4Uchinchi renessans yosh olimlari: zamonaviy vazifalar,
innovatsiya va istiqbol Young Scientists of the Third Renaissance: Current Challenges, Innovations and Prospects
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СУБСТАНЦИИ КАТАРКАНС С ЗАРУБЕЖНЫМИ АНАЛОГАМИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ
Н.Р.Джалилова
стажер исследователь Я.К Назирова
канд. фарм. наук, доцент, с.н.с. УзКФИТИ при Агентстве по развитию фармацевтической отрасли МЗ РУз,
Ш.Д.Мусаева младший начный сотрудник Республиканского центра онкологии и радиологии МЗ РУз. Узбекистан.
Введение. Онкологические заболевания представляют собой очень серьезную проблему для современной медицины. Ежегодно диагноз «рак» ставится каждому из 250 мужчин и каждой из 300 женщин, населяющих страну. Вероятность заболевания раком у людей растет по мере старения, и в возрасте старше 60 лет онкологические заболевания регистрируются в среднем уже у 3 человек на сотню населения. По данным ВОЗ, в Узбекистане, как и в других государствах, отмечается рост онкологических заболеваний. В настоящее время в Узбекистане состоит на учете более 100 тысяч онкологических больных. Онкологические заболевания требуют проведения дорогостоящих диагностических процедур, лечение их занимает много времени и сил, кроме того, больные, как правило, нуждаются в госпитализации. Поэтому является актуальным внедрению в медицинскую практику безвредных по отношению к организму эффективных средств противоопухолевого действия. Эти исследования осуществляются в рамках государственного гранта № ФЗ-202007215-«Разработка технологии производства противоопухолевых препаратов, полученных на основе растительного сырья СшкатаМш тояеш». Выполнение данной разработки позволит организовать производство отечественного противоопухолевого препарата, полученного на основе местного растительного сырья и тем самым уменьшить импорт препаратов аналогичного действия.
Материалы и методы. Катарканс -это субстанция полученная на основе местноиндуцированного лекарственного растения СаХкагаШт тояеш. Для
May 15, 2024
321
Uchinchi renessansyosh olimlari: zamonaviy vazifalar,
innovatsiya va istiqbol Young Scientists of the Third Renaissance: Current Challenges, Innovations and Prospects
изучения противоопухолевой активности субстанции использовали беспородные мыши, массой 20-22 г. содержащихся в пластмассовых клетках (по 6 в клетке) при стандартизированных условиях относительной влажности (5060%), температуры (220С) и светового режима (по 12 ч темноты и света), трипановый синий, солевой раствор, питательную среду КРМП640, 10%-ую телячью эмбриональную сыворотку (ТЭС). Асцитная карцинома Эрлиха (АКЭ), животная модель опухоли молочной железы, представляющая собой быстрорастущее недифференцированное злокачественное новообразование с очень агрессивным поведением, которая способна расти почти у всех видов мышей и часто используется в исследованиях рака. Мыши получали стандартный корм и питьевую воду аЬ НЬйиш. Все манипуляции с лабораторными животными проводились в строгом соответствии с Хельсинкской декларацией о гуманном отношении к животным (Всемирная Медицинская Ассоциация, Эдинбург, 2000 г.). Все операции при работе с ростовыми средами и препаратами проводили в стерильных условиях с использованием ламинарного бокса. Буферы были приготовлены на бидистиллированной воде, отфильтрованы через мембранные фильтры (0,22 мкм «МИНрог», Германия) и автоклавированы при 1,2 атм 30 мин. Стеклянная посуда перед использованием предварительно стерилизована при 1600С в течение 120 мин. Результаты исследований сопоставляли с контрольными образцами известных зарубежных аналогов цитостатиков -раствор винкристина и винбластина.
Экспериментальная часть. Произвели имплантацию опухолевых штаммов. Для этого опухоль выделили из места образования, в стерильных условиях субстрат гомогенизировали с 20-50 мл стерильной питательной средой КРМ1-1640. Полученный гомогенат вводят подкожно в бедро интактным животным массой 20-25 гр., объем гомогената 0,5-1,0 мл. В течении 16-21 дня проводили наблюдение за состоянием животных и ростом имплантированных опухолей, измеряя объем опухоли каждые 5 суток после имплантации. Пассирование штаммов проводили каждые 20 дней постоянно для сохранения штамма. Выделенные клетки АКЭ выдерживали в культуральных флаконах в ростовой среде ЯРМ11640 в инкубаторе при 37 °С, 5% С02 в течении 60 минут.
Использовали краситель трипанового синего для подсчета количества жизнеспособных клеток. Цитотоксичность катарканс и количество живых и мёртвых клеток подсчитывали методом окрашивания анилиновым красителем - трипановым синим. [1.34р]. Способ основан на том принципе, что данный
May 15, 2024
322
Uchinchi renessans yosh olimlari: zamonaviy vazifalar,
innovatsiya va istiqbol Young Scientists of the Third Renaissance: Current Challenges, Innovations and Prospects
краситель неспособен проникнуть в клетку через неповреждённую клеточную мембрану, поэтому живые клетки не окрашиваются. При повреждении мембраны трипановый синий окрашивает цитоплазму и клеточное ядро в интенсивный синий цвет, и такие окрашенные клетки считаются мёртвыми. Окрашивание клеток также облегчает визуализацию его морфологии [2.8с].
Для оценки цитотоксичности катарканс к клеткам асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) добавляли экстракт катарканс в 2-х концентрациях (1 мМ и 5 мМ) и инкубировали в течении 30 минут при 37°С. В качестве контроля использовали клетки АКЭ без добавления катарканс. Затем к 0,2 мл суспензии клеток добавляли раствор трипанового синего (0,1 мл 0,5% в 0,9%-м растворе хлорида натрия), инкубировали с красителем 10 минут и подсчитывали количество живых, мёртвых клеток и общее количество клеток. Живые клетки трипановый синий окрашивает по краям, мертвые - однородно по всей клетке.
Цитотоксический индекс (ЦТИ) рассчитывали по формуле: (число погибших клеток/общее число клеток) х 100%.
Для определения вышеперечисленных показателей образцы материала окрашивали трипановым синим на предметном стекле и исследовали. Фотосъемку препаратов производили при помощи встроенной цифровой камеры при увеличении 10х2,3 и 40х2,3, а разрешение полученных изображений - 2048x1536 пикселей.
Статистический анализ проводили с помощью GraphPad Prism 5.0 (Калифорния, США). Множественные сравнения средних значений были проведены с использованием теста ANOVA. Различия считались статистически значимыми при р <0,05.
Результаты и их обсуждение. Подсчёт живых и мёртвых клеток с помощью окраски трипанового синего показал, что в контроле подавляющее большинство клеток были живыми (96/100 клеток) (табл. 1. и рис.1). После инкубации клеток с катарканс, в концентрации 1 мМ в течение 30 мин количество живых клеток уменьшилось до 2/100, а количество мёртвых клеток выросло до 98/100. (рис.2). При использовании катарканс второй концентрации количество живых клеток уменьшилось до 50/100, а количество мёртвых клеток выросло до 50/100 (рис. 3.) [3. 307-315; 4. 8330-8341].
Это указывает на то, что соединения катарканс проявляют цитотоксические свойства в этих концентрациях, катарканс цитотоксический индекс составляет в среднем 75%.
323
May 15, 2024
Uchinchi renessansyosh olimlari: zamonaviy vazifalar,
innovatsiya va istiqbol Young Scientists of the Third Renaissance: Current Challenges, Innovations and Prospects
Таблица 1. Определение цитотоксичности катарканс на клетках асцитной карциномы Эрлиха
Группы Общее Количеств Количество Цитотоксически
количест о живых мертвых й индекс, %
во клеток клеток
клеток
Контроль 100 96 4 4
катарканс 1 мМ 100 2 98 98
катарканс 0,5 мМ 100 50 50 50
Рисунок 1. А- контроль
При проведении сравнительного анализа результатов исследований, с увеличением концентрации эсцина мы наблюдали снижение его цитотоксичности. Исследования показали, что 1 мм раствора катарканс было достаточно для критической концентрации образования Рисунок 3. Катарканс в дозе 0,5 мМ мицелл и следовательно, при пятикратном
Рисунок 2. Катарканс в дозе 1 м\/
увеличении концентрации эсцина,
пропорционального эффекта цитотоксического свойства не наблюдалось.
Выводы. При сравынительном изучении результатов исследования наблюдалось значительное снижение процента жизнеспособности опухолевых клеток под воздействием субстанции катарканс, а также повышению их агрегационных свойств благодаря воздействию как самой субстанции и индивидуального вещества различных концентраций. Субстанция требует
324
May 15, 2024
Uchinchi renessans yosh olimlari: zamonaviy vazifalar,
innovatsiya va istiqbol Young Scientists of the Third Renaissance: Current f — and,^
дальнейшего изучения в качестве нового фармацевтического средства для профилактики и лечения онкологических заболеваний.
REFERENCES
1. Aldubayan M.A., Elgharabawy R.M., Ahmed A.S., Tousson E. Antineoplastic Activity and Curative Role of Avenanthramides against the Growth of Ehrlich Solid Tumors in Mice//Oxidative medicine and cellular longevity.2019, 5162687. doi.org/10.1155/2019/5162687.
2. Абдувалиев А.А., Гильдиева М.С., Татарский В.П. Модификация метода прижизненного окрашивания клеток трипановым синим для определения апоптоза//Методические рекомендации. - Ташкент. - 2002. - 18 с.
3. Avelar-Freitas B.A., Almeida V.G., Pinto M.C., Mourâo F.A., Massensini A.R., Martins-Filho O.A., Rocha-Vieira E. Trypan blue exclusion assay by flow cytometry // Brazilian journal of medical and biological research. 2014, 47(4). P. 307-315. doi.org/10.1590/1414-431X20143437.
4. Tsibranska S, Ivanova A, Tcholakova S and Denkov N (2017) Self-Assembly of Escin Molecules at the Air-Water Interface as Studied by Molecular Dynamics. Langmuir 33:8330-8341.
325
May 15, 2024
