman M., Siddique A.K., Sack D.A. New variants of Vibrio cholerae 01 biotype EL Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40: 3296-9. DOI: 10.1128/JCM.40.9.3296-3299.2002
3. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Шашкова А.В., Кутырев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, завезенных на территорию России в современный период. Молекул. генетика. 2011; (4): 11-8. / Smirnova N.I., Zadnova S.P., Shashkova A.V., Kutyrev V.V. Genome variability in the altered variants of Vibrio cholerae biovar El Tor isolated in Russia. Molekul. genetika. 2011; (4): 11-8. (in Russian)
4. Matson J.S., Withey J.H., DiRita V. J. Regulatory networks controlling Vibrio cholerae virulence gene expression. Infect. andImmun. 2007; 75: 5542-9. DOI: 10.1128/IAI.01094-07
5. Faruque S.M., Nair G.B. Vibrio Cholerae Genomics and Molecular Biology. Norfolk: Caister Academic Press; 2008.
6. Kuhn J., Finger F., Bertuzzo E., Borgeaud S., Gatto M., Rinaldo A. et al. Glucose- but not rice-based oral rehydration therapy enhances the production of virulence determinants in the human pathogen Vibrio cholerae. PLoS Negl. Trop. Dis. 2014; 8(12): e3347. D0I:10.1371/ journal.pntd.0003347
7. Callahan L.T., Richardson S.H. Biochemistry of Vibrio cholerae virulence III. Nutritional requirements for toxin production and the effects of pH on toxin elaboration in chemically defined media. Infect. and Immun. 1973; 7: 567-72.
8. Yoon S.S., Mekalanos J.J. 2,3-butanediol synthesis and emergence of the Vibrio cholerae El Tor biotype. Infect. and Immun. 2006; 74: 6547-56. DOI: 10.1128/IAI.00695-06
9. Kovacikova G., Lin W., Skorupski K. Dual regulation of genes
involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive LysR-type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 2005; 57: 420-33. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2005.04700.x
10. Iwanaga M., Yamamoto K. New medium for the production of cholera toxin by Vibrio cholerae Ol biotype El Tor. J. Clin. Microbiol. 1985; 22: 405-8.
11. Svennerholm A.M., Wiklund G. Rapid GMl-enzyme-linked immunosorbent assay with visual reading for identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin. J. Clin. Microbiol. 1983; 17: 596-600.
12. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ДДСТ Method. Methods. 2001; 25: 402-8. DOI: 10.1006/meth.2001.1262
13. Guarino A., Albano F., Guandalini S. Oral rehydration: toward a real solution. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2001; 33: S2-12.
14. Oh Y.T., Lee K.-M., Barl W., Raskin D.M., Yoon S.S. (p)ppGpp, a small nucleotide regulator, directs the metabolic fate of glucose in Vibrio cholerae. J. Biol. Chem. 2015; 290: 13 178-90. DOI: 10.1074/ jbc.M115.640466
15. WHO. New formula oral rehydration salts. WHO Drug Inform. 2002; 16: 113-203.
16. Dutta D., Bhattacharya M.K., Deb A.K., Sarkar D., Chatterjee A., Biswas A.B. et al. Evaluation of oral hypo-osmolar glucose-based and rice-based oral rehydration solutions in the treatment of cholera in children. ActaPaediatr. 2000; 89: 787-90. DOI: 10.1111/j.1651-2227.2000.tb00386.x
17. Son M.S., Megli C.J., Kovacikova G., Qadri F., Taylor R.K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2011; 49: 3739-49. DOI:10.1128/JCM.01286-11
18. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18 (1): 46-54. DOI: 10.1016/j. tim.2009.10.003
19. Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T., Hamabata T., Barman S., Koley H. et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and Classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 2010; 48: 4283-6. DOI: 10.1128/ JCM.00799-10
20. Заднова С.П., Шашкова А.В., Краснов Я.М., Смирнова Н.И. Фенотипический и генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор. Проблумы особо опасных инфекций. 2012; 1 (111): 57-61. / Zadnova S.P., Shashkova A.V., Krasnov Ya.M., Smirnova N.I. Phenotypic and genetic analysis of altered variants of Vibrio cholerae biovar El Tor. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2012; 1 (111): 57-61. (in Russian)
Поступила 02.08.16
Zadnova S.P., Cheldyshova N.B., Kritskii A.A., Adamov A.K., Devdariani Z.L., Kutyrev V.V.
COMPARATIVE ANALYSIS OF GLUCOSE METABOLISM IN STRAINS OF VIBRIO CHOLERAE, BIOVAR EL TOR
Federal Government Health Institution Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, 410005, Saratov, Russian Federation
Comparative analysis of glucose fermentation in typical strains of V. cholerae biovar El Tor isolated in the Russian Federation in 1970-1990 and highly virulent strains of genovariants imported in 1993-2012 was performed. It was demonstrated that the glucose metabolism of V. cholerae genovariants changed as the result of acquisition of classical CTX prophage (or only ctxB gene) and a corresponding increase in virulence. A phenotypical manifestation of these changes was a lack of ability to grow on a minimally nutrient medium supplemented with 1% carbohydrate, as well as compromised capacity for acetoin fermentation in the course of Voges-Proskauer reaction. Possible causes of the degraded glucose metabolism are associated with the presence of SNP in alsD gene that encodes acetolactate decarboxylase enzyme and is included into als operon, which, in turn, is engaged into acetoin generation, as well as with the hyper-expression of regulatory AphA protein controlling acetoin biosynthesis.
Key words: Vibrio cholerae, genovariants, glucose metabolism, acetoin generation, gene expression.
For citation: Zadnova S.P., Cheldyshova N.B., Kritskii A.A., Adamov A.K., Devdariani Z.L., Kutyrev V.V. Comparative Analysis of Glucose Metabolism in Strains of Vibrio cholerae, Biovar El Tor. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology 2017; 35(2):64-69. (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-2-64-69.
For correspondence: Svetlana Petrovna Zadnova, Dr. Biol. Sci., Leading research officer in the Laboratory of pathogenic vibrios, Federal Government Health Institution Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, 410005, Saratov, Russian Federation; E-mail: [email protected]
Acknowledgments. The authors are grateful to the senior research officer of the Laboratory of genomic and proteomic analysis N.P. Guseva for performing fragmentary sequence analysis of alsD gene in genovariant strains.
acknowledgments. The study had no sponsor support. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 579.852.11.083.18:577.21.08
Щит И.Ю.1, Игнатов К.Б.2,3, Кудрявцева Т.Ю.1, Шишкова Н.А.1, Миронова Р.И.1, Маринин Л.И.1, Мокриевич А.Н.1, Крамаров В.М.2,3, Бикетов С.Ф.1, Дятлов И.А.1
использование петлевой изотермической амплификации днк для выявления и идентификации сибиреязвенного микроба
1ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора,
142279, Оболенск, Россия; 2Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 117971, Москва, Россия; 'Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, РАН, 127422, Москва, Россия
Представлены результаты выявления и идентификации штаммов Bacillus anthracis в реакции петлевой изотермической амплификации ДНК (1AMP) с использованием оригинальных прайме-ров, оптимизированных условий и термостабильного фермента ДНК полимеразы. Показано, что реакция позволяет воспроизво-
Для корреспонденции: Александр Николаевич Мокриевич, канд. мед. наук, рук. отдела особо опасных инфекций ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, E-mail: [email protected]
димо выявлять мишени, специфичные для штаммов B. anthracis на хромосомной и плазмидной ДНК. Не обнаружено перекрестных реакций с ДНК из штаммов, относящихся к другим видам группы В. cereus. На основе оптимизированной реакции петлевой изотермической амплификации ДНК планируется создание удобных в применении и не требующих сложного оборудования тестов для клинической и полевой диагностики возбудителя сибирской язвы.
Ключевые слова: петлевая изотермическая амплификация ДНК; LAMP; Bacillus anthracis.
