CC BY
22
УДК 575:631.527 Л.И. Тихомирова
L.I. Tikhomirova
ИЗУЧЕНИЕ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЭКСПЛАНТАХ ТРУБКИ ОКОЛОЦВЕТНИКА IRIS ENSATA THUNB. ПРИ РАЗМНОЖЕНИИ IN VITRO INVESTIGATION OF MORPHOGENETIC PROCESSES IN EXPLANTS OF PERIANTH TUBE OF IRIS ENSATA THUNB. UNDER PROPAGATION IN VITRO
Аннотация. Приведены результаты изучения морфогенетических процессов в эксплантах трубки околоцветника культиваров Iris ensata при размножении in vitro. Отмечено, что морфогенез происходит по типу геммогенеза, минуя стадию каллусообразования. Побеги, сформированные de novo, развивали флоральные элементы на месте примордиев первых листьев, имели типичное строение для однодольных растений и были исключительно эндогенного происхождения. Подобраны питательные среды для культивирования вегетативных побегов и их укоренения.
Ключевые слова: Iris ensata, морфогенез, размножение in vitro, геммогенез, трубка околоцветника.
Summary. Investigation results of morphogenetic processes in explants of perianth tube of cultivars of Iris ensata under propagation in vitro are presented here. It is noted, that morphogenesis runs similarly to gemmagenesis, without a stage of callus formation. Shoots, developed in vitro, formed floral elements at the place of primordium of the first leaves, had a structure typical for monocotyledonous plants, and were of endogenous origin. Nutritional media are selected for cultivation of vegetative shoots and their rooting.
Key words: Iris ensata, morphogenesis, propagation in vitro, gemmagenesis, perianth tube.
Японские ирисы, или Iris ensata. Группа объединяет сорта ириса мечевидного, или Кемп-фера. Сорта японских садовых ирисов отличаются низкой морозостойкостью, нуждаются в обильном поливе в период цветения. Сорта, выведенные в Японии, можно выращивать только в южных районах России, то же относится и ко многим сортам, выведенным в США. В настоящее время существует несколько сортов отечественной селекции Биолого-почвенного института ДВО РАН и НИИСС им. М.А. Лисавенко, пригодных для выращивания в средней полосе, и огромное количество безымянных сеянцев, реализуемых цветоводческими фирмами.
Для получения качественного посадочного материала лаборатории биотехнологии научно-исследовательских институтов разрабатывают технологии микроклонального размножения сортов I. ensata.
В исследованиях Е.В. Болтенкова (Биоло-го-почвенный институт ДВО РАН) были установлены особенности каллусогенеза и прямой регенерации побегов в культуре тканей органов цветка I. ensata. Отмечено, что эксплантами, способными к регенерации побегов, явились завязи и трубки околоцветников. Выявлено, что у
I. втаіа заложение адвентивных почек и развитие микропобегов происходит на базальном конце трубок околоцветника и на апикальном конце верхних и нижних частей завязи, причем на эксплантах трубки околоцветника этот процесс наблюдался чаще, а завязи были источником аномального развития. Ткани других цветочных органов побеги не регенерировали. Укоренить побеги не удалось. Разработаны рекомендации по биотехнологии клонального размножения растений в культуре первичного каллуса I. ensata и длительно пассируемой культуре (Болтенков, 2000).
В работе Л. Полковниковой (НИИСС) отмечено, что культивирование эксплантов трубки околоцветника I. ensata осложнялось выделением в питательную среду продуктов метаболизма. На 5-7 сутки от начала культивирования среда становилась коричневой, а через 8-10 суток все экспланты погибали. Замена основной питательной среды Мурасиге-Скуга на среду Гамборга и повышенная концентрация 6-бензиламинопу-рина (БАП) в сочетании с относительно низкой концентрацией нафтилуксусной кислоты (НУК) способствовала прямой регенерации почек из эксплантов, фрагментов долей околоцветника
0<ХХХХХХХХХХХХХХХ>00<Х>0<Х>00<ХХ>0000000000000000000000000000000000000000000000<>000000000000000000000000000000000000000000000000000000<>000000000000000000000000000000<>
Алтайский государственный университет, пр-т Ленина, 61; 656049, Барнаул, Россия; e-mail: [email protected] Altai State University, Lenina str. 61; 656049, Barnaul, Russia
Поступило в редакцию 27.02.2011 г.
Submitted 27.02.2011
Рис. 1. Развитие флоральных элементов у побегов на эксплантах трубки околоцветника I. ensata гибрид 15-244-97: а) абаксильная сторона, б) адак-сильная сторона.
Рис. 3. Анатомическое строение трубки околоцветника I. ensata гибрид 28 на 4-7 день развития: а) адаксильная, б) абаксильная сторона экспланта (увел. 10х10), в) полиады (увел. 10*40).
Рис. 2. Анатомическое строение трубки околоцветника I. ensata гибрид 28 на VI-VII этапе органогенеза: а) абаксильная, б) адаксильная сторона экс-планта (увел. 10*10).
Рис. 4. Анатомическое строение трубки околоцветника I. ensata гибрид 28 на 12 сутки развития: а) многочисленные полиады, б) усиление меристематической активности вдоль проводящих пучков (увел. 10*10).
Рис. 5. Анатомическое строение трубки око- Рис. 6. Формирование побегов de novo у труб-
лоцветника I. ensata гибрид 28 на 17-е сутки разви- ки околоцветника I. ensata гибрид 59 на 60-е сутки тия, побег, образованный de novo (увел. 10*10). развития на среде с 15 мкМ Б АП и 1 мкМ НУК.
I. ensata. Данные о количестве укорененных рас-тений-регенерантов I. ensata автор в своей работе не приводит (Полковникова, 2000).
Цель исследований - изучение морфогенетических процессов в эксплантах трубки околоцветника культиваров I. ensata при размножении in vitro.
Материалы и методы. В качестве растительного материала использовали гибриды
I. ensatа 2S, 15-244-97, 59 из коллекции НИИСС. Цветки брали в фазе бутонизации (VI-VII этап органогенеза), когда они плотно закрыты листочками обёртки. Трубку околоцветника делили на фрагменты размером не более 3*3 мм и помещали на питательные среды.
Питательные среды готовили по прописи Мурасиге и Скуга (MS) (Murashige, Skoog, 1962) и Гамборга (В5) (Gamborg et al., 1968), содержащие 30 г/л сахарозы. В них вводили фитогормоны в разных концентрациях: l - нафтилуксусную кислоту (НУК), 3-5 мкМ в сочетании с 6-бензи-ламинопурином (БАП) 4-S, 20 мкМ; рН среды доводили до 5,8-5,9 и добавляли 0,6% агара.
Каждые 3-5 дней проводили наблюдения и делали гистологические срезы эксплантов. Выявляли регенерационную способность и пути морфогенеза, согласно существующей в настоящее время классификации путей морфогенеза (Батыгина, Васильева, 2002). Анатомическое строение эксплантов изучали на временных и постоянных препаратах, изготовленных по общепринятой методике (Барыкина и др., 2004). Препараты просматривали на микроскопе МБ-30 do MPI-5 (Польша) при увеличении 10*10, 10*40. Фотографии были выполнены цифровым фотоаппаратом Sanyo VPC-S600.
Результаты и их обсуждение. Фрагменты трубки околоцветника I. ensata располагали на поверхность питательных сред по прописи Мурасиге и Скуга и Гамборга, содержащих 4-8 мкМ БАП и 3-5 мкМ НУК. В первые две недели культивирования все экспланты увеличились в размере и приобрели зелёную окраску. В наших опытах побурение питательной среды за счёт выделения продуктов метаболизма у I. ensata отмечено на среде MS и на среде В5, но гибели эксплантов в связи с этим мы не наблюдали. Регенерационная способность эксплантов зависела не от минерального состава питательной среды, а от количества и соотношения фитогормонов.
Экспланты располагали на питательной среде адаксильной стороной. При помещении экспланта на поверхность среды абаксильной
стороной признаков регенерации не наблюдали за всё время культивирования. Из ткани экспланта развивались структуры, похожие на доли околоцветника. Со временем эти структуры приобретали характерную для цветков данного сорта окраску (рис. 1). На всех испытанных питательных средах при культивировании эксплантов трубки околоцветника наблюдали 100% геммогенез.
При изучении анатомического строения наружной и внутренней стороны эксплантов трубки околоцветника был отмечен ряд существенных отличий. Абаксильная (наружная) сторона имеет клетки эпидермиса прямоугольной формы. Эти клетки образуют ровную наружную поверхность трубки околоцветника. Ядра клеток паренхимы небольшого размера относительно объёма клеток. Цитоплазма клеток основной ткани светлая, содержит небольшое количество крахмальных зёрен. Клетки эпидермиса адак-сильной (внутренней) поверхности образуют неровный край трубки околоцветника. Клетки паренхимы и эпидермиса меньших размеров по сравнению с таковыми у абаксильной стороны. Цитоплазма паренхимных клеток более плотная, содержит много включений, вероятно, крахмальных зёрен. В толще паренхимы отмечены зоны меристематической активности (рис. 2).
На 4-7 день культивирования эксплантов трубки околоцветника был отмечен рост растяжением. Клетки всех тканей значительно увеличились в размере. С адаксильной стороны край становится более неровным за счёт делений клеток в эпидермальной и субэпидермальной зоне. В этот период отмечено образование полиад с адаксильной стороны. С абаксильной стороны край ровный, клетки паренхимы крупные. Проводящие пучки хорошо сформированные (рис. 3).
На 11 сутки культивирования на адак-сильной стороне экспланта зона деления распространяется всё глубже в ткани, образуются многочисленные полиады. При этом зон деления неорганизованной ткани типа каллуса не наблюдается. Все системы тканей, характерные для данного органа, присутствуют. На поверхности клеток эпидермиса заметен слой кутикулы. Продольный срез адаксильной стороны экспланта позволяет отметить усиление меристематичес-кой активности вдоль проводящих пучков. Возможно, изначально устанавливается связь проводящей системы образующихся de novo побегов с таковой в материнском экспланте (рис. 4). На абаксильной стороне экспланта заметен только рост клеток растяжением.
Таблица
Этапы морфогенеза в эксплантах трубки околоцветника I. ensata гибрид 28 на питательной среде
с 8мкМ БАП и 3мкМ НУК
Время фиксации материала от момента введения в культуру in vitro Изменения, произошедшие в тканях экспланта
4-7 суток Рост растяжением. Клетки всех тканей значительно увеличились в размере. С адак-сильной стороны край становится более неровным за счёт делений клеток в суб-эпидермальной зоне. Отмечено образование полиад с адаксильной стороны.
10-13 суток Зона деления распространяется всё глубже в ткани, в результате чего возникает обширная меристематическая зона.
15-17 суток Отмечены первые визуальные признаки регенерации и формирование побегов
20 суток Активный геммогенез. Задействованы практически все слои тканей экспланта. Побеги, развившиеся на эксплантах трубки околоцветника I. ensata, имели исключительно эндогенное происхождение.
На 17 сутки культивирования на анатомических срезах адаксильной стороны отмечается множественное заложение побегов и формирование их проводящей системы. У экспланта чётко сохраняются все системы тканей. На адаксильной поверхности экспланта появляются выросты флоральной природы. У побега, образованного de novo, формируется своя покровная и основная ткань, проводящая система (рис. 5, табл. 1).
По своему анатомическому строению побеги, регенерированные из ткани трубки околоцветника I. ensata, имели типичное строение для однодольных растений. Единственным отличием было формирование флоральных элементов на месте примордиев первых листьев. Мы связываем это явление с тем, что заложившиеся в нулевом пассаже побеги в тканях флорального происхождения (трубке околоцветника), несут клетки, запрограммированные на флоральный геммогенез. Поэтому на каждом из этих побегов обязательно вместо листьев первыми развиваются венчиковидные структуры. Дальнейшая судьба побегов зависит от гормонального состава питательных сред в последующих пассажах. Если последующее культивирование проводить на средах введения в культуру in vitro, то есть не изменять их состав, венчиковидные структуры побуреют, побег прекратит своё развитие и в конечном итоге наступит гибель экспланта. Для стимуляции развития побегов необходимо увеличить содержание БАП в питательных средах
до 10-20 мкМ, а содержание НУК снизить до 1 мкМ (рис. 6).
Полученные таким образом вегетативные побеги пересаживали на среды для укоренения на основе MS, дополненные 3 мкМ НУК.
Выводы. 1. В эксплантах трубки околоцветника I. ensata на питательных средах с содержанием 4-S мкМ БАП и 3-5 мкМ НУК морфогенез проходил по типу геммогенеза, минуя стадию каллусообразования.
2. Анатомическое строение адаксильной стороны трубки околоцветника на VI-VII этапах органогенеза отличается от строения абаксильной стороны.
3. Меристематическая активность (возникновение полиад) в эксплантах трубки околоцветника I. ensata отмечалась, начиная с 7 дня культивирования, и была выявлена только с адаксильной стороны.
4. Побеги, развившиеся de novo, имели типичное строение для однодольных растений. Отличием явилось формирование флоральных элементов вместо примордиев первых листьев.
5. Побеги, развившиеся на эксплантах трубки околоцветника I. ensata, имели исключительно эндогенное происхождение.
6. Для дальнейшей стимуляции развития побегов необходимо содержание БАП в питательных средах 10-20 мкМ, а содержание НУК 1 мкМ.
7. Укоренять развившиеся побеги следует на средах на основе MS, дополненных 3 мкМ НУК.
ЛИТЕРАТУРА
Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г., Джалилова Х.Х., Ильина Г.М., Чубатова Н.В. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. - М.: Изд-во МГУ, 2004. - 312 с.
Батыгина Т.Б., Васильева В.Е. Размножение растений: учебник. - СПб.: Изд-во СПб. ун-та, 2002. -
232 с.
Болтенков Е.В. Изучение особенностей культивирования in vitro тканей дальневосточных видов рода Iris L. (Iridaceae) для использования в биотехнологии: Автореф. дисс. ... канд. с.-х. наук. - Владивосток, 2002. -19 c.
Полковникова Л.А. Перспективы культивирования ириса в условиях лесостепи Алтайского края. Дисс. ... канд. с.-х. наук. - Барнаул, 2000.
Gamborg O.Z., Willer R.A., Gima K. Nitrient requirement of suspension cultures of soybeant root cells // Exp. Cell Res., 1968. - Vol. 50, № 1. - P. 151-158.
Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassaya with Tobacco tissue cultures // Physiol. Plant., 1962. - Vol. 15, № 4. - Р. 473.
