CC BY
24
УДК 575:631.527 Л.И. Тихомирова
L.I. Tikhomirova
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ анализ гистогенеза и органогенеза в эксплантах
ГЕНЕРАТИВНЫХ ОРГАНОВ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА IRIS L. В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
COMPARATIVE ANALYSIS OF HISTOGENESIS AND ORGANOGENESIS IN EXPLANTS OF GENERATIVE ORGANS OF REPRESENTATIVES OF GENUS IRIS L.
IN CULTURE IN VITRO
Аннотация. При гистологическом исследовании установлено, что морфогенетические процессы в эксплантах генеративных органов in vitro культиваров Iris hybrida, I. ensata, I. sibirica проходят аналогично, что подтверждает близость данных видов ириса. Формированию очагов меристематической активности во всех эксплантах предшествует изоляция инициальной клетки и, в результате нескольких делений, образование по-лиады. Более высокая регенерационная активность трубки околоцветника по сравнению с другими экспланта-ми обусловлена образованием множественных зачатков побегов в пределах адаксильной меристемы. Побеги, образующиеся у всех типов эксплантов, имели эндогенное происхождение.
Ключевые слова: морфогенез, гистологический анализ, экспланты, культура in vitro, ось соцветий, трубка околоцветника.
Summary. On the basis of histological investigation, it is shown that morphogenetic processes in explants of generative organs in vitro of cultivars of Iris hybrida, I. ensata, and I. sibirica develop similarly which reflects the affinity of the studied species. Isolation of initial cell and subsequent formation of poliades precedes the formation of the centre of meristematic activity in all explants. The higher regenerative activity of perianth tube in comparison with other explants is provided by formation of a great number of shoot embryos within the adaxial meristem. Shoots, formed in all types of explants, had endogenous origin.
Key words: morphogenesis, histological analysis, explants, culture in vitro, inflorescence axis, perianth tube.
Ирисы принадлежат к числу наиболее популярных в цветоводстве травянистых многолетников. Многочисленные виды семейства Iri-daсeae стали размножать в культуре in vitro с тех пор, как классические способы вегетативного размножения с помощью корневищ и луковиц перестали удовлетворять потребности в количестве посадочного материала (Al-Gabbiesh et al., 2006).
Помимо коммерческих целей, культуру in vitro используют для изучения особенностей морфогенетических процессов. Великолепными моделями служат изолированные культуры органов, тканей и клеток, помещенные в контролируемые условия минерального питания, температуры, освещенности и экзогенных гормональных добавок. Растительные клетки способны in vitro в полной мере проявлять свой морфогенетический потенциал, вплоть до развития целого растения, причем контролируемые условия позволяют управлять этими процессами (Батыгина и др., 1978; Бутенко, 1984, 1990, 1994).
Методы гистологического анализа позволяют изучать морфогенез на тканевом уровне, а также управлять процессами регенерации, происходящими в эксплантах в культуре in vitro.
Цель исследований - сравнить методами гистологического анализа особенности прохождения морфогенеза у различных типов экс-плантов генеративных органов трёх видов ириса (I. sibirica L., I. ensata Thunb., I. hybrida Retz.).
Объекты, методы и условия исследований. Объекты исследований - перспективные сорта отечественной и зарубежной селекции и новые элитные гибриды трех видов ириса: I. hybrida, I.ensata, I. sibirica из коллекции НИИСС им. Лисавенко.
В качестве первичных эксплантов брали ось соцветия и трубку околоцветника. Для успешной регенерации важным моментом явилась стадия развития цветков на момент введения в культуру ткани. Цветки брали в фазе бутонизации (VII этап органогенеза), когда они плотно закрыты листочками обёртки. Стерилизацию
000<ХХХХХ>00<Х>0<Х><ХХХХ><ХХХХ>0<Х>000<ХХ>00000000000000000000000000000000<>000000000000000000000000000000000000000000000000000000<>00000000000000000000000000000000000000<>
Алтайский государственный университет, пр-т Ленина, 61; 656049, Барнаул, Россия; e-mail: [email protected] Altai State University, Lenina str. 61; 656049, Barnaul, Russia
Поступило в редакцию 27.02.2011 г.
Submitted 27.02.2011
материала проводили в условиях ламинар-бокса в два этапа. На первом этапе бутоны, смоченные в 96% этиловом спирте, обжигали в пламени спиртовки. Следующий этап обеззараживания проводили в 0,1% растворе сульфохлорантина в течение 20 минут. Подобный способ обеспечивал на 100% стерильность материала. Части цветка делили на фрагменты размером не более 3^3 мм и помещали на питательные среды.
Питательные среды готовили по прописи Мурасиге и Скуга (MS), содержащие 30 г/л сахарозы. В них вводили фитогормоны в разных концентрациях: l - нафтилуксусную кислоту (НУК) 3-5мкМ, индолил-3-масляную кислоту (ИМК) 1мкМ в сочетании с 6-бензиламинопу-рином (БАП) 1, 4, 6, 8 и 20мкМ; рН среды доводили до 5,8-5,9 и добавляли 0,6% агара. Среды разливали в пластиковые контейнеры (по 30 мл в каждый) или в культуральные флаконы (по 10мл в каждый). Автоклавировали приготовленные питательные среды в течение 20 мин. при 120° С. Всего было испытано 11 вариантов питательных сред, в варианте по 10 фрагментов каждой части цветка. Экспланты культивировали в условиях фотопериода 16/8 часов свет/темнота при 24-26° С.
Каждые 3-5 дней проводили наблюдения и делали гистологические срезы эксплантов. Выявляли регенерационную способность и пути морфогенеза, согласно существующей в настоящее время классификации путей морфогенеза (Батыгина и др., 1978). Анатомическое строение эксплантов изучали на временных и постоянных препаратах, изготовленных по общепринятой методике (Барыкина и др., 2004).
Результаты и их обсуждение. При гистологическом исследовании нами установлено, что морфогенетические процессы в эксплантах осевой природы (цветоносах) в культуре in vitro культиваров I. hybrida, I. ensata, I. sibirica проходят аналогично, что подтверждает близость данных видов ириса. Однако при большом сходстве прохождения морфогенетических процессов, обнаружены и некоторые различия.
Способность к дедифференциации и восстановлению меристематической активности в цветоносах ириса проявляют, прежде всего, клетки перицикла и нескольких прилегающих к нему внутренних слоёв первичной коры. Клеточные деления постепенно распространяются центробежно и центростремительно, вовлекая в этот процесс все слои клеток первичной коры, а также клетки обкладок проводящих пучков. По
всей видимости, это особенность рода Iris. У гиацинта и нарцисса, описанных ранее О. Чуриковой (2005), меристематическую активность в начале процесса регенерации проявляют клетки неповреждённого субэпидермального и нескольких прилегающих к нему наружных слоёв первичной коры.
Первые деления клеток эксплантов I. ensata и I. sibirica отмечали спустя 7 суток после помещения их на питательную среду. Экспланты I. hybrida обладают большей регенерационной активностью, первые полиады (несколько клеток под общей оболочкой) наблюдали на 4 сутки культивирования, а первые визуальные признаки геммогенеза - после 14 суток культивирования на данных питательных средах. Это на несколько дней раньше, чем у I. ensata и I. sibirica.
Формирование гидроцитной системы было выявлено только в эксплантах I. hybrida, у I. ensata и I. sibirica не наблюдали. Подобные васкулярные элементы отмечены ранее для гиацинтов, нарциссов, лилий (Чурикова, 2005; На-биева, 2008). Вероятно, это связано с местом обитания данных видов и условиями произрастания. Iris hybrida способен расти в условиях повышенной сухости верхних горизонтов почвы. Его ткани запасают воду при помощи проводящей системы. Произрастание I. ensata и I. si-birica исторически связано с переувлажнёнными почвами, и делать запасы воды в тканях нет необходимости.
Побеги и корни, развившиеся на эксплан-тах оси соцветия I. hybrida, I. ensata и I. sibirica, имели исключительно эндогенное происхождение (табл. 1).
При сравнении динамики прохождения этапов гистогенеза и органогенеза в эксплантах трубки околоцветника у культиваров I. hybrida, I. ensata, I. sibirica в основном была отмечена их синхронность.
Нами установлено, что регенерационной способностью обладала только адаксильная сторона трубки околоцветника. При помещении экс-планта на поверхность среды абаксильной стороной признаков регенерации не наблюдали за всё время культивирования. При гистологическом анализе отмечен разный уровень регенерационной активности тканей внешней и внутренней стороны трубки околоцветника у всех изученных культиваров I. hybrida, I. ensata, I. sibirica. В субэпидермальных слоях адаксильной стороны клетки паренхимы не утратили способности к меристематической активности. Именно здесь
Таблица 1
Этапы морфогенеза в эксплантах оси соцветия I. sibirica сорт Berlin Ruffles, I. ensata гибрид 28 и I. hybrida сорт Jazzamatazz на питательной среде с 8мкМ БАП и 3мкМ НУК
Время фиксации материала от момента введения в культуру in vitro Изменения, произошедшие в тканях экспланта
I. sibirica I. ensata I. hybrida
4 суток Кольцо перицикла отчётливо не выражено. Рост клеток паренхимы растяжением. Отмечен рост за счёт растяжения. Число клеточных слоёв паренхимы первичной коры не изменилось, осталось в пределах 15. Образование полиад в районе перицикла, в первичной коре, в обкладках проводящих пучков, прилегающих к перициклу.
7-12 суток Слой перицикла разрушен, в этой зоне формируются очаги деления. Выявляются полиады. Число паренхимных клеточных слоёв увеличилось с 12 до 18. В процесс деления включаются клетки первичной коры. Образуется сплошное кольцо деления в районе перицикла. В области перицикла была отмечена зона меристе-матической активности в виде сплошного кольца. Очаги деления в паренхиме первичной коры не одинаковой степени развития. За счёт роста и давления внутренних слоёв клеток край экспланта становится неровным. Отмечено образование полиад Делением затронуты все слои клеток первичной коры. Массовое деление клеток паренхимы, большое количество полиад, обособляются зоны деления клеток. За счёт разрастающихся внутренних тканей край экспланта становится не ровным.
15 суток Число клеточных слоёв паренхимы первичной коры уменьшилось до 12 за счёт вовлечения их в процесс деления и формирования новых очагов деления. Очаги меристематической активности разного размера. Крупные, их около 6 на один эксплант, мелких гораздо больше. Многорядный слой пери-цикла сохраняется. Мери-стематические очаги развиваются как в толще паренхимы первичной коры, так и с внешней стороны перицикла. От эпидермиса вглубь экс-планта просматривается единый массив делящихся клеток. Обособляются участки с формирующимися побегами de novo в области перицикла.
18 суток В первичной коре меристе-матические очаги возникают ближе к перициклу. На поверхности экспланта появляются побеги Первые визуальные признаки регенерации побегов на поверхности экспланта. Среди клеток паренхимы первичной коры наблюдаются клетки со спиралевидным утолщением клеточной стенки - гидроциты.
20 суток В области перицикла на поверхности экспланта появляются корни.
возникали полиады, из которых формировались множественные очаги деления и закладывались вегетативные побеги. На испытанных вариантах питательных сред с содержанием 4-8 мкМ БАП и 3-5 мкМ НУК отмечен геммогенез у 100% эксплантов всех изученных видов ириса.
У сформированных побегов, вместо при-мордиев первых листьев, развивались структуры, похожие на доли околоцветника. Со временем эти структуры приобретали характерную для цветков данного сорта окраску. Появление фло-ральных элементов в культуре эксплантов гене-
ративных органов описано рядом авторов (Ала-торцева и др., 2001; Болтенков, 2002; Вечернина и др, 2004; Чуб и др., 1994). Репродукция de novo элементов цветка устойчиво сохранялась у экс-плантов трубки околоцветника всех изученных генотипов ириса независимо от концентрации фитогормонов в пределах опыта. Отмеченный феномен циклического воспроизводства генеративных структур может быть интерпретирован как результат экспрессии регуляторных генов, запускающих определённые морфогенетические процессы (рис. 1).
Рис. 1. Флоральные элементы: а) I. sibirica, б) I. етаіа, в) I. hybrida.
При дальнейшем культивировании экс-плантов трубки околоцветника с целью получения активно пролиферирующей культуры необходимо было изменить гормональный состав питательных сред, определяющим в этом являлось содержание цитокининов. В отношении гормонального состава генотипы ириса проявляли видовую специфичность. Чтобы получить нормально развитые побеги I. иіЬігіеа, содержа-
ние БАП должно быть в пределах 5-7,5 мкМ, для I. ensata - 15-17,5 мкМ, для I. hybrida - 2,5 мкМ. Отличием также явилось заложение гид-роцитной системы у эксплантов I. hybrida сорт Jazzamataz; у I. sibirica сорт Berlin Ruffles и I. ensata гибрид 28 подобного явления не наблюдали (табл. 2).
Выводы. Морфогенетические процессы в культуре ириса in vitro на стадии введения про-
Таблица 2
Этапы морфогенеза в эксплантах трубки околоцветника I. sibirica сорт Berlin Ruffles, I. ensata гибрид 28 и I. hybrida сорт Jazzamatazz на питательной среде с 8мкМ БАП и 3мкМ НУК
Время фиксации материала от момента введения в культуру in vitro Изменения, произошедшие в тканях экспланта
I. sibirica I. ensata I. hybrida
4-7 суток Рост клеток паренхимы растяжением. С адаксиль-ной стороны край становится неровным за счёт делений клеток в субэпи-дермальной зоне. С адак-сильной стороны формируются очаги деления. Выявляются полиады. Рост растяжением. Клетки всех тканей значительно увеличились в размере. С адаксильной стороны край становится более неровным за счёт делений клеток в субэпидермальной зоне. Отмечено образование поли-ад с адаксильной стороны. Деление клеток в субэпи-дермальном слое, в зоне проводящих пучков, образование полиад. Зона деления распространяется вглубь экспланта, вовлекая всё больше клеточных слоёв.
10-13 суток Волна клеточных делений продолжает распространяется вглубь экспланта, в результате чего возникает обширная меристематиче-ская зона. Зона деления распространяется всё глубже в ткани, в результате чего возникает обширная мерис-тематическая зона. Обособление меристема-тических зон.
15-17 суток Одновременно наблюдаются меристематические очаги разного возраста, множественное заложение побегов и формирование их проводящей системы. Отмечены первые визуальные признаки регенерации и формирование побегов Образование побегов de novo. Образование гидроцитных узлов и тяжей. Формирование групп прокамбиаль-ных клеток.
20 суток Активный геммогенез. Задействованы практически все слои тканей экспланта. Активный геммогенез. Задействованы практически все слои тканей экспланта. Активный геммогенез. Задействованы практически все слои тканей экспланта.
ходят по типу ризогенеза, геммогенеза, геммо-ризогенеза.
Прохождение этапов морфогенеза различается у разных типов эксплантов и имеет большое сходство у одного типа эксплантов разных видов ириса.
На испытанных вариантах питательных сред с содержанием 4-8 мкМ БАП и 3-5 мкМ НУК отмечен геммогенез у 100% эксплантов трубки околоцветника всех изученных видов ириса.
Более высокая регенерационная активность трубки околоцветника по сравнению с дру-
гими эксплантами обусловлена образованием множественных зачатков побегов в пределах адак-сильной меристемы.
Формированию очагов меристематичес-кой активности во всех эксплантах предшествует изоляция инициальной клетки и, в результате нескольких делений, образование полиады.
Побеги, образующиеся у всех типов эксплантов, имеют эндогенное происхождение.
ЛИТЕРАТУРА
Алаторцева Т.А., Лобанова Л.П., Еналеева Н.Х. Репродукция de novo элементов гинецея в культуре неопыленных завязей и семяпочек табака // Вестник Башкирского ун-та. - Саратов, 2001. - С. 102-103.
Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г., Джалилова Х.Х., Ильина Г.М., Чубатова Н.В. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. - М.: Изд-во МГУ, 2004. - 312 с.
Батыгина Т.Б., Васильева В.Е., Маметьева Т.Б. Проблемы морфогенеза in vitro и in vivo. Эмбриогенез у покрытосеменных растений // Бот. журн., 1978. - Т. 63, № 1. - С. 87-110.
Болтенков Е.В. Изучение особенностей культивирования in vitro тканей дальневосточных видов рода Iris L. (Iridaceae) для использования в биотехнологии: Автореф. дисс. ... канд. с.-х. наук. - Владивосток, 2002. -19 c.
Бутенко Р.Г. Индукция морфогенеза в культуре тканей растений // Гормональная регуляция онтогенеза растений. - М., 1984. - С. 42-54.
Бутенко Р.Г. Состояние и перспективы изучения морфогенеза растений // Всесоюз. об-во физиологов раст., 1990. - Вып. 8. - С. 5-8.
Бутенко Р.Г. Клеточные и молекулярные аспекты морфогенеза растений in vitro // Чайляхян. чтение. Пущино: Пущинский НЦ, 1994. - С. 7-26.
Вечернина Н.А., Таварткиладзе О.К., Клементьева Л.А., Долганова З.В. Особенности регенерации и размножения растений рода Iris (Iridaceae) in vitro // Раст. ресурсы, 2004. - Т. 40, вып. 4. - С. 56-60.
Чуб В.А. Каллусогенез и морфогенез в культуре генеративных органов весеннецветущих видов Crocus L. // Физиология растений, 1994. - Т. 41, вып. 6. - С. 815-820.
Al-Gabbiesh A., HassawiD.S., AfifiF.U. In vitro propagation of еndagered Iris species // Journal of Biological Sciences, 2006. - Vol. 6, № 6. - P. 1035-1040.
