CC BY
20
Серия «Биология. Экология» И З В Е С Т И Я
2012. Т. 5, № 4. С. 3-9 Иркутского
Онлайн-доступ к журналу: государственного
http://isu.ru/izvestia университета
УДК 591.148 + 681.785.4
Сравнение интенсивностей свечения ряда байкальских микроорганизмов, одноклеточных водорослей и рекомбинантного штамма Escherichia coli
В. И. Добрынин1,2, Е. В. Евсюнина2, Д. И. Стом2,3
1Национальный исследовательский Иркутский государственный технический университет, Иркутск 2Иркутский государственный университет, Иркутск 3Байкальский музей ИНЦ СО РАН, Листвянка E-mail: [email protected]
Аннотация. При помощи лабораторного фотометра, разработанного в Физико-техническом институте Иркутского государственного технического университета, сопоставляли интенсивность спонтанной люминесценции суспензий чистых культур байкальских микроорганизмов (Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, No-cardia sp., Pseudomonas aeruginosa, Sinedra acus radians), одноклеточных водорослей Scenedesmus quadri-cauda и Dunaliella salina со свечением суспензий рекомбинантного штамма Escherichia coli с клонированным lux-опероном Photobacterium leiognathi (данный штамм широко используется в биотестировании). Интенсивность люминесценции байкальских микроорганизмов составила 10-8-10-4 от интенсивности свечения рекомбинантной E. coli (Imax) в пересчете на одну клетку. Обнаружена длительная (более 1 ч) люминесценция водорослей после внешней засветки (порядка 10-3-Imax), которая может давать некоторый вклад в свечение водной среды оз. Байкал в фотической зоне.
Ключевые слова: Байкал, водоросли, люминесценция, микроорганизмы, фотометр.
Введение
Ранее проведённые исследования показали, что основные типы излучателей, формирующих световое поле океана на больших глубинах (биолюминесценция и естественная радиоактивность [13]), не дают существенного вклада в наблюдаемое явление свечения водной среды Байкала [8; 9; 11]. Этот факт обусловливает необходимость поиска иных источников света для объяснения природы байкальского свечения. Одним из возможных механизмов свечения может быть клеточная хемилюминес-ценция [1], представляющая значительный интерес с точки зрения разработки новых методов экологического мониторинга озера.
В связи с вышеизложенным мы изучили люминесценцию суспензий ряда микроорганизмов [5].
Первые наблюдения свечения байкальской воды при добавлении в неё различных видов микроорганизмов, фито- и зоопланктона [8] выполнены в 1990 г. Исследовали ракообразных (Epischura baicalensis, Cyclops kolensis), микроорганизмы (Pseudomonas sp., Achromo-bacter sp., Flavobacterium sp., Azotobacter sp.,
Micrococcus sp., Cromococcum sp.), сапрофитные, циано- и железобактерии, а также смыв с обрастания на глубинах 400 м. Импульсное свечение океанического типа (биолюминесценция) во всех этих наблюдениях не было обнаружено, однако в ряде экспериментов была установлена высокая корреляция между интенсивностью свечения микроорганизмов и их концентрацией [8; 9].
Рекомбинантные штаммы на основе Escherichia coli широко используются в научных исследованиях и биотехнологии [12]. Микробный биолюминесцентный сенсор «Эколюм-9», содержащий E. coli с клонированным lux-опероном морских светящихся бактерий Photobacterium leiognathi имеет довольно высокий уровень люминесценции, и поэтому был использован нами в качестве эталона для сравнения с ним свечения некоторых байкальских микроорганизмов.
Данная работа является продолжением исследований в направлении расширения видового состава тестируемых культур микроорганизмов. Предварительные результаты работы изложены в докладе [5].
Материалы и методы исследований
Объектами исследования являлись культуры, представленные в табл. 1. Культивирование микроорганизмов проводили в соответствии с общепринятыми микробиологическими методами [10; 14]. Суспензии бактерий получали путём смыва со среды РПА водным раствором
0,85%-ного хлористого натрия. Водоросли предварительно концентрировали центрифугированием (центрифуга ЦЛН-2, 5000 об/с). Объём исследуемых суспензий составлял 20, 50, 100, 2000 мл. Концентрацию клеток бактерий определяли методом Коха (чашечный метод) [14], водорослей - методом подсчёта в камерах Горяева, Розенталя [10].
Перед проведением измерений суспензии микроорганизмов выдерживали в темноте в течение 1-2 ч. Интенсивность их свечения измеряли при комнатной температуре на лабораторном фотометре, разработанном В. И. Добрыниным с соавторами [4]. Суспензии в кварцевых стаканах (50 мл) либо в стеклянных колбах (100 мл) устанавливали в интегрирующую
сферу фотометра. В качестве регистрирующего устройства в данном случае использовали фотоэлектронный умножитель ФЭУ-130 в режиме счёта фотонов [2], который обладает хорошими одноэлектронными характеристиками [15], низким и стабильным уровнем темновых шумов 1а, с практически пуассоновским распределением импульсов, что позволяет проводить измерения слабых световых потоков вблизи порога их обнаружения. Между ёмкостью с суспензией и фотокатодом ФЭУ располагается шторный затвор, применяемый для оперативного контроля темновых шумов. Измерения с одной пробой проводили в течение 0,5-1,5 ч при времени усреднения скорости счёта импульсов ФЭУ - 60 с.
При открытом шторном затворе (режим измерения) суммарная скорость счёта задаётся одноэлектронными импульсами, возникающими на аноде фотоэлектронного умножителя под действием исследуемой (1р) и фоновой засветок (I), а также темнового тока:
Iорп = 1р + 1Г + и
Таблица 1
Характеристика использовавшихся в исследовании культур микроорганизмов
№ Микроорганизм Источник (предоставлено) Среда культивирования
1 Bacillus subtilis, № 842 Восточно-Сибирский музей микробиологии ИГУ (штаммы изолированы из оз. Байкал) Рыбо-пептонный агар (РПА): ГРМ-агар - 36 г/л, агар микробиологический - 1 %, вода - 1 л
2 Micrococcus luteus, № 855
3 Nocardia sp., № 851
4 Pseudomonas aeruginosa Дрюккер В. В., Павлова О. Н. (ЛИН СО РАН) (штамм изолирован из оз. Байкал)
5 Escherichia coli, с lux-опероном Photobacterium leiognathi Микробный биолюминесцентный сенсор «Эколюм-9» (НВО «Иммунотех», Москва) РПА и питательная среда для выделения энтеробактерий (Эндо) г/л: пептон - 10; гидролизат казеина сухой - 10; дрожжевой экстракт - 1; №С1 - 3,4; №8 - 0,8; гидроортофосфат натрия - 0,75; лактоза -10; фуксин основной - 0,2; агар микробиологический - 10,5±2,5; рН (7,3±0,2)
б Scenedesmus quadricaudа Плеханов С. Е. (кафедра гидробиологии биологического факультета МГУ) ср. Успенского: КМ03 - 0,025 г, К2НР04 - 0,025 г, К2С03 - 0,0345 г, ]^04хН20 - 0,025 г, Са(Ш3)2 -0,100 г, раствор микроэлементов, вода - 1 л
7 Dunaliella salina ср. Артари: №С1 - 116 г, MgS04хH20 - 50 г, КШз - 2,5 г, К2НР04 - 0,2 г, вода - 1 л
В Аксеничная культура байкальских диатомей Synedra acus radians Группа культивирования отдела Ультраструктуры клетки (ЛИН СО РАН) БМ среда (мг/л): дистилл. вода - 1 л, Са(Ш3)2-Н20 - 20, КН2Р04- 12,4, MgS04x7H20 -25, МаНС03 - 16, №2хЭДТА - 2,25, Н3В03 - 2,48, МиС12х4Н20 - 1,39, (КН4)бМо7024х 4Н20 - 1, №28Ю3х5Н20 - 42,6, БеС13 - 1,6, цианокобаламина (витамина В12), тиамин гидрохлорида (витамина В1) и биотина - по 0,04
Световой фон (I) в данном случае обусловлен черенковским излучением, люминесценцией физиологического раствора и стенок сосуда под действием естественной радиации [7]. Он может изменяться после интенсивной внешней засветки (фосфоресценция примесей в стекле и отражающем покрытии интегрирующей сферы фотометра). Поэтому все манипуляции с образцами проводились с предварительной выдержкой проб в полной темноте.
При закрытом затворе в режиме контроля скорость счёта импульсов ФЭУ определяется только темновыми шумами:
гь=и
Разность измеряемых скоростей счёта при открытом и закрытом затворах пропорциональна потоку световых квантов, собираемых интегрирующей сферой фотометра на фотокатод ФЭУ:
М=1орп - Гь = 1Р + 1у.
Из этого выражения видно, что для определения уровня свечения микроорганизмов 1Р по результатам эксперимента необходимо провести дополнительные измерения фона 1-. Такие измерения проводили для сосудов, содержащих физиологический раствор в отсутствии микроорганизмов. Как правило, наблюдаемые значения I. для проб объёмом 50 и 100 мл были
Результаты измерений люм
меньше статистической погрешности измерений (If < ±1 с-1). Значения If становятся значимыми при измерениях в больших сосудах (V > 250 мл).
Интенсивность свечения суспензий рекомбинантного штамма E. coli с клонированным lux-опероном измеряли на лабораторном фотометре с одновременной регистрацией на приборе экологического контроля «Биотокс-10М». Сравнительный анализ данных измерений показал, что величина регистрируемого сигнала фотометра в пересчёте на 1 мл пробы E. coli равной концентрации превышает таковую на приборе «Биотокс-10М» в 10 раз.
Результаты и обсуждение
Результаты измерений относительной интенсивности люминесценции использованных в наблюдениях микроорганизмов представлены в табл. 2.
Интенсивность свечения суспензий бактериальных культур обычно не превышала значения Ip = 10 с-1 и через час наблюдений уменьшалась до 0-1 с-1. Под влиянием внешних воздействий (предварительное освещение, перемешивание) фиксировали весьма существенные изменения интенсивности свечения суспензий одноклеточных водорослей (до 500 с-1).
Таблица 2
сценции микроорганизмов
№ Объект t, °С Возраст культуры, сут. Объём, мл Концентрация, КОЕ (кл.)/мл £ Примечания
1 Pseudomonas aeruginosa 18 7 25 31011 1,5 -
1 50, 100 1,41011 < 1 -
2 Micrococcus luteus 25 1 50 5,7107 < 1 -
3 Nocardia sp. 25 1 50 В,5107 10 -
4 Bacillus subtilis 24 1 2000 9107 < 1 -
5 Рекомбинантный штамм E. coli 18 7 20 1,410В 7б 000 максимальное значение
б Dunaliella salina 22 1 50 1,5107 < 1 -
10-50 через час после засветки
7 Scenedesmus quadricaudа 23 1 50 1,3107 < 1 -
25±5 через час после засветки
В Synedra acus radians 24 7 100 3,5103 15 через сутки, приведено значение Д без учёта /у
1. Pseudomonas aeruginosa. С данной культурой проводили две серии экспериментов. В первой исследовали свечение суспензии бактерий, культивируемых на твёрдой питательной среде в течение семи суток, во второй - односуточной культуры. Концентрации клеток со-
ставляли 3-1011 и 1,4-1011 КОЕ/мл соответственно. Интенсивность свечения культуры в обоих случаях была незначительна: 1Р ~ 1 с-1.
2. Micrococcus Швш. Свечение суспензии культуры с концентрацией 5,7-107 КОЕ/мл было ниже порога обнаружения.
3. Nocardia sp. Интенсивность свечения составила Ip ~ 10 с-1 при концентрации бактерий в суспензии 8,5• 107 КОЕ/мл. Отсутствие длительной фосфоресценции культуры было проверено после засветки пробы под люминесцентной лампой.
4. Bacillus subtilis. Измерения свечения данной культуры (объём суспензии 2 л) не выявили значимого уровня свечения для культуры с концентрацией 9-107 КОЕ/мл.
5. Культура рекомбинантного штамма E. Coli с клонированными lux-генами Photobacterium leiognathi. Измерения интенсивности люминес-
ценции данного штамма E. coli проводили после культивирования бактерий на твёрдой питательной среде в течение семи суток. Динамика изменения интенсивности свечения пробы объёмом 20 мл с концентрацией клеток 1,4-108 КОЕ/мл представлена на рис. 1.
Наблюдаемое изменение интенсивности напрямую не связано с количеством живых клеток, поскольку через 24 ч интенсивность уменьшилась более чем втрое, в то время как концентрация бактерий снизилась незначительно (до 1,1-108 КОЕ/мл).
Время, час
Рис. 1. Интенсивность люминесценции суспензии рекомбинантного штамма Escherichia coli
6. Dunaliella salina. Измерение интенсивно- чения не наблюдали. После их экспозиции под
сти свечения суспензий водорослей проводили люминесцентной лампой (мощность 40 Вт,
в стеклянной и кварцевой посуде. Для клеток, расстояние 20 см, время 30 мин) возникает
предварительно выдержанных в темноте, све- длительное свечение (рис. 2).
1000
100 -
10
Время, мин
Рис. 2. Интенсивность индуцированного свечения суспензий Dunaliella salina после облучения пробы светом люминесцентной лампы. Треугольники - проба во время экспозиции находилась в кварцевом стакане, ромбы - в стеклянной колбе. Стрелками указаны моменты встряхивания проб
Наблюдаемое различие в уровнях интенсивности индуцированного свечения (на порядок величины) при одинаковых условиях экспозиции, по-видимому, обусловлено более высоким пропусканием кварца в сравнении со стеклом в коротковолновой области спектра (большей энергетической накачкой). В эксперименте наблюдали также увеличение регистрируемого фотоэлектронным умножителем потока фотонов сразу после перемешивания проб. Это, по-видимому, объясняется меньшим самопогло-щением излученных фотонов водорослями, находящимися во взвешенном состоянии. Быстрый спад интенсивности после перемешивания обусловлен осаждением водорослей и созданием ими ввиду большой концентрации эффекта внутреннего фильтра. Люминесценция проб на достаточно высоком уровне (1Р > 10-50 с-1), с малой скоростью затухания (наблюдалась более часа).
7. Scenedesmus quadricauda. При отсутствии собственного свечения наблюдается длительная люминесценция суспензий культуры водорослей после облучения её светом люминесцентной лампы (условия освещения такие же, как в п. 6) (рис. 3). Время затухания свечения во втором эксперименте с данной культурой намного превышает время наблюдений. После быстрой фазы уменьшения интенсивности, связанной с осаждением, она стабилизируется на уровне Ip = 25±5 о-1.
8. Synedra acus radians. После установки в фотометр пробы с культурой (3500 кл/мл, 100 мл) интенсивность люминесценции пробы Д! в течение часа уменьшилась с 40 с-1 до 15 с-1, и оставалась на таком уровне (с отклонениями в ±5 с-1) в течение 24 ч. К сожалению, в этом эксперименте не был точно определён световой фон пробы If, что не позволило получить достаточно надежную оценку для Ip.
100 - Ip, с-1 \ Гч-
10
, 1 Ї 1 і
0 20 40 60 Время, мин
Рис. 3. Интенсивность люминесценции суспензий ^сепейеяшия циаёпсаиёа после облучения культуры светом люминесцентной лампы. Ромбы - первый эксперимент, треугольники - повторный эксперимент. Стрелками указаны моменты встряхивания проб
Интенсивность люминесценции для ряда изученных в данной работе бактериальных культур из оз. Байкал варьировала в пределах четырёх порядков величины (2,0-10-13-2,4-10-9 с-1) на одну клетку. Максимум интенсивности свечения рекомбинантного штамма Е. соїі составил 2,7-10-5 с-1 на клетку. Соответственно, яркость свечения штамма с клонированным їих-опероном превышала яркость байкальских бактерий в 104-108 раз (указан порядок величин).
Уровень спонтанной люминесценции водорослей В. salina и & quadricauda на одну клетку был ниже (1,3 и 1,5)-10-9 с-1, резко возрастал после внешней засветки, и через час после это-
го падал до 3,7-10-8 и 6,7-10-8 с-1 соответственно. Относительная яркость длительной фотолюминесценции водорослей в сравнении с рекомбинантным штаммом Е. соИ находилась на уровне (2,5 и 1,4)-10-3. Результаты этих экспериментов позволяют высказать предположение
о возможном вкладе фотолюминесценции водорослей в свечение байкальской воды на глубинах эффективного фотосинтеза.
Заключение
В работе получены новые данные по уровню спонтанной люминесценции ряда культур байкальских микроорганизмов и одноклеточных
водорослей. Проведено сравнение относительных интенсивностей свечения с уровнем люминесценции рекомбинантного штамма Escherichia coli. Обнаружена длительная фотоиндуцирован-ная люминесценция одноклеточных водорослей.
В дальнейшем планируется проведение измерений свечения культур байкальских микроводорослей и характера светового воздействия на его интенсивность. Такие исследования особенно актуальны в связи с недавно обнаруженной корреляцией интенсивности спонтанного свечения и концентрацией хлорофилла для ряда проб байкальской воды [6].
Авторы признательны М. Н. Саксонову за проведение измерений люминесценции E. coli на приборе экологического контроля «Биотокс-10М»; Н. М. Будневу, Н. А. Иванову и Н. И. Граниной за ценные советы и организационную поддержку.
Работа проводилась при частичной поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашения ГК: № 16.525.11.5013 от 26.10.2011, № 14.B37.21.0785 от 24.08.2012, № 11.519.11.5016 от 28.10.11, № 14.B37.21.1225 от 18.09.2012) и Программы стратегического развития.
Литература
1. Владимиров Ю. А. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция / Ю. А. Владимиров, Е. В. Проскурнина // Успехи биол. химии. -2009. - Т. 49. - С. 341-388.
2. Гулаков И. Р. Метод счёта фотонов в оптикофизических измерениях / И. Р. Гулаков, С. В. Хо-лондырев. - Минск : Университ., 1989. - 256 с.
3. Дерябин Д. Г. Особенности реагирования природного и рекомбинантного люминесцирующих микроорганизмов в присутствии ионов Fe2+ / Д. Г. Дерябин, И. Ф. Каримов // Прикл. биохимия и микробиология. - 2010. - Т. 46, № 1. - С. 35-39.
4. Добрынин В. И. Лабораторный фотометр для исследования слабого свечения водных сред /
В. И. Добрынин, А. Е. Краснояров, А. Г. Ченский //
Вестн. Иркут. гос. техн. ун-та. - 2010. - № 5 (45). -
С. 341-345.
5. Добрынин В. И. Люминесценция некоторых групп микроорганизмов / В. И. Добрынин, Е. В. Ев-сюнина, В. А. Быбин // Проблемы экологии : чтения памяти проф. М. М. Кожова : тез. докл. Междунар. науч. конф. Иркутск, 20-25 сент. 2010 г. - Иркутск : Изд-во Иркут. гос. ун-та, 2010. - С. 405.
6. Добрынин В. И. О корреляции свечения байкальской воды с флуоресценцией хлорофилла / В. И. Добрынин // Оптика атмосферы и океана. -2011. - Т. 24, № 5. - С. 366-370.
7. Добрынин В. И. Сверхслабая люминесценция природных вод / В. И. Добрынин // Пятая Верещагинская байкальская конф. : тез. докл. и стенд. сообщений (Иркутск, 4-9 октября 2010 г). - Иркутск : Аспринт, 2010. - С. 221-223.
8. Добрынин В. И. Свечение водной среды как источник фона для нейтринных телескопов на озере Байкал : дис. ... канд. физ-мат. наук : 07.00.02 / В. И. Добрынин. - М. : ИЯИ РАН, 1993. - 215 с.
9. Добрынин В. И. Свечение водной среды оз. Байкал и экологический мониторинг / В. И. Добрынин // Мониторинг и оценка состояния Байкала и Прибайкалья. - Л. : Гидрометеоиздат, 1991. - С. 79-85.
10. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике / Л. А. Сиренко [и др.]. - Киев : Наукова думка, 1975. - 247 с.
11. О свечении глубинных вод оз. Байкал / Л. Б. Безруков [и др.] // Докл. АН СССР. - 1984. -Т. 277, № 5. - С. 1240-1244.
12. Перспективы использования современных биолюминесцентных экспресс-методов / А. П. Зарубина [и др.] // Изв. науч.-техн. о-ва «Кахак», 2012. -№ 2(36). - С. 90-96.
13. Световой фон океана / В. И. Ильичев [и др.] ; отв. ред. В. И. Ильичев, А. А. Петрухин. - М. : Наука, 1990. - 115 с.
14. Теппер Е. З. Практикум по микробиологии / Е. З. Теппер, В. К. Шильникова, Г. И. Переверзе-ва. - М. : Колос, 1979. - 216 с.
15. Характеристики ФЭУ-130 / Б. В. Архангельский [и др.] // Приборы и техника эксперимента. - 1986. - № 1. - С. 163-165.
The comparison of a few Baikal microorganisms and unicellular algae luminescence intensity with that of Escherichia coli recombinant strain
V. I. Dobrynin1’2, E. V. Evsyunina2, D. I. Stom2,3
1 National Research Irkutsk State Technical University, Irkutsk
2 Irkutsk State University, Irkutsk
3 Baikal Museum ISC SB RAS, Listvyanka
Abstract. The intensity of spontaneous luminescence microorganism’s suspension of the pure Baikal culture (Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Nocardia sp., Pseudomonas aeruginosa, Sinedra acus radians), unicellular algae (Scenedesmus quadricauda and Dunaliella salina) and recombinant strain with included lux-operon (Escherichia coli) was compared by means of self-made setup (laboratory photometer, designed in Physical and Technical Insti-
tute of Irkutsk State Technical University). The strain E. coli is widely using in bio testing. Lake Baikal microorganism’s luminescence intensity upon recalculation on one cell was 108-104 times lower than that of recombinant E. coli (Imax). Algae’s prolonged luminescence after external lighting was found. It is only 103 times lower than Imax and can give some impact into Baikal water luminescence in the photic zone.
Keywords: luminescence, microorganisms, algae, photometer, Lake Baikal.
Добрынин Виктор Иванович
Иркутский государственный технический
университет
664074, Иркутск ул. Лермонтова, 83 кандидат физико-математических наук ведущий научный сотрудник тел.: (4232) 40-59-03 E-mail: [email protected]
Dobrynin Victor Ivanovich National Research Irkutsk State Technical University 83 Lermontova St., Irkutsk, 664074 Ph. D. in Physics & Mathematics leading research scientist phone: (4232) 40-59-03 E-mail: [email protected]
Евсюнина Елена Владимировна Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5 аспирант
тел.: (3952) 24-18-70 E-mail: [email protected]
Evsyunina Elena Vladimirovna Irkutsk State University 5 Suhe-Bator St., Irkutsk, 664003 doctoral student phone: (3952) 24-18-70 E-mail: [email protected]
Стом Дэвард Иосифович Иркутский государственный университет 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5 доктор биологических наук, профессор тел.: (3952) 24-18-70 E-mail: [email protected]
Stom Devard Iosiphovich Irkutsk State University 5 Suhe-Bator St., Irkutsk, 664003
D. Sc. of Biology, Prof. phone: (3952) 24-18-70 E-mail: [email protected]
