CC BY
18
УДК 612.017:616-053:616.44-006.6
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУННОГО СТАТУСА ДЕТЕЙ С ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫМИ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ УЗЛОВЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
© 2006 г. Ю.Ю. Козель, Е.Ю. Златник, Г.И. Закора, С.А. Кузнецов
The study has shown that after removal of benign tumours indices of immune status are normalized, whereas after operations for cancer of thyroid gland normalization doesn't occur.
О влиянии иммунологического статуса на развитие заболеваний щитовидной железы (ЩЖ) пишут многие исследователи, например, [1, 2]. Однако подавляющее число этих исследований посвящено аутоиммунным заболеваниям ЩЖ, к которым в настоящее время относят диффузный токсический зоб и аутоиммунный тиреоидит Хашимото [3, 4]. Работы, в которых освещается состояние клеточного и гуморального иммунитета у больных узловыми формами эутиреоидного зоба и раке ЩЖ (РЩЖ), встречаются крайне редко и носят противоречивый характер. Вместе с тем при гистологическом исследовании лимфоидная инфильтрация ЩЖ выявляется в 96 % наблюдений при узловых образованиях, что позволяет говорить об определенной значимости аутоиммунитета в их развитии [5, 6]. Опухолевый рост и вызванная им и/или оперативным лечением гормональная дисфункция ЩЖ могут отражаться на состоянии иммунитета, поскольку в настоящее время хорошо известно об интегративных взаимосвязях нейро-эндокринной и иммунной систем [7].
Целью работы явилось изучение состояния иммунного статуса больных с доброкачественными и злокачественными новообразованиями ЩЖ до и после лечения.
В исследование включены 60 детей и подростков в возрасте от 9 до 18 лет с узловыми образованиями ЩЖ. У 27 больных диагностированы доброкачественные узловые образования ЩЖ (аденома, узловой зоб), у 33 - РЩЖ. Анализ параметров иммунного статуса проводился отдельно у больных с доброкачественными и злокачественными опухолями. Иммунологическое обследование выполняли до лечения и через 1-3 мес. после оперативного вмешательства. Контрольную группу составляли практически здоровые дети аналогичного возраста.
Во взвеси мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови детей в градиенте фиколл-верографина по A. Boyum (1968), определяли популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов им-мунофлюоресцентным методом с использованием моноклональных антител фирмы «Сорбент» (Москва) против рецепторов СБ2, СБ4, СБ8, СБ16, СБ20 [8, 9]. В качестве дополнительной характеристики для оценки состояния МК-клеточного звена в крови больных изучали уровень больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ), которые подсчитывали в мазках крови, окрашенных по Паппенгейму [10]. У детей, больных РЩЖ, определяли
также содержание лимфоцитов, экспрессирующих маркеры поздней активации (HLA-DR) и активационного апоптоза (ОТ95).
Функциональную активность Т-лимфоцитов оценивали в реакции бла-стной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) после 48-72-часового культивирования при 37 °С в присутствии 5 % CO2 в полной культуральной среде (ПКС), содержащей среду RPMI-l640 с l0 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («Flow Lab.»), 5 x l0-5 M 2-меркаптоэтанола («Serva»), 2 мМ L-глютамина, l0 мМ буфера HEPES («Flow Lab.»), 50 мкг/мл гентамицина, с добавлением Т-митогенов (ФГА и КонА в дозе l0 мкг/мл) [ll, l2]. Функциональную активность В-клеток изучали в РБТЛ с ЛПС, аналогом которого является пирогенал, в дозе 50 ЕД/мл при тех же условиях. Параллельно оценивали спонтанную бласттрансформацию, для чего вместо митогена в пробу добавляли равный объем ПКС. Продукцию интерлейкина-6 (IL-6) МНК определяли путем постановки ИФА с суперна-тантами клеток после культивирования их в ПКС с ФГА в течение 24 ч (стимулированная проба) или в ПКС без митогена (спонтанная). Рассчитывали индекс стимуляции (ИС) по формуле: ИС = IL-6 стим./ГЬ-6 спонт.
Для характеристики моноцитарно-макрофагального звена дополнительно применяли тест макрофагальной трансформации моноцитов с определением показателя этой трансформации (ПМТМ), который представляет собой процент моноцитов периферической крови, трансформирующихся в макрофаги после l-суточного культивирования в ПКС при 37 °С [l3]. Содержание иммуноглобулинов основных классов (IgG, IgA, IgM) определяли в реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини.
Исходные показатели клеточного и гуморального иммунитета детей двух групп с патологией ЩЖ по сравнению с контрольной группой представлены на рис. l и 2, из которых видно, что иммунный статус у детей с доброкачественными новообразованиями ЩЖ характеризовался более низкими по сравнению с нормой процентными уровнями многих иммунологических факторов. У детей этой группы из исследованных l3 параметров статистически достоверно снижено по сравнению с нормативными l0, а именно уровни Т- и В-лимфоцитов, Œ4+, Œ8+, OTl6+ клеток, БГЛ, показатели ответа на Т- и В-митогены в РБТЛ, ПМТМ и IgG.
Рис. 1. Показатели иммунного статуса у детей с доброкачественными узловыми новообразованиями щитовидной железы, в % по отношению к значениям у здоровых детей
CD2+
□ здоровые дети
□ дети с доброкачественными
новообразованиями
7l
CD2+
CDS HLA-DR+,
□ здоровые дети
CD8+ CD16+ ФГА
J дети со злокачественными опухолями
ПМТ
Рис. 2. Показатели иммунного статуса у детей со злокачественными новообразованиями щитовидной железы, в % по отношению к значениям у здоровых детей
При РЩЖ исходно сниженными по сравнению с нормой были 9 показателей (те же, кроме уровня СБ8+ клеток). При этом у больных наблюдалось статистически значимо более высокое содержание лимфоцитов с ак-тивационными маркерами НЬА-БЯ и СБ95, последний из которых был в 2 раза выше, чем у здоровых детей, а именно 22,9 ± 2,2 против 11,8 ± 1,6 % (рис. 2). Из рис. 3 видно, что при РЩЖ была нарушена продукция про-воспалительного цитокина ГЬ-6. У больных РЩЖ спонтанная продукция этого цитокина превышала норму в 20 раз и составляла 1105 ± 42,5 пг/мл против 51,0 ± 15,5 в норме, тогда как ФГА-индуцированная продукция была сопоставима с нормальными показателями (1198 ± 46,4 и 1063,6 ± ± 68,7 пг/мл). Индекс стимуляции составил 1,3 ± 0,09 при РЩЖ против 50,1 ± 20,7 у здоровых лиц. Такой характер нарушения продукции ГЬ-6, на наш взгляд, свидетельствует о том, что МНК крови больных РЩЖ уже находятся в условиях антигенной стимуляции, по всей вероятности, опухолевыми и/или тиреоидными антигенами.
pg/ml 1600 1200 800 400 0
,008 1198 1063
51
ГЬ-6 спонт. 1Ь-6 стим. ФГА
□ здоровые дети □ дети со злокачественными новообразованиями
Рис. 3. Сравнительная характеристика продукции 1Ь-6у здоровых детей и при раке щитовидной железы
Сопоставление показателей иммунного статуса у детей обеих групп с опухолями ЩЖ показало, что при РЩЖ статистически достоверно ниже был процентный уровень Т-лимфоцитов при более высоком содержании СБ8+ клеток по сравнению с группой детей, имеющих доброкачественные опухоли.
Динамика иммунного статуса больных доброкачественными узловыми новообразованиями ЩЖ и РЩЖ после хирургического лечения представлена в табл. 1. Через 1-3 мес. после проведенной операции у больных РЩЖ не произошло статистически значимых изменений уровней иммунологических показателей, напротив, отмечено снижение активности моно-
цитарно-макрофагального звена иммунитета, о чем можно судить по статистически достоверному уменьшению ПМТМ. При этом у больных РЩЖ продолжают сохраняться высокие значения уровней активированных лимфоцитов и спонтанной продукции ГЬ-6.
Таблица 1
Динамика показателей иммунного статуса у детей с доброкачественными и злокачественными узловыми новообразованиями ЩЖ
Иммунологический показатель Вид узловых новообразований
доброкачественные (n = 27) злокачественные (n = 33)
до лечения после лечения до лечения после лечения
СЭ2+, % 52,2±1,11** 56,6±1,25* ** 48,7±1,12** 51,5±1,22**
СЭ4+, % 28,1± 1,75 32,9±1,6* ** 29,8±1,68 26,7±1,44**
СЭ8+, % 25,1±1,0** 30,5±1,79* 29,2±1,5** 26,3±1,52
СЭ16+, % 15,8±0,67 16,7±0,61 16,8±1,0 16,1±0,58
СЭ20+, % 15,8±0,59 19,8±1,8* 16,5±0,8 16,6±0,42
CD95+, % - - 22,9±2,2 26,7±2,44
HLA-DR+, % - - 33,3±2,0 33,1±1,53
РБТЛ, % ФГА 30,9±1,84 33,4±1,32 30,6±1,95 31,4±1,98
КонА 23,4±2,54 25,3±1,53 24,0±2,05 23,5±1,76
ЛПС 30,7±0,99 35,2±0,93* ** 32,3±1,25 31,2±1,0**
БГЛ, % 2,8±0,22 3,7±0,19* ** 2,8±0,26 2,4±0,18**
ПМТМ, % 30,7±2,41 40,2±1,79* ** 34,8±1,68 29,1±1,45* **
IgG, г/л 8,86±0,47 9,84±0,49 9,27±0,33 9,12±0,18
^А, г/л 1,13±0,15 1,43±0,11 1,35±0,13 1,4±0,1
^М, г/л 0,96±0,04 1,09±0,07 0,96±0,07 0,98±0,07
IL-6 спонт., пг/мл - - 1105±2,5 1083,7±38,7
IL-6 стим., пг/мл - - 1198±46,4 1232,9±56,4
* - статистически достоверные отличия от показателей до лечения; ** - статистически достоверные различия между группами (р < 0,05).
Иной характер иммунологических изменений наблюдается у больных с доброкачественными опухолями. Проведение операции вызвало у них статистически достоверное улучшение целого ряда факторов клеточного иммунитета, включающих Т-клеточное, МК-клеточное, а также моноци-тарно-макрофагальное звенья иммунной системы. Так, у этих больных произошло повышение уровня Т-лимфоцитов за счет обеих регуляторных субпопуляций (СБ4+ и СБ8+ клеток), В-лимфоцитов, а также функциональной активности В-клеток в РБТЛ с ЛПС; кроме того, у них зарегистрированы позитивные изменения в МК-клеточном (повышение уровня БГЛ) и моноцитарно-макрофагальном (повышение ПМТМ) звеньях иммунной системы. Сопоставление значений иммунологических показателей у больных доброкачественными и злокачественными опухолями после окончания лечения показало статистически достоверно более высокий уровень у детей с доброкачественными новообразованиями таких пара-
метров, как процентное содержание Т-лимфоцитов, СБ4+ клеток, БГЛ, функциональной активности и В-лимфоцитов, а также ПМТМ (табл. 1).
Итак, проведение хирургического лечения узловых новообразований ЩЖ у детей вызывает неодинаковые изменения иммунного статуса в зависимости от их генеза. Оперативное вмешательство по поводу доброкачественных опухолей приводит к восстановлению (в ряде случаев до нормы) многих показателей клеточного и гуморального иммунитета, тогда как операция по поводу РЩЖ не вызывает изменений иммунного статуса.
Поскольку при доброкачественных новообразованиях и при РЩЖ выполняли операции различного объема гемитиреоидэктомию (ГТЭ), субтотальную резекцию (СТР), тиреоидэктомию (ТЭ), обеспечивающие разную степень сохранности эндокринной функции, нами был проведен раздельный анализ динамики иммунного статуса у этих больных, результаты которого представлены в табл. 2.
Таблица 2
Иммунный статус больных доброкачественными узловыми новообразованиями ЩЖ после хирургических операций разного объема
Иммунологический показатель, %, г/л Группа больных в зависимости от объема операции
ГТЭ (n = 15) СТР (n = 12)
до операции после операции до операции после операции
СD2+ 52,9±1,59 56,9±1,76 50,0±2,0 58,2±2,0*
СD4+ 26,6± 1,91 35,0±2,49* 27,6±2,28 31,3±1,79
СD8+ 27,5± 1,79 28,3±2,32 24,5±1,55 27,2±4,0
СD16+ 16,2±0,6 17,1±0,63 16,7±2,28 14,8±1,88
СD20+ 16,0±1,54 18,0±0,75 14,8±1,0 17,8±0,62*
БГЛ 2,7±0,41 3,8±0,3* 2,8±0,24 3,8±0,22*
РБТЛ ФГА 30,6±1,09 34,1±1,62 29,3±2,8 30,3±2,84
КонА 24,3±0,74 25,9±1,67 23,8±1,65 22,0±2,64
ЛПС 31,0±1,09 37,0±1,86* 30,2±1,65 32,3±1,75
IgG 9,4±0,58 9,8±0,36 7,8±0,35 9,2±0,48*
* - статистически достоверные отличия от показателей до операции (р < 0,05).
При доброкачественных опухолях после ГТЭ отмечено статистически достоверное повышение по сравнению с исходным содержания СБ4+ клеток, БГЛ и функциональной активности В-лимфоцитов в РБТЛ с ЛПС. После СТР регистрируется статистически значимое повышение содержание Т- и В-лимфоцитов, БГЛ, а также П^в.
В табл. 3 представлена динамика показателей иммунного статуса у больных РЩЖ в зависимости от объема проведенной операции, который характеризует распространенность процесса. Следует отметить, что среди исходных показателей у больных, которым была впоследствии выполнена ТЭ, уровень СБ8+ клеток был статистически достоверно выше, чем которым проводили органосохраняющие операции (СТР, ГТЭ). После послед-
них изменений иммунологических параметров по сравнению с исходными у больных не наблюдалось, тогда как ТЭ привела к статистически значимому повышению уровня Т-лимфоцитов при одновременном снижении исходно резко повышенного уровня СБ8+ клеток. Остальные показатели, включая содержание Т-хелперов, активированных лимфоцитов и уровни спонтанной и стимулированной продукции ГЬ-6, не менялись ни после органосохраняющих операций, ни после ТЭ (табл. 3, 4).
Таблица 3
Иммунный статус больных РЩЖ после хирургических операций разного объема
Иммунологический показатель,% Объем операции
ГТЭ + СТР (n = 19) ТЭ (n = 14)
до операции после операции до операции после операции
СD2+ 49,0±1,65 48,7±1,7 47,5± 1,41 56,5±3,7*
СD4+ 27,7±1,51 24,6±1,73 34,5±5,18 24,4±2,6
СD8+ 27,6± 1,42** 28,8±2,25 37,5±2,35** 27,8±3,26*
СD16+ 15,2±0,94 16,0±0,95 18,0±0,15 15,8±1,38
CD95+ 22,9±2,2 23,5±1,62 22,9±2,2 26,8±2,13
HLA-DR+ 33,3±2,0 34,3±2,09 33,3±2,0 31,3±1,56
РБТЛ ФГА 31,0±1,12 30,8±1,97 30,5±2,76 29,0±0,86
КонА 23,1±1,05 22,5±1,15 22,5±1,4 21,5±3,29
ЛПС 30,0±1,1 30,0±1,15 31,5±3,2 30,0±0,94
* - статистически достоверные отличия от показателей до лечения; ** - статистически достоверные различия между группами (р < 0,05).
Таким образом, наиболее эффективное восстановление иммунного статуса под влиянием проведенного лечения отмечено после операций, выполненных по поводу доброкачественных новообразований ЩЖ.
Таблица4
Уровни продукции ГЬ-6 после операций различного объема по поводу РЩЖ
Иммунологический показатель, пг/мл До операции После операции различного объема
ГТЭ+ СТР (n = 19) ТЭ (n = 14)
IL-6 спонт. 1105±42,5 1133,2±8,34 1114,6±37,5
IL-6 стим. 1198±46,4 1164,7±5,73 1322,9±55,07
При РЩЖ в послеоперационном периоде представляется целесообразным проведение иммунокоррекции на фоне заместительной терапии препаратами гормонов ЩЖ, поскольку одна гормонотерапия не способствует позитивной динамике иммунного статуса этих больных, несмотря на то, что после операции они находились в длительной клинической ремиссии (табл. 5).
Мы исследовали уровень продукции ГЬ-6 у больных с различным безрецидивным периодом после операции (больше и меньше 5 лет), а также у больных с наличием и отсутствием регионарных метастазов на момент первой опера-
ции. Нами не было получено статистически значимых различий в зависимости от длительности заболевания ни по продукции 1Ь-6, ни по уровню лимфоцитов с маркерами поздней активации и активационного апоптоза, из чего можно заключить, что данные нарушения являются стойкими. Группы с наличием или отсутствием регионарных метастазов также характеризуются сходными уровнями продукции 1Ъ-6 и содержанием НЬА-БК+ и СБ95+ лимфоцитов.
Таблица 5
Содержание лимфоцитов с маркерами активации и уровень продукции 1Ь-6 у больных РЩЖ в зависимости от приема Ь-тироксина
Иммунологический показатель Группа больных
без L-тироксина (n = 11) с L-тироксином (n = 22)
HLA-DR+, % 33,3±1,8 33,5±1,4
OD95+, % 23,4±1,63 27,7±2,2
IL-6 спонт., пг/мл 1116±48,3 988±181,8
IL-6 стим., пг/мл 1082±58,9 1143±161,7
Таким образом, несмотря на то, что больным раком щитовидной железы было проведено радикальное удаление опухоли, обеспечивающее длительную ремиссию, а также несмотря на заместительную терапию L-тирокси-ном, неблагоприятные изменения иммунного статуса продолжают сохраняться. Среди этих изменений, на наш взгляд, особенно важны высокий спонтанный уровень IL-6, который рассматривается как один из эндогенных факторов опухолевого роста, и повышенное содержание лимфоцитов с маркерами поздней активации (HLA-DR+, CD95+); последнее при наличии FasL может реализоваться в усилении апоптоза лимфоцитов. Хотя описанные изменения и не являются специфическими, наличие их после удаления опухоли может свидетельствовать о том, что иммунологический дисбаланс проявляется не столько как отражение ее действия на иммунную систему, сколько как иммунопатогенетическая основа для ее развития, а их сохранение может создавать условия для рецидивирования процесса.
Литература
1. Калинин А.П., Потемкина Е.Е., Пешева Н.В., Рафибеков Д.С. // Проблемы эн-докринол. 1994. Т. 40. № 3. С. 56-58.
2. Paschke R. et al. // J. Endocrinol. 1994. Vol. 141. № 2. P. 309-315.
3. Благосклонная Я.В. и др. // Проблемы эндокринол. 1998. Т. 44. № 4. С. 22-24.
4. Paola R. et al. // Clin. Endocrinol. and Metabol. 1997. Vol. 82. № 2. P. 670-677.
5. Амирова Н.М., Слесаренко С.С., Марон В.М. // Современные аспекты хирургической эндокринологии: Материалы восьмого (10) Рос. симп. по хирургической эндокринологии (Казань, 9-11 сентября 1999). М., 1999. С. 14-15.
6. Rosetkova E. et al. // Clin. Invest. Med. 1993. Vol. 16. P. 256-264.
7. Абрамов В.В. // Иммунология. 1996. № 1. С. 60-62.
8. ХаитовР.М., ПинегинБ.В., ИстамовХ.И. Экологическая иммунология. М., 1995.
9. Boyum A. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1968. Vol. 21 (Suppl. 77). P. 77.
10. Киндзельский Л.П., Бутенко А.К. // Эксперим. онкол. 1983. Т. 5. № 3. С. 3-6.
11. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры тканей в гематологии. Томск, 1992.
12. Новиков Д.К., Новикова В.И. Клеточные методы иммунодиагностики. Минск, 1979.
13. Демченко Т.А., Джагинян А.И. // Иммунология. 1981. № 4. С. 83-85.
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт 15 марта 2006 г.
УДК 61:618:577
СОСТОЯНИЕ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА В КУЛЬТУРЕ ВОРСИН ХОРИОНА БОЛЬНЫХ ПОЗДНИМ ГЕСТОЗОМ В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ
© 2006 г. А.Ю. Криворучко, А.Н. Квочко
Development of pre-eclampsia not associated with change of level of glucose in chorionic villi. But chorionic villi culture stay in hypoxic condition demonstrate decrease of glucose level in tissue, more in severe form of disease. Complication with hypotrophia demonstrated fast stop of glicolysis.
При нарушении маточно-плацентарного кровотока, являющегося основным компонентом развития позднего гестоза (ПГ), возникает дефицит кислорода и энергетических субстратов. В этом случае реакции компенсации направлены на усиление транспорта энергоносителей, в первую очередь глюкозы, через плацентарный барьер [1-3]. Потребление глюкозы синци-тиотрофобластом в условиях гипоксии значительно возрастает - для обеспечения энергетических потребностей плаценты активизируются процессы анаэробного гликолиза [4]. Для определения интенсивности этих процессов в динамике воздействия гипоксии мы изучили содержание глюкозы в ходе нагрузочных проб в культуре хориальных ворсин.
Материалы и методы
На основании клинического обследования для взятия образцов плацентарной ткани нами были выбраны 20 здоровых родильниц, 20 родильниц с легкой и 20 с тяжелой формой позднего гестоза. Объектом исследования служила плацента, полученная сразу после родов и во время операций кесарева сечения. Материал собирали в стерильных условиях, помещали в герметичную посуду, заполненную стерильным раствором Хенкса, и в течение 10 мин доставляли в лабораторию. В стерильном боксе немедленно производили дальнейшую подготовку материала и проведение нагрузочных проб гипоксией по модифицированному методу, описанному [5].
С целью моделирования in vitro патологических условий существования плаценты, приводящих к развитию ПГ, хориальную ткань культивировали в условиях гипоксии. Они создавались путем инкубации в течение 24 ч в термостате, разогретом до 37 °С, при непрерывном встряхивании, навески измельченной ткани массой 500 мг в герметично закрытой пла-
