CC BY
4Ветеринарный врач. 2024. № 6. С. 70 - 74 The Veterinarian. 2024; (6): 70 - 74
Научная статья УДК 579.663
DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_6_70
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА НАКОПЛЕНИЯ БИОМАССЫ ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ ОТЕЧЕСТВЕННОГО И ИМПОРТНОГО ПРОИЗВОДСТВА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ АКТИНОБАЦИЛЛЁЗНОЙ ПЛЕВРОПНЕВМОНИИ СВИНЕЙ
Александр Александрович Круглов 12, [email protected] Андрей Дмитриевич Роенко 1,2 , rond900@gmail. com
Николай Васильевич Пименов 2, доктор биологических наук, [email protected]
1 Федеральное казенное предприятие «Щелковский биокомбинат», Московская область, Российская Федерация
2 Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К. И. Скрябина, Москва, Российская Федерация
Автор, ответственный за переписку: Андрей Дмитриевич Роенко.
Аннотация. Актинобациллёзная плевропневмония свиней - инфекционное заболевание, вызываемое микроорганизмом Actinobacillus pleuropneumoniae, характеризующееся широким ареалом распространения и высокой степенью летальности среди животных. На сегодняшний день эффективные меры по профилактике данного заболевания на территории Российской Федерации отсутствуют ввиду сложности подбора серотипов Actinobacillus pleuropneumoniae для производства эффективных вакцинопрепаратов. На ФКП «Щёлковский биокомбинат» разрабатывается вакцина из наиболее распространённых в Российской Федерации серотипов. Для производства качественного и эффективного вакцинопрепарата перед предприятием стоит несколько задач по: подбору, выделению и идентификации необходимых серотипов возбудителя. Помимо этого при производстве вакцины так же существует необходимость в подборе параметров культивирования микроорганизмов, питательных сред для наибольшего накопления бакмассы и оптимизации их состава, способов инактивации и методов контроля качества готовой продукции: определении полноты инактивации, безвредности и иммуногенности вакцины. В данной статье производится сравнительный анализ ростовых свойств питательных сред отечественного и импортного производства для культивирования Actinobacillus pleuropneumoniae на примере результатов культивирования 3-го пассажа 8-го серотипа Actinobacillus pleuropneumoniae в бутылях с раскатанными по стенкам соответствующими питательными средами. Анализ проводили с использованием методов определения концентрации микроорганизмов по стандарту мутности Л.А. Тарасевича, а также культуральным методом путём высева на чашках Петри и подсчёта выросших колоний микроорганизмов. По результатом исследования возможно выбрать питательную среду для данного этапа культивирования Actinobacillus pleuropneumoniae при производстве вакцины против актинобациллёзной плевропневмонии свиней.
Ключевые слова: вакцины, актинобациллёзная плевропневмония, промышленное культивирование, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus pleuropneumoniae
Для цитирования: Круглов А.А., Роенко А.Д., Пименов Н.В. Сравнительная оценка накопления микроорганизмов Actinobacillus pleuropneumoniae на питательных средах отечественного и импортного производства для изготовления вакцины против актинобациллёзной плевропневмонии свиней. // Ветеринарный врач. 2024. № 6. С. 70 - 74. DOI: 10.33632/1998-698Х_2024_6_70
COMPARATIVE ASSESSMENT OF THE ACCUMULATION OF MICROORGANISMS ACTINOBACILLUSPLEUROPNEUMONIAE ON NUTRIENT MEDIA OF DOMESTIC AND IMPORTED PRODUCTION FOR THE PRODUCTION OF VACCINE AGAINST ACTINOBACILLOSIS PLEUROPNEUMONIA OF PIGS
Alexander A. Kruglov u, [email protected] Andrey D. Roenko u, rond900@gmail. com
Nikolay V. Pimenov 2 , doctor of biological sciences, [email protected]
1 Federal State Enterprise Schelkovskiy biocombinat, Moscow region, Russian Federation
2 Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - M.I. Skryabin MBA, Moscow, Russian Federation
Corresponding author: Andrey Dmitrievich Roenko.
Abstract. Actinobacillus pleuropneumonia of pigs is an infectious disease caused by the microorganism Actinobacillus pleuropneumoniae, characterized by a wide distribution area and a high degree of mortality among animals. Up until now, there are no effective measures to prevent this disease on the territory of the Russian Federation due to the difficulty of selecting Actinobacillus pleuropneumoniae serotypes for the production of effective vaccines. At FGE "Shchelkovsky Biocombinat" a vaccine from the most common serotypes in the Russian Federation is being developed. To produce a high-quality and effective vaccine, the manufacture faces several tasks: selection, isolation and identification of the necessary serotypes of the pathogen. In addition, when producing a vaccine, there is also a need to select parameters for cultivating microorganisms, nutrient media for the greatest accumulation of bacterial mass and optimizing their composition, inactivation methods and methods for quality control of finished products: determining the completeness of inactivation, harmlessness and immunogenicity of the vaccine. This article provides a comparative analysis of the growth properties of domestic and imported nutrient media for the cultivation of Actinobacillus pleuropneumoniae using the example of the results of cultivation of the 3rd passage of the 8th serotype of Actinobacillus pleuropneumoniae in bottles with appropriate nutrient media rolled out along the walls of the bottle. The analysis was carried out using methods for determining the concentration of microorganisms according to the L.A. Tarasevich turbidity standard, as well as the cultural method by sowing on Petri dishes and counting the grown colonies of microorganisms. Based on the results of the study, it is possible to select a nutrient medium for this stage of cultivation of Actinobacillus pleuropneumoniae in the production of a vaccine against actinobacillus pleuropneumonia of pigs.
Keywords: vaccines, actinobacillus pleuropneumonia, industrial cultivation, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus pleuropneumoniae
Введение. Актинобациллёзная плевропневмония свиней - инфекционное заболевание, вызываемое бактериями Actinobacillus pleuropneumoniae (по старой классификации Haemophilus pleuropneumoniae). Заболевание характеризуется тем, что поражает в основным молодых свиней в возрасте до 6 месяцев и вызывает обширное воспаление и некроз лёгочной ткани, поражение иммунной системы, в том числе разрушение макрофагов, самопроизвольные аборты у свиноматок[1]. Данное заболевание несёт высокие риски для свиноводчества и приводит к серьёзным убыткам ввиду высокой летальности и неспецифических симптомов. Около 20 процентов случаев пневмонии в свиноводческих хозяйствах приходятся на актинобациллезную плевропневмонию, а летальность может доходить до 60% [2, 3]. Actinobacillus pleuropneumoniae представлен двумя сероварами, первый включает в себя 13 серотипов, второй - 2. Различие серотипов обуславливаются различиями в клеточных и капсульных липополисахаридах (ЛПС) бактерий. При этом каждый из серотипов способен спровоцировать заболевание, но иммунитет к одному из серотипов не защищает от возможности заражения другими. Так же существенной проблемой является серологическая дифференциация некоторых серотипов, в связи с тем, что некоторые серотипы имеют схожее строение длинноцепочечных ЛПС [4].
На данный момент основным методом борьбы с актинобациллёзной плевропневмонией является применение антибиотиков. Широкое применение данного метода представляет существенную угрозу тем, что создаёт возможность появления антибиотикорезистентных штаммов не только Actinobacillus pleuropneumoniae, но и других видов патогенных микроорганизмов [5, 6, 7]. Поэтому на сегодняшний день остро стоит вопрос о создании эффективной и безопасной вакцины против актинобациллёзной плевропневмонии свиней. Существует два подхода к созданию вакцинопрепаратов против данного заболевания. Создание бактериальной вакцины на основе
нескольких наиболее распространённых на территории Российской Федерации серотипов или создание субъединичной бактериально-токсоидной вакцины, которая помимо частей бактериальных клеток будет содержать также и анатоксины, поскольку патогенез Actinobacillus pleuropneumoniae в значительной части обеспечивается также продукцией токсинов этими микроорганизмами[8].
В обоих случаях для производства препарата потребуется прибегнуть к методам накопления бактериальной культуры, при больших объёмах производства наиболее эффективным методом накопления является глубинное культивирование. Для того чтобы произвести глубинное культивирование микроорганизмов, с последующим выделением целевого продукта в виде бакмассы или токсинов, потребуется выделить и идентифицировать необходимые серотипы Actinobacillus pleuropneumoniae, после чего необходимо получить посевной материал путём многократных пассажей. Для каждого пассажа нужно подобрать одну или несколько разных питательных сред, таких, чтобы получить максимально возможную концентрацию микроорганизмов на миллилитр среды. Чем выше концентрация в каждом из пассажей, тем выше будет выход конечного продукта[9].
Материалы и методы. Исследование проводили на базе ФКП «Щёлковский биокомбинат» с использованием штамма Actinobacilluspleuropneumoniae ЩБК Б-2, относящегося к 8-му серотипу. Для исследования на Бульоне Хоттингера был получен 2-й пассаж данного штамма. Сравнительную оценку ростовых свойств проводили исходя из данных накопления третьего пассажа штамма на двух бутылях объёмом 0.4 литра с раскатанным по стенкам агаром Хоттингера собственного производства в одном случае и коммерческой средой Haemophilus Test Agar Base производства HiMedia Laboratories Индия, состава: мясной настой 30,0%; гидролизат казеина 1,75%; дрожжевой экстракт 0,5%; крахмал 0,15%; агар-агар 0,17%.
Для приготовления бульона Хоттингера используют только прозрачную надосадочную жидкость перевара Хоттингера, которую разводят очищенной или деминерализованной водой не более чем в 2-3 раза до содержания в бульоне 240-280 мг/% аминного азота. Среду подогревают и добавляют 0,5 % пептона, 0,5 % хлористого натрия, 0,3 % химически чистого двухосновного фосфорнокислого натрия и 10 % воды на выкипание. Смесь доводят до кипения и устанавливают pH 7,8-8,0 ед. добавлением 20 % раствора натрия гидроокиси. Среду кипятят в течение 30 минут. Затем среду оставляют в том же варочном котле на 1 -1,5 часа, фильтруют до полной прозрачности через плотный слой ваты и марли или фильтрпластины Зейтца марки «Ф». Среду разливают по бутылям (10 л) и 200 см 3 флаконам. Стерилизуют при давлении 0,1 мПа (+120 °С) в течение 30 минут. Для приготовления агаровой среды добавляют 3 % агара в питательную среду до кипения. При культивировании штаммов A. pleuropneumoniae с использованием бульона Хоттингера дополнительно в нее вносят свежеприготовленный 0,5 % раствор сернокислого семиводного железа из расчета 2 см 3 на один литр питательной среды. Раствор вносят асептически непосредственно перед засевом культуры.
Оптическая концентрация микроорганизмов в реакторах измерялась с помощью фотоэлектроколориметра и оптического стандарта мутности Л.А. Тарасевича. Морфологические свойства бактерий и бактериальную чистоту определяли посредством микроскопии.
Результаты исследований и их обсуждение. Для получения 2-го пассажа в ампулу с лиофилизированным штаммом A. pleuropneumoniae вносили 1 см3 Бульона Хоттингера. Содержимое ампулы ресуспензировали до получения равномерной взвеси. Полученную суспензию засеяли в пробирки с 10 см3 Бульона Хоттингера по 0,2 см3 и инкубировали в термостате при температуре (37±0,5)°С в течение 24 часов. Полученную культуру штамма A. pleuropneumoniae пересеяли в аналогичных соотношениях во флаконы с Бульоном Хоттингера в соотношении 1 мл культуры на 100 мл питательной среды, культивировали в термостате при температуре (37±0,5) °C в течение 24 часов.
Для получения третьего пассажа брали две бутыли объёмом 0,4 л с раскатанным по стенкам бутыли агаром Хоттингера в одном случае и коммерческой средой Haemophilus Test Agar Base в другом. На обе бутыли засевали культуру из флаконов с бульоном хоттингера по 100 мл на каждую бутыль, равномерно раскатывая жидкость по стенкам. Затем удалили лишнюю жидкость из бутылей. Культивировали в термостате при температуре (37±0,5) °C в течение 24 часов. По прошествии указанного времени на стенках наблюдался равномерный рост культуры, которую смывали во флаконы физиологическим раствором по 150 см3. Во флаконе со смывом со среды Хоттингера получили оптическую концентрацию в 3,5 миллиардов бактериальных клеток на миллилитр по стандарту мутности Л.А. Тарасевича, а во флаконе со смывом с коммерческой среды получили концентрацию в 7,5 миллиардов микробных клеток на миллилитр.
Для подтверждения результатов эксперимента был произведён посев с флаконов на чашки с питательной средой Haemophilus Test Agar Base. В связи с такой концентрацией приняли решение проводить посев на питательные среды в разведениях 1:10-7 (3 чашки) и 1:10-8 (5 чашек) Чашки
выдерживали в термостате при 37 градусах в течение 3-х суток. В результате проведённых исследований на всех чашках наблюдали чистый рост колоний Actinobacillus pleuropneumoniae в количестве, приведённом в Таблице 1.
Таблица 1
Флаконы Разведение Количество выросших колоний Actinobacillus pleuropneumoniae
Haemophilus Test 10-7 74 57 66 - -
Agar Base 10-8 2 6 8 8 3
Агар Хоттингера 10-7 36 26 39 - -
10-8 3 2 1 2 2
Биологическую концентрацию определяли исходя из ОФС.1.7.2.0008.15 «Определение концентрации микробных клеток» по формуле: N = +oi*n )*d*а ,
где: c - сумма подсчитанных колоний на всех чашках; n1 - количество чашек первого разведения; n2 - количество чашек второго разведения; d - коэффициент первого разведения; a -количество посевного материала в мл равное 0,1. 0,1 - коэффициент, учитывающий кратность первого и второго разведений.
Таким образом, получили для смыва с Haemophilus Test Agar Base концентрацию микробных клеток равную N = 6,4 * 109 КОЕ/мл; а для смыва с агара Хоттингера N = 3,1 * 109 КОЕ/мл
В результате приведённых исследований было установлено, что коммерческая среда Haemophilus Test Agar Base индийского производства даёт лучший рост по сравнению со средой Хоттингера собственного производства. Таким образом для получения 3-го пассажа в рамках производства вакцины против актинобациллёзной плевропневмонии свиней эффективнее использовать коммерческую среду.
Заключение. Выбранный Haemophilus Test Agar Base индийского производства при получении культуры Actinobacillus pleuropneumoniae 3-го пассажа даёт рост культуры выше более чем на 100% по сравнению со агаром Хоттингера собственного производства и может быть использован в технологической схеме создания вакцины против актинобациллёзной плевропневмонии свиней. Для дальнейшей реализации итогов научной работы, необходимо сравнить полученные результаты также с культивированием на жидких средах. Полученные результаты позволят заявить о том, что коммерческая среда Haemophilus Test Agar Base может так же быть использована и для получения 1-го и 2-го пассажей Actinobacillus pleuropneumoniae.
Список источников
1. Auger E, Deslandes V, Ramjeet M, Contreras I, Nash JH, Harel J, Gottschalk M, Olivier M, Jacques M. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells. // Infect Immun. 2009 Apr;77(4):1426-41. doi: 10.1128/IAI.00297-08. Epub 2009 Jan 12. PMID: 19139196; PMCID: PMC2663157.
2. Shope R.E. Porcine contagious pleuropneumonia. //. Experimental transmission, etiology, and pathology. J Exp Med. 1964 Mar 1;119(3):357-68. doi: 10.1084/jem.119.3.357. PMID: 14129707; PMCID: PMC2137882.
3. Klitgaard K, Friis C, Angen O, Boye M. Comparative profiling of the transcriptional response to iron restriction in six serotypes of Actinobacillus pleuropneumoniae with different virulence potential. // BMC Genomics. 2010 Dec 9; 11:698. doi: 10.1186/1471-2164-11-698. PMID: 21143895; PMCID: PMC3091793.
4. Корочкин, Р. Актинобациллярная плевропневмония свиней / Р. Корочкин // Ветеринарное дело (Минск). - 2021. - № 9. - С. 3-8. - EDN NOZAQZ.
5. А. Потехин. Диагностика, лечение и специфическая профилактика актинобациллезной плевропневмонии свиней на свинокомплексах Российской Федерации // Доклад ФГБУ «ВНИИЗЖ» на Международном ветеринарном конгрессе в Казани. URL: https://soyanews.info/news/diagnostika-
lechenie i spetsificheskaya profilaktika aktinobatsilleznoy plevrop.html (дата обращения 28.04.2024)
6. Лебедев, Н. В. Актинобациллезная плевропневмония свиней: диагностика, профилактика и меры борьбы / Н. В. Лебедев, А. В. Потехин, А. А. Фроловцева // Ветеринария сегодня. - 2012. - № 3(3). - С. 24-30. - EDN SXYQJJ.
7. Русалеев В.С. Антибиотикорезистентность возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней: проблемы и пути решения. Ветеринария сегодня. 2018;(3):26-29. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2018-3-26-26-29
8. Пругло В. В. Вакцинопрофилактика актинобациллезной плевропневмонии свиней (АПП) в РФ // Перспективное свиноводство: Теория и практика. 2011. №1. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/vaktsinoprofilaktika-aktinobatsilleznoy-plevropnevmonii-sviney-app-v-rf (дата обращения: 28.04.2024).
9. Ширяев, Ф. А. Рост бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae при различных условиях культивирования / Ф. А. Ширяев, Д. А. Бирюченков, А. В. Потехин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - 2008. - Т. 6. - С. 282-288. - EDN MOUHXX.
References
1. Auger E, Deslandes V, Ramjeet M, Contreras I, Nash JH, Harel J, Gottschalk M, Olivier M, Jacques M. Host-pathogen interactions of Actinobacillus pleuropneumoniae with porcine lung and tracheal epithelial cells. // Infect Immun. 2009 Apr;77(4):1426-41. doi: 10.1128/IAI.00297-08. Epub 2009 Jan 12. PMID: 19139196; PMCID: PMC2663157.
2. Shope R.E. Porcine contagious pleuropneumonia. //. Experimental transmission, etiology, and pathology. J Exp Med. 1964 Mar 1;119(3):357-68. doi: 10.1084/jem.119.3.357. PMID: 14129707; PMCID: PMC2137882.
3. Klitgaard K, Friis C, Angen O, Boye M. Comparative profiling of the transcriptional response to iron restriction in six serotypes of Actinobacillus pleuropneumoniae with different virulence potential. // BMC Genomics. 2010 Dec 9;11:698. doi: 10.1186/1471-2164-11-698. PMID: 21143895; PMCID: PMC3091793.
4. Korochkin, R. Actinobacillary pleuropneumonia of pigs / R. Korochkin // Veterinary Affairs (Minsk). -2021. - No. 9. - P. 3-8. - EDN NOZAQZ.
5. A. Potekhin. Diagnosis, treatment and specific prevention of actinobacillus pleuropneumonia of pigs on pig farms of the Russian Federation // Report of the Federal State Budgetary Institution "ARRIAH" at the International Veterinary Congress in Kazan. URL: https://soyanews.info/news/diagnostika-_lechenie_i_spetsificheskaya_profilaktika_aktinobatsilleznoy_plevrop.html (access date 04/28/2024)
6. Lebedev, N.V. Actinobacillus pleuropneumonia of pigs: diagnosis, prevention and control measures / N.V. Lebedev, A.V. Potekhin, A.A. Frolovtseva // Veterinary Science Today. - 2012. - No. 3(3). - P. 24-30. -EDN SXYQJJ.
7. Rusaleev V.S. Antibiotic resistance of the cause of actinobacilous pleuropneumonia of swine: problems and solutions. Veterinary medicine today. 2018; (3):26-29. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2018-3-26-26-29
8. Pruglo V.V. Vaccinal prevention of actinobacillus pleuropneumonia of pigs (APP) in the Russian Federation // Perspective pig breeding: Theory and practice. 2011. No. 1. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/vaktsinoprofilaktika-aktinobatsilleznoy-plevropnevmonii-sviney-app-v-rf (date of access: 04/28/2024).
9. Shiryaev, F.A. Growth of bacteria Actinobacillus pleuropneumoniae under various cultivation conditions / F.A. Shiryaev, D.A. Biryuchenkov, A.V. Potekhin // Proceedings of the Federal Center for Animal Health. - 2008. - T. 6. - P. 282-288. - EDN MOUHXX.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с
написанием статьи.
All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication.
The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / accepted for publication 08. 05. 2024;
© Круглов А.А., Роенко А.Д., Пименов Н.В. 2024
