CC BY
65
УДК577.34- 576.32/36: 616-006.446
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОЙ ДИНАМИКИ ТРАНСКРИПТОМА РАКОВЫХ КЛЕТОК С НОРМАЛЬНЫМ И ДЕФЕКТНЫМ ГЕНОМ ТР53
© 2012 Ю.В. Саенко, В.В. Учайкин, Р.Т. Сибатов, В.В. Саенко, В.А. Остаточников, Е.В. Кожемякина, О.В. Ляпейкова, О.С. Воронова, Д.А. Евсеев, Н.В. Белозеров, С.А. Васильев, О.С. Глущенко, И.В. Живодерников,
Ульяновский государственный университет
Поступила в редакцию 20.11.2012
В данной статье проведено сравнительное изучение динамики изменения экспрессии генов ключевых сигнальных путей связанных с программируемой клеточной смертью и репарацией ДНК в раковых клетках с нормальным и мутантным геном ТР53.
Ключевые слова: апоптоз, ген ТР53, репарация ДНК, экспрессия генов, транскриптом, рак, радиация.
Устойчивость злокачественных образований к курсам лучевой терапии связывают с нарушением механизмов запуска программируемой клеточной смерти, которые инициируются в результате повреждения ДНК клеток. Причина этого кроется в том, что раковые клетки несут мутации в ключевых генах, ответственных за эти процессы. Наиболее частой мутацией является мутация гена р53, кодирующего одноименный белок, который играет ряд ключевых ролей в механизмах инициации клеточной смерти, регуляции клеточного цикла и репарации ДНК [9]. Этот тип мутаций встречается в более чем 50% раковых клеток. Белок р53 является ключевым в процессах запуска апоптоза и опосредует передачу сигналов от ДНК-репарирующих механизмов [2, 3, 5]. Клетки дефицитные по белку р53 более устойчивы к воздействию ряда ДНК-повреждающих агентов,
Саенко Юрий Владимирович кандидат биологических наук, старший научный сотрудник НИТИ. E-mail: [email protected]
Учайкин Владимир Васильевич, доктор физико-математических наук, профессор, заведующий кафедрой теоретической физики.
Сибатов Ренат Тимергалиевич кандидат физико-математических наук, доцент кафедры теоретической физики. Саенко Вячеслав Владимирович кандидат физико -математических наук, доцент кафедры теоретической физики. Остаточников Владимир Александрович, аспирант, младший научный сотрудник НИТИ.
Кожемякина Елена Владиславовна, техник-лаборант
кафедры теоретической физики.
Ляпейкова Ольга Васильевна, аспирант.
Воронова Ольга Сергеевна, кандидат биологических наук,
младший научный сотрудник НИТИ.
Евсеев Дмитрий Александрович, студент.
Белозеров Никита Вячеславович, студент.
Васильев Степан Андреевич, студент.
Глущенко Евгения Сергеевна, аспирант, младший научный
сотрудник НИТИ.
Живодерников Иван Владимирович, студент.
в том числе и к воздействию рентгеновского и гамма-излучений [2]. Р53 является ключевым суп-рессором опухолей, который может подавлять развитие рака путём блокирования клеточного цикла или запуском программы апоптоза в ответ на множество различных вне- и внутриклеточных стрессовых сигналов [12]. Генетический анализ опухолевых клеток человека продемонстрировал ключевую роль р53 в подавлении онкологических процессов. Больше половины опухолей человека, из всего широкого спектра типов, несут мутации гена ТР53, а наследование мутан-тного аллеля ТР53 делает его носителей предрасположенными к онкологическому синдрому Ли-Фраумени [10]. Продукт гена ТР53 - белок р53 ограничивает развитие опухоли, выступая в качестве своеобразного датчика клеточного стресса. Он реагирует на разнообразные стрессовые сигналы такие как: повреждение ДНК, гипоксия, экспрессию онкогенов, клеточное голодание и рибосомальная дисфункция. В случае возникновения подобных неблагоприятных условий р53 блокирует клеточную пролиферацию. В клетках подвергающихся мощному воздействию стрессовых факторов, р53 запускает необратимую программу апоптоза или старения, тем самым удаляя из организма потенциально злокачественные клетки [3]. Если стрессовые воздействия находятся в пределах способности клетки им противостоять, р53 участвует в запуске защитных программ, таких как временный арест клеточного цикла, репарации ДНК и синтеза белков антиоксидантной защиты. Это способствует поддержанию целостности генома и жизнеспособности в клетках, которые понесли поправимый ущерб от стрессовых факторов.
Таким образом, можно увидеть, что белок р53 играет ключевую роль практически во всех про-
цессах связанных с клеточным ответом на стресс и, в частности на радиационное воздействие. Изучение его роли в этих процессах поможет правильно выбрать тактику и стратегию терапии злокачественных новообразований с видоизменённым геном р53.
Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение динамики изменения экспрессии генов ключевых сигнальных путей связанных с программируемой клеточной смертью и репарацией ДНК в раковых клетках с нормальным и мутантным геном ТР53.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В экспериментах использовали клеточную линию рака прямой кишки человека HCT-116 (ATCC CLL - 247) с нормальным геном ТР53 -НСТ116 р53+/+ и изогенная клеточная линия HCT-116 с мутантным геном ТР53 - НСТ116 р53-/-. Клеточные линии были получены из American Type Culture Collection (ATCC). Клетки культивировали в модифицированной Дальбекко среде Игла с добавлением 5 % эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С, во влажной атмосфере содержащей 5 % СО2. Перед анализами клетки HCT-116 трипсинизи-ровались. Из культурального сосуда с клетками удалялась среду культивирования и добавлялся 0,025 % раствор трипсина в физиологическом солевом растворе. Клетки инкубировались в термостате при 37°С, 1—2 мин. Трипсинизацию останавливали добавлением 0,5—1 мл среды DM EM. Клетки облучали рентгеновским излучением генерируемым терапевтическим акселератором Cliniac 600 при комнатной температуре в дозах 4 Грэй одноразово. Мощность дозы составляла 0,03 Гр/с, при фокусном расстоянии 104 см. Высота водяного столба над клетками составляла 1см. Клетки облучались в 24 луночных планшетах (объём лунки 2,5 мл.).
Профили экспрессии генов в клетках НСТ116 р53+/+ и НСТ116 р53-/-облученных в дозе 4 Гр изучали через 1, 12 и 24 часа после облучения с использованием микроматрицы Affymetrix (Сан-та-Клара, Калифорния, США) серии HGU133A (Human Genome U133A) содержащую амплико-ны к 22216 генам.
РНК выделяли из 3х106 клеток с использованием набора для выделения РНК (RNeasy Mini, Qiagen, США) в соответствии с инструкцией производителя. Целостность выделенной РНК проверяли с использованием биоанализатора Agilent 2100 по целостности 18S и 28S рибосо-мальной РНК с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле. Библиотеку клонированных
ДНК готовили с использованием набора GeneChip Expression 3'-Amplification One-Cycle cDNA Synthesis Kit (Affymetrix). Мечение био-тином антисмысловых библиотек клонированных РНК и очистка были проведены с использованием набора GeneChip Expression 3'-Amplification Reagents for IVT Labeling (Affymetrix ) в соответствии с протоколом производителя. Количество полученной РНК и ДНК оценивалось спектрофотометрически с использованием спектрофотометра NanoDrop . Фрагментацию кРНК проводили при 94°C в термо-циклере в течение 35 минут. Синтезированные биотинилированные кРНК вначале гибридизи-ровали с контрольной матрицей "Test-3" с целью оценки качества полученныхкРНК. Если качество биотинилированных кРНК соответствовало расчётному то тогда проводили гибридизацию с матрицей HGUi33A. Матрицу окрашивали стрептовидин-фикоэритрином. Окрашенную матрицу отмывали от не связавшегося белка и сканировали на сканере Gene Array G2500A (Agilent,Santa Clara, CA, USA) [7].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В таблицах i и 2 отражено радиационно-ин-дуцированное изменение экспресии генов в клетках линий НСТ-П6 р53-/- и НСТ-П6 р53+/+ продукты которых участвуют в процессе регуляции программируемой клеточной смерти. В обеих клеточных линиях радиационное облучение индуцировало увеличение уровня мРНК прокас-паз 3,8 и 9. Сильнее всего рост экспрессии генов прокаспаз 3, 8 и 9 наблюдался через i час после облучения в дозе 4 Гр, а в случае линии НСТ-П6 р53-/- сохранялся и через 24 часа после облучения (таблЛ), тогда как в клетках линии НСТ-П6 р53+/+ он был выше контрольных значений на 2-4%. Отсутствие различий в активности каспаз можно объяснить тем, что эти белки секретиру-ются в форме про-ферментов, и для своей активации требуют отщепление определенных участков молекулы [6,8].
В клетках линии НСТ-П6 р53+/+ радиация стимулировала увеличение экспрессии генов TRADD и TRAFi, продукты которых белки -протеин ассоциированный с рецептором ФНО и фактор ассоциированный с рецептором ФНО участвуют в активации каспазы 8. Активация экспрессии генов TRADD и TRAFi происходит не сразу после облучения, а начинается через i2 часов и достигает максимальных значений через 24 часа после облучения. Таким образом, увеличение уровня экспрессии гена прокаспазы 8 в облученных клетках линии НСТ-П6 р53+/+ сопровождается увеличением экспрессии генов коди-
Таблица 1. Динамика изменения экспрессии генов в клетках линии НСТ-116 р53-/- продукты которых участвуют в процессе регуляции программируемой клеточной смерти. Данные представлены
как отношение уровня экспрессии гена в облученных клетках к уровню экспрессии гена в контрольной группе (К - контроль; 4Гр 1ч, 4Гр 12ч, 4Гр 24 ч - в данных стобцах указаны уровни экспрессии генов через 1,12 и 24 часа после облучения в дозе 4Гр)
Название гена Символ К 4Гр 1 ч 4Гр 12ч 4Гр 24ч
Прокаспаза 3 Casp3 1 1,18 1,16 1,12
Прокаспаза 9 Casp9 1 1,27 1,09 1,10
Прокаспаза 8 Casp8 1 1,10 1,19 1,06
Апоптоз-индуцирующий фактор AIFM1 1 1,08 1,03 1,15
Протеин ассоциированный с рецептором ФНО TRADD 1 0,97 0,97 0,98
Фактор ассоциированный с рецептором ФНО TRAF1 1 1,20 1,14 0,96
Эндонуклеаза G ENDOG 1 1,10 1,24 1,07
Проапоптотический белок Puma Puma 1 0,97 0,95 0,97
Проапоптотический белок Smac/Diablo DIABLO 1 1,08 1,05 1,02
Проапоптотический белок Apaf-1 APAF1 1 1,15 1,11 1,23
Проапоптотический белок Bim BCL2L11 1 0,90 0,94 0,98
Проапоптотический белок Bax BAX 1 0,90 0,86 1,01
Проапоптотический белок Bak BAK1 1 0,98 1,28 1,04
Проапоптотический белок Bnip-3 BNIP3 1 0,96 0,98 1,12
Проапоптотический белок Bad BAD 1 1,06 1,20 1,27
Катепсин A CTSA 1 0,89 0,89 0,90
Катепсин B CTSB 1 0,78 0,67 0,79
Катепсин D CTSD 1 0,68 0,72 0,82
Катепсин H CTSH 1 1,08 0,80 0,90
Катепсин K CTSK 1 1,28 0,76 0,86
Антиапоптотический белок Bcl-2 BCL2 1 1,17 1,02 0,97
Антиапоптотический белок Bcl-XL BCL2L1 1 0,70 0,66 0,91
Антиапоптотический белок MCL-1 MCL1 1 1,40 1,05 1,16
Апоптоз-ингибирующий белок XIAP 1 1,24 1,07 1,25
рующих рецепторы к фактору некроза опухолей.
Митохондриальный путь реализации апоп-тоза связан с активацией каспазы 9 посредством апоптосом. в состав которых входит белок Ара^ 1 и цитохром с. Высвободившийся из митохондрий цитохром с связывается с белком АраМ, который содержит два домена, один для связывания прокаспазы 9 и второй участок для связывания АТФ [1,5,8]. В гене ,кодирующем белок АраМ найден р53-чувствительный элемент, который принимает участие в образовании апоп-тосомы. Экспрессия гена APAF1 в клетках линий НСТ-116 р53-/- и НСТ-116 р53+/+ увеличена на 23 и 16 % соответственно (таб. 1,2). Контроль высвобождения цитохрома с из митохондрий в цитоплазму в стрессовых условиях осуществляется семейством про- и анти-апопто-тических белков ВСЬ. Все белки Вс1-2 семейства разделены на три группы. К первой группе относятся белки запускающие программу апоптоза -
Bax, Bak. Вторая группа объединяет антиапоп-тотические белки -Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, A-1. Третья группа белков включает белки - Bim, Bid, Bad, Bik, BNIP3, Bad, Noxa, Puma [8,9]. Из таблиц 1 и 2 видно, что экпрессия генов проапоп-тотических белков Bах Bак, Bad и Bim практически не различается в облученных клетках линий НСТ-116 р53-/- и НСТ-116 р53+/+, тогда как экспрессия генов антиапоптотических белков Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1 в клетках линии НСТ-116 р53-/- через 24 часа после облучения на 10-17 % выше чем в контрольной группе, а в клетках линии НСТ-116 р53+/+ только на 1-2 %. Таким образом, можно сделать заключение, что в клетках линии НСТ-116 р53-/- возможно блокирования запуска апоптоза по митохондриальному пути, что связано с сверх-экспрессией антиапоп-тотических белков семейства Bcl-2.
В таблицах 3 и 4 представлены данные анализа экспрессии генов в клетках линий HCT-116 p53-
Таблица 2. Динамика изменения экспрессии генов в клетках линии НСТ-116 р53+/+ продукты которых участвуют в процессе регуляции программируемой клеточной смерти. Данные представлены
как отношение уровня экспрессии гена в облученных клетках к уровню экспрессии гена в контрольной группе (К - контроль; 4Гр 1ч, 4Гр 12ч, 4Гр 24 ч - в данных стобцах указаны уровни экспрессии генов через 1,12 и 24 часа после облучения в дозе 4Гр)
Название гена Символ К 4Гр 1 ч 4Гр 12ч 4Гр 24ч
Прокаспаза 3 Casp3 1 1,05 1,08 1,02
Прокаспаза 9 Casp9 1 1,12 0,93 1,03
Прокаспаза 8 Casp8 1 1,08 1,24 1,09
Апоптоз-индуцирующий фактор AIFM1 1 0,96 1,01 1,07
Протеин ассоциированный с рецептором ФНО TRADD 1 1,03 1,06 1,10
Фактор ассоциированный с рецептором ФНО TRAF1 1 0,97 1,06 1,04
Эндонуклеаза G ENDOG 1 0,90 1,11 1,04
Проапоптотический белок Puma Puma 1 0,91 0,82 0,93
Проапоптотический белок Smac/Diablo DIABLO 1 0,98 0,96 0,96
Проапоптотический белок Apaf-1 APAF1 1 1,19 1,11 1,16
Проапоптотический белок Bim BCL2L11 1 1,05 1,08 0,93
Проапоптотический белок Bax BAX 1 0,79 0,99 0,86
Проапоптотический белок Bak BAK1 1 1,04 1,21 1,04
Проапоптотический белок Bnip-3 BNIP3 1 0,94 1,01 1,07
Проапоптотический белок Bad BAD 1 0,95 1,06 1,09
Катепсин A CTSA 1 1,05 0,98 1,03
Катепсин B CTSB 1 0,93 0,91 1,01
Катепсин D CTSD 1 0,85 0,96 0,96
Катепсин H CTSH 1 0,93 0,82 1,06
Катепсин K CTSK 1 1,33 0,94 1,14
Антиапоптотический белок Bcl-2 BCL2 1 1,08 0,98 1,06
Антиапоптотический белок Bcl-XL BCL2L1 1 1,00 1,04 1,03
Антиапоптотический белок MCL-1 MCL1 1 1,52 1,05 1,01
Апоптоз-ингибирующий белок XIAP 1 0,95 0,92 1,07
/- и HCT-116 p53+/+ продукты которых участвуют в различных механизмах репарации ДНК. Эукариотические клетки имеют несколько репа-рирующих систем ответственных за поддержание первичной структуры ДНК и элиминацию мутаций: 1) система эксцизионной репарации удалением поврежденных оснований (BER); 2) система репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (MMR); 3)система эксцизионная репарация нуклеотидов (NER); 4) система репарации путем соединения негомологичных концов. Кроме этих систем существует также ряд самостоятельных ферментов которые непосредственно или косвенно участвуют в процессах репарации [11].
Пострепликационная репарация ошибочно спаренных нуклеотидов(MMR) представляет собой важнейший механизм для поддержания стабильности микросателлитов через коррекцию неправильно спаренных оснований и репарации делеций и вставок. Эти события обнаруживают-
ся и обрабатываются гетеродимерными белками семейства MutS и М^Ь. Комплекс MSH2 -MSH6 может узнавать неправильно спаренные основания, а также вставки или делеции в материнской или дочерней цепей [11]. Экспрессия генов пострепликационной репарации ошибочно спаренных нуклеотидов(MMR), которая связана с генетической стабильностью генома, в клетках линий НСТ-116 р53-/- и НСТ-116 р53+/+ отличается по величине индукции экспрессии этих генов. В клетках линии НСТ-116 р53-/- индукция экспрессии генов МЬН1, MSH2 и MSH6 является более выраженной, чем в клетках линии НСТ-116 р53+/+, но радиационно-индуцирован-ное увеличение экспрессии этих генов наблюдается в обеих линиях. Из приведенных данных видно, что в клетках НСТ-116 р53-/-, с неактивным белком р53, активность системы пострепли-кационной репарация ошибочно спаренных нук-леотидов после радиационного воздействия на
Таблица 3. Изменение экспрессии генов в клетках линии HCT-116 p53-/- продукты которых участвуют в различных механизмах репарации ДНК. Данные представлены как отношение уровня экспрессии гена в облученных клетках к уровню экспрессии гена в контроле (MMR - Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов; BER - эксцизионная репарация удалением поврежденных оснований; NER - Эксцизионная репарация нуклеотидов; HRR - репарация путем гомологичной рекомбинации; NHEJ - Репарация путем соединения негомологичных концов; К - контроль; 4Гр 1ч, 4Гр 12ч, 4Гр 24 ч - в данных стобцах указаны уровни экспрессии генов через 1,12 и 24 часа после облучения в дозе 4Гр)
Название белка Ген Механизм репарации К 4Гр 1ч 4Гр 12 ч 4Гр 24ч
О-6-метил:гуанин ДНК метилтрансфераза MGMT 1,00 1,00 1,01 0,99
8-оксигуанин-ДНК гликозилаза OGG1 1,00 1,12 1,63 1,41
Рибонуклеотид-дифосфат редуктаза большая суб. RRM1 1,00 1,00 1,06 1,09
Рибонуклеотид-дифосфат редуктазамалая суб. RRM2 1,00 1,55 1,17 1,08
Белок гомологичный Ми1Ь (Е.соИ) MLH1 MMR 1,00 1,12 1,21 1,16
Белок гомологичный МШБ (Е.соИ) MSH2 MMR 1,00 1,13 1,26 1,25
Белок гомолог Ми$6 (Е.соИ) MSH6 MMR 1,00 1,01 1,17 1,26
Апурин:апиримидиновая эндонуклеаза APEX1 BER 1,00 1,02 1,04 1,03
^метилпуриновая-ДНК гликозилаза MPG BER 1,00 0,88 0,83 0,96
поли(АДФ) полимераза PARP1 BER 1,00 0,99 1,00 1,05
ДНК-репарирующий белок ХЯСС1 XRCC1 BER 1,00 0,79 0,96 1,01
ДНК-репарирующий белок ХРА XPA NER 1,00 1,29 1,22 1,17
Экзиционный ДНК-репарирующий белок ЕЯСС1 ERCC1 NER 1,00 1,24 1,32 1,26
ДНК-репарирующий белок ХРБ ERCC2 NER 1,00 0,97 1,00 0,87
ДНК-репарирующий белок ХРС XPC NER 1,00 1,02 0,97 0,99
ДНК-репарирующий белок гомолог ЯА051 Rad51 HRR 1,00 1,14 1,41 1,28
ДНК-репарирующий белок ХЯСС3 XRCC3 HRR 1,00 0,86 1,32 1,10
Белок восприимчивости к раку молочной железы 1 тип BRCA1 HRR 1,00 0,97 1,43 1,35
Белок восприимчивости к раку молочной железы 2 тип BRCA2 HRR 1,00 0,91 1,68 1,60
Тироидный аутоантиген 70 кДа (Ки антиген) XRCC6 NHEJ 1,00 1,02 1,00 1,04
Ки86 аутоантиген Ku86 NHEJ 1,00 1,02 1,07 1,05
связана с белком р53. Аналогичное заключение можно сделать и для системы эксцизионной репарации путем удалением поврежденных оснований. Радиационно-индуцированное изменение экспрессии генов продукты которых принимают участие в BER одинаково для клеточных линий HCT-116 p53-/- и HCT-116 p53+/+ (табл 3,4; гены -UNG, APEX1, MPG, PARP и XRCC1).
Система эксцизионной репарации нуклеотидов в клетках мутантных по гену ТР53 функционирует более активно, чем в клетках с нормальным геном ТР53. Высокие уровни экспрессии генов XPA, XPD, ERCC1 и ERCC2, после радиационного воздействия, характерны для линии HCT-116 p53-/- (таб. 3), но не для линии HCT-
116 р53+/+ (таб. 3) . Однако увеличение экспрессии этих генов нельзя напрямую связывать с влиянием белка р53. Вероятнее всего, статус гена ТР53 оказывает опосредованное влияние на экспрессию генов системы NER через модуляцию митохонд-риального биогенеза и внутриклеточную концентрацию оксида азота [4]. Таким образом, можно сделать заключение, что в клетках с мутантным геном ТР53, после радиацинного воздействия происходит активация системы эксцизионной репарации нуклеотидов, тогда как в клетках с диким типом гена ТР53 радиация не активирует систему эксцизионной репарации нуклеотидов.
Системы репарации двунитевых разрывов цепей ДНК - репарация путем соединения него-
Таблица 4. Изменение экспрессии генов в клетках линии НСТ-116 р53+/+ продукты которых участвуют в различных механизмах репарации ДНК. Данные представлены как отношение уровня экспрессии гена в облученных клетках к уровню экспрессии гена в контроле.(MMR - Репарация
ошибочно спаренных нуклеотидов; BER - эксцизионная репарация удалением поврежденных оснований;NER - Эксцизионная репарация нуклеотидов; HRR - репарация путем гомологичной рекомбинации; NHEJ - Репарация путем соединения негомологичных концов; К - контроль; 4Гр 1ч, 4Гр 12ч, 4Гр 24 ч - в данных стобцах указаны уровни экспрессии генов через 1,12 и 24 часа после
облучения в дозе 4Гр)
Название белка Ген Механизм репарации К 4Гр 1ч 4Гр 12ч 4Гр 24ч
О-6-метил:гуанин ДНК метилтрансфераза MGMT 1,00 0,93 0,94 0,99
8-оксигуанин-ДНК гликозилаза OGG1 1,00 0,92 1,07 1,00
Рибонуклеотид-дифосфат редуктаза большая суб. RRM1 1,00 0,95 1,00 0,99
Рибонуклеотид-дифосфат редуктазамалая суб. RRM2 1,00 1,22 1,09 0,97
Белок гомологичный Ми1Ь (Е.соИ) MLH1 MMR 1,00 1,26 1,24 1,16
Белок гомологичный МШБ (Е.соИ) MSH2 MMR 1,00 0,99 1,11 1,06
Белок гомолог Ми$6 (Е.соИ) MSH6 MMR 1,00 0,90 1,06 1,02
Апурин:апиримидиновая эндонуклеаза APEX1 BER 1,00 0,99 1,00 0,99
М-метилпуриновая-ДНК гликозилаза MPG BER 1,00 0,94 0,91 0,99
поли(АДФ) полимераза PARP1 BER 1,00 1,01 0,99 1,04
ДНК-репарирующий белок ХЯСС1 XRCC1 BER 1,00 0,96 0,92 1,00
ДНК-репарирующий белок ХРА XPA NER 1,00 1,03 1,08 1,00
Экзиционный ДНК-репарирующий белок ЕЯСС1 ERCC1 NER 1,00 0,95 0,94 1,00
ДНК-репарирующий белок ХРБ ERCC2 NER 1,00 1,00 0,99 0,87
ДНК-репарирующий белок ХРС XPC NER 1,00 1,01 0,97 0,99
ДНК-репарирующий белок гомолог ЯА051 Rad51 HRR 1,00 1,00 1,15 1,14
ДНК-репарирующий белок ХЯССЗ XRCC3 HRR 1,00 1,00 1,10 1,15
Белок восприимчивости к раку молочной железы 1 тип BRCA1 HRR 1,00 1,00 1,23 1,14
Белок восприимчивости к раку молочной железы 2 тип BRCA2 HRR 1,00 1,28 1,44 1,54
Тироидный аутоантиген 70 кДа (Ки антиген) XRCC6 NHEJ 1,00 0,99 0,99 1,02
Ки86 аутоантиген Ku86 NHEJ 1,00 0,98 1,06 1,01
мологичных концов (NHEJ) и репарация путем гомологичной рекомбинации (HRR) под воздействием радиационного облучения активируются одинаково в клетках линий HCT-116 р53-/- и ^Т-Пб р53+/+ (таб. 3,4; гены -RAD51, BRCA1, XRCC3, XRCC6 и Ки86).
Таким образом, сравнительный анализ экспрессии генов , продукты которых участвуют в механизмах реализации программируемой клеточной смерти и репарации ДНК в клетках линий HCT-116 р53-/- и HCT-116 р53+/+ через 1, 12 и 24 часа после радиационного воздействия в дозе 4 Гр позволил сделать следующие выводы:
1) Мутация гена ТР53 подавляет запуск про-
граммируемой клеточной смерти индуцируемой через каспазный и каспаз-независимый механизмы;
2) В клетках содержащих нормальный ген ТР53 радиационное воздействие индуцирует апоптоз по внешнему и внутреннему (митохонд-риальному) механизму активации;
3) Блокирования индукции апоптоза по ми-тохондриальному пути в ТР53 мутантных клетках связано с сверхэкспрессией антиапоптотичес-ких белков семейства Вс1-2.
4) Радиационно-индуцированное изменение экспрессии генов продукты которых принимают участие в эксцизионной репарации удалением
поврежденных оснований (BER), репарации путем гомологичной рекомбинации (HRR) и репарации путем соединения негомологичных концов (NHEJ) происходят одинаково в клеточных линий HCT-116 p53-/- и HCT-116 p53+/+ и не зависит от статуса гена ТР53.
5)В клетках с мутантным геном ТР53 после радиацинного воздействия происходит активация системы эксцизионной репарации нуклеоти-дов (NER) , тогда как в клетках с диким типом гена ТР53 радиация не активирует систему экс-цизионной репарации нуклеотидов.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» грант №14.837.21.0558.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. A novel, high conductance channel of mitochondria linked to apoptosis in mammalian cells and Bax expression in yeast / Pavlov E.V., Priault M., Pietkiewicz D., Cheng H.-Y., Antonsson B., Manon S., Korsmeyer S., Mannella C. A., KinnallyK.W. // Journal of Cell Biology. 2001. Vol.155. №5. P. 725-732.
2. Brooks C., Gu W. P53 ubiquitination: Mdm2 and beyond // Mol. Cell. 2006. Vol. 21. № 3. P. 307-315.
3. Caelles C., Helmberg A., Karin M. P53-dependent apoptosis in the absence of transcriptional activation
of p53-target genes // Nature. 1994. Vol. 370. №. 6486. P. 220-233.
4. Carreras M.C., PoderosoJ.J. Mitochondrial nitric oxide in the signaling of cell integrated responses // American journal of physiology. Cell Physiology. 2007. Vol.292., №.5. P. 1569-1580.
5. Chipuk J. E., Bouchier-Hayes L., Kuwana T. PUMA couples the nuclear and cytoplasmic proapoptotic function of p53 // Science. 2005. Vol. 309. № 5741. P. 1732-1735.
6. Colin A., Seamus M.J. Apoptosis: Calling Time on Apoptosome Activity // Sci. Signal. 2009. Vol.2. № 91. P.62-64.
7. Coller H.A., Grandori C., Tamayo P. Expression analysis with oligonucleotide microarrays reveals that myc regulates genes involved in growth, cell cycle, signaling, and adhesion./ H.A. Coller, C. Grandori, P.Tamayo // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2000. Vol. 97. № 7. P. 3260-3265.
8. Huang D.C., Strasser A. BH3-only proteins - essential initiators of apoptotic cell death // Cell. 2000. Vol.103. P.839-842.
9. Levine A. J., Oren M. The first 30 years of p53: growing ever more complex // Nat. Rev.Cancer. 2009. Vol. 9. P. 749-758.
10. Olivier M., Hollstein M., Hainaut P. TP53 Mutations in Human Cancers: Origins, Consequences, and Clinical Use // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2010. Vol. 2, № 1. P. 25-117.
11. Shah S. N., Hile S.E., Eckert K.A. Defective mismatch repair, microsatellite mutation bias, and variability in clinical cancer phenotypes // Cancer Research. 2010. Vol.70. №2. P.431-435.
12. Vousden K. H., Prives C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53 / K.H. Vousden, C. Prives // Cell. 2009. Vol. 137. P/ 413-431.
COMPARATIVE STUDY OF RADIATION-INDUCED TRANSCRIPTOME DYNAMICS IN CANCER CELLS WITH NORMAL AND DEFECTIVE TP53 GENE
© 2012 Y.V. Saenko, V.V. Uchaikin, R.T. Sibatov, V.V. Saenko, V.A. Ostatochnikov, E.V. Kozhemiakina, O.V. Liapeikova, O.S. Voronova, D.A. Evseev, N.V. Belozerov, S.A.Vasiliev, E.S. Gluschenko, I.V. Zhivodernikov
Ulyanovsk State University
In this article we made a comparative study of the dynamics changes in gene expression of key signaling pathways associated with programmed cell death and DNA repair in cancer cells with normal and mutant TP53.
Keywords: apoptosis, TP53 gene, DNA repair, gene expression, transcriptome, cancer, radiation.
Yury Saenko, Candidate of Biology, Senior Research Fellow. E-mail: [email protected]
Vladimir Uchaikin, Doctor of Physics and Mathematics, Professor, Head at the Theoretical Physics Department. Renat Sibatov, Candidate of Physics and Mathematics, Associate Professor at the Theoretical Physics Department. Viacheslav Saenko, Candidate of Physics and Mathematics, Associate Professor at the Theoretical Physics Department. Vladimir Ostatochnikov, Graduate Student, Associate Research Fellow.
Elena Kozhemiakina, Laboratory Technician at the Theoretical
Physics Department.
Olga Liapeikova, Graduate Student.
Olga Voronova, Candidate of Biology, Associate Research Fellow. Dmitry Evseev, Student. Nikita Belozerov, Student. Stepan Vasiliev, Student.
Evgenyia Gluschenko, Graduate Student, Associate Research Fellow.
Ivan Zhivodernikov, Student.
