CC BY
685
Th1/Th2 cytokines and their specific transcription factors in human helper T-cell clones. Immunol. Cell. Biol. 2005; 83: 536-41.
13. Ylikoski E., Lund R., Kylaniemi M., Filen S., Kilpelainen M., Savolainen J. et al. IL-12 up-regulates T-bet independently of IFN-Y in human CD4+ T cells. Eur J. Immunol. 2005; 35: 1-10.
14. He Y.W., Deftos M.L., Ojala E.W., Bevan M.J. ROR-gamma-t, a novel isoform of an orphan receptor, negatively regulates Fas ligand expression and IL-2 production in T-cells. Immunity. 1998; 9: 797-806.
15. Sun Z., Unutmaz D., Zou Y.R., Sunshine M.J., Pierani A., Brenner-Morton S., Mebius R.E., Littman D.R. Requirement for ROR-gamma in thymocyte survival and lymphoid organ development. Science. 2000; 288: 2369-73.
16. Burgler S., Mantel P.Y, Bassin C., Ouaked N., Akdis C.A. Schmidt-
Weber C.B. RORC2 is involved in T cell polarization through interaction with the Foxp3 promoter. J. Immunol. 2010; 11: 6161-9.
17. Santis A.G., López-Cabrera M., Sánchez-Madrid F., Proudfoot N. Expression of the early lymphocyte activation antigen CD69, a c-type lectin, is regulated by mRNA degradation associated with AU-rich sequence motifs. Eur. J. Immunol. 1995; 25 (8): 2142-6.
18. López-Cabrera M., Santis A.G., Fernández-Ruiz E., Blacher R., Esch F., Sánchez-Mateos P. et al. Molecular cloning, expression, and chromosomal localization of the human earliest lymphocyte activation antigen AIM/CD69, a new member of the C-type animal lectin superfamily of signal-transmitting receptors. J. Exp. Med. 1993; 178 (2): 537-47.
Received 29.04.14
© коллектив авторов, 2014
удк 616.9-022.-07:616.155.3-008.13-073.537
Ширшев С.В., Куклина Е.М., Заморина С.А., Некрасова И.В., Никитина Н.М.
способ определения фагоцитарной активности лейкоцитов по степени гашения биолюминесценции
ФгБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН, 614081, г Пермь, РФ
Разработан новый инструментальный метод оценки фагоцитоза живых бактериальных объектов, представленных рекомбинантным штаммом E. coli, который несет lux-регулон морской люминесцирующей бактерии V.fischeri («Эколюм-5»). В качестве тестируемых клеток используются цельная периферическая кровь, сепарированные нейтрофилы и мононуклеарные клетки. Принцип метода основан на уменьшении люминесценции E. coli lux+ в динамике поглощения их фагоцитами. В качестве показателя фагоцитарной активности наряду с абсолютными показателями биолюминесценции используется индекс фагоцитарной активности (ИФА), позволяющий сопоставлять абсолютные значения, которые получены в разных клеточных системах. Достоверность метода подтверждена микроскопическим методом оценки процента фагоцитоза латексных частиц, фагоцитарного числа и ИФА. Дополнительно проведена оценка жизнеспособности E. coli lux+ по количеству колониеобразующих единиц в динамике контакта лейкоцитов с объектами фагоцитоза.
Ключевые слова: биолюминесценция; фагоцитоз; E. coli lux+; периферическая кровь; нейтрофилы; мононуклеарные клетки.
Для цитирования: Иммунология. 2014; 35 (6): 312-317. Shirshev S.V., Kuklina E.M., Zamorina S.A., Nekrasova I.V., Nikitina N.M.
THE METHOD FOR DETERMINATION OF LEUKOCYTES PHAGOCYTIC ACTIVITY BY BIOLUMINESCENCE EXTINCTION DEGREE
Institute of ecology and genetics of microorganisms UB RAS, 614081, Perm, RF
The new objective instrumental method of the phagocytosis assessment of viable bacterial cells that are presented by a recombinant of E. coli strain («Ecolum-5») bearing lux-regulon of a sea luminescent bacterium V. fischeri is developed. Whole peripheral blood, separated neutrophils and mononuclear cells are used as testing cells. The principle of the method is based on reduction of E. coli lux+ luminescence during ingestion by phagocytes. In addition to absolute bioluminescence value the index of phagocytic activity (IPA) that enables to compare absolute values received in different cellular systems is used as indicator of phagocytic activity. Reliability of the method is confirmed with microscopic method of assessment of latex particles phagocytosis percent, phagocytic number and phagocytic index. Additionally the estimation of E coli lux+ viability is carried out by number of the colony forming units in dynamics of contact of leukocytes with phagocytosis objects.
Key words: bioluminescence; phagocytosis; E. coli lux+; peripheral blood; neutrophils; mononuclear cells.
citation: Immenologiya. 2014; 30 (6): 312-317. (in Russian)
Известно, что многие заболевания или патологические состояния сопровождаются изменением фагоцитарной активности лейкоцитов. К настоящему времени разработано достаточное количество методов оценки фагоцитарной активности,
Для корреспонденции: Ширшев сергей викторович,
shirshev@iegm. ru
For correspondence: Shirshev Sergey Victorovich, shirshev@ iegm.ru
среди которых наибольшее распространение получили тесты, основанные на регистрации поглощения объектов фагоцитоза клетками. Результаты данных исследований можно учитывать микроскопически, в частности, по поглощению формалини-зированных эритроцитов барана [1] или латексных частиц [2] фагоцитами крови. Другой распространенный метод - проточная цитометрия с использованием витальных красителей. Таким образом оценивают фагоцитоз дрожжей [3], стафилококков [4-6] и других микроорганизмов. Известен и метод оценки поглощения бактерий, меченных радиоизотопами [7].
Недостатком микроскопического метода являются трудоемкость и в ряде случаев субъективность подсчета, особенно если в качестве объектов фагоцитоза используют отдельные микроорганизмы или частицы латекса. Для ряда лабораторий существенным ограничением в применении радиоизотопного и цитофлюориметрического методов является высокая стоимость аппаратуры и расходных материалов.
Изучение бактериальной люминесценции в последние время стало одним из интенсивно разрабатываемых направлений в микробиологии [8]. Известно практическое использование данного феномена при проведении биотестирования загрязнения поверхностных водоемов, промышленных стоков и почв, а также при определении степени токсичности вновь синтезируемых химических соединений и фармацевтических препаратов [9].
Разработана серия бактериальных тест-систем под общим названием «Эколюм», представленная генно-инженерными конструкциями с генами свечения морских светящихся бактерий. В частности, в состав «Эколюм-5» [10] входит рекомбинантный штамм E. coli TG1, несущий /мх-регулон морских светящихся бактерий Vfischeri [10]. Клонирование различных /мх-оперонов в микроорганизмах вида E. coli, проявляющих свойства как комменсалов (в толстой кишке человека и млекопитающих), так и потенциальных патогенов (при переходе через эндоэкологические барьеры), создало условия для формирования принципиально нового направления использования биолюминесцентного анализа в биологии и медицине - тестирования различных биологических жидкостей и биосред макроорганизма. Так, изучены особенности реагирования бактериальной люминесценции на воздействие сыворотки крови, мочи, слюны, спинномозговой и других биологических жидкостей [11]. Показано, что интенсивность тушения люминесценции «Эколюм-5» достоверно коррелирует с развитием бактерицидного эффекта, а также с уровнем бактерицидной активности сыворотки, определенной традиционным нефелометрическим методом [12]. Однако оценка фагоцитарной активности клеток крови с использованием бактериальной люминесценции ранее практически не использовалась.
Цель исследования - разработка нового способа определения фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови с использованием бактериальной люминесценции.
Материалы и методы. Мы использовали три различных объекта исследования: цельную кровь, сепарированные мо-нонуклеарные клетки периферической крови (МПК) и фракционированные нейтрофилы.
Для оценки фагоцитарной активности цельной крови использовали венозную кровь, которую собирали в стерильную пробирку (2 - 4 мл), содержащую гепарин (50 ЕД/мл). МПК получали центрифугированием в градиенте плотности (p = 1,077 г/см3) фиколл-верографина («Sigma», США; «Спо-фа», Чехия, соответственно). Кровь, разбавленную в 2-3 раза физиологическим раствором, наслаивали на градиент (3 мл) и центрифугировали в течение 40 мин при 1700 об/мин. Выделенные мононуклеарные клетки помещали в антиадгезивную пластиковую центрифужную пробирку и дважды отмывали физиологическим раствором. Концентрацию клеток доводили до 5-106/мл. Нейтрофилы получали аналогич-
ным образом на двойном градиенте. Для этого в пластиковую пробирку вносили по 3 мл раствора низкой плотности фиколл-верографина (p =1,077 г/см3), затем подслаивали 3 мл раствора высокой плотности (p =1,112 г/см3). Кровь, разбавленную в 2-3 раза физиологическим раствором, наслаивали на фиколл-верографин и центрифугировали 40 мин при 1700 об/мин. Нейтрофилы собирали с нижней интерфазы. Выделенные клетки помещали в пластиковую центрифужную пробирку и дважды отмывали физиологическим раствором. Концентрацию нейтрофилов доводили до 5Ч06/мл.
В качестве объектов фагоцитоза использовали лиофи-лизированную культуру люминесцентных бактерий генно-инженерного штамма E. coli lux+. Одну ампулу препарата разводили в 1 мл холодной дистиллированной воды, выдерживали 1 ч при 40С, после чего доводили физиологическим раствором до 50 мл, получая рабочую концентрацию бактерий 5-106/мл.
Для постановки реакции объекты исследования (цельная кровь, суспензия МПК и нейтрофилы) в количестве 100 мкл (5-106/мл, 25% аутоплазмы) смешивали с 1000 мкл разведенной культуры (5-106/мл) E.coli lux+, тщательно ресуспендиро-вали, затем измеряли биолюминесценцию на 0, 10, 30 и 60-й минутах инкубации при 370С на приборе «Биотокс-6» (область спектральной чувствительности 300-800 нм; область максимальной чувствительности 440-490 нм; динамический диапазон измерения светового потока 106-109 квант/с; диапазон времени измерения реакции 4 с). Пробы изучали в соответствии с «Методикой экспрессного определения токсичности воды с помощью люминесцентного бактериального теста "Эколюм"», утвержденной руководителем Департамента Госсанэпиднадзора Минздрава России А.А. Монисовым 08.06.2000 МР № 11 1/133-09 (сертифицирована Государственным комитетом РФ по стандартизации и метрологии, свидетельство № 01.19. 231/2001.
Результаты фиксировали в импульсах в секунду и представляли в процентах гашения биолюминесценции. Кроме того, использовали индекс фагоцитарной активности (ИФА), отражающий процент гашения биолюминесценции в сравнении с исходным уровнем. ИФА=100 • (Х1-Х2)/Х1, где Х1 - интенсивность биолюминесценции контрольной пробы (в отсутствие клеток крови), Х2 - опытной пробы.
Параллельно проводили высевы культуры E. coli lux+ на среду Эндо (селективная среда для энтеробактерий) в те же временные периоды контакта бактерий с фагоцитами, после чего спустя сутки оценивали количество жизнеспособных клеток по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ).
Для сравнения полученных результатов изучали фагоцитарную активность лейкоцитов микроскопическим методом по поглощению объектов фагоцитоза (частицы латекса 1,5 мкм, «ДиаМ», Россия). Для этого в капроновых пробирках смешивали 100 мкл трижды отмытых в физиологическом растворе объектов фагоцитоза (концентрация 108/мл) и 100 мкл цельной гепаринизированной крови, суспензии МПК или нейтрофилов. Пробы инкубировали с аналогичными интервалами времени при 370С. Затем содержимое пробирок ресуспендировали и готовили мазки, которые фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому-Гимзе.
Таблица 1
Изменение активности биолюминесценции и количества живых клеток E. coli lux+ (в КОЕ) при разных сроках контакта с клетками крови (n = 6)
Время инкубации, мин Биолюминесценция, имп/с КОЕ, кл/мл
E.coli lux+ 5-106/мл + физиологический раствор(контроль) E.coli lux+ 5-106/мл + цельная кровь ИФА E.coli lux+ 5-106/мл + физиологический раствор (контроль) E.coli lux+ 5-106/мл + цельная кровь
0 347 542 ± 12 041 48 206 ± 1064 0 163 ± 15,0 (-105) 165 ± 11,0 (-105)
10 384 246 ± 18 757 40 402 ± 1871 16,2 161 ± 6,8 (-105) 140 ± 10,0 (-105)
30 393 311 ± 14 740 14 495 ± 1127 69,9 167 ± 11,8 (-105) 0,82 ± 0,18 (-105)
60 405 574 ± 20 124 5326± 167 88,9 154 ± 8,7 (-105) 0,005 ± 0,002 (-105)
Таблица 2
Изменение фагоцитарной активности лейкоцитов цельной крови стандартным микроскопическим методом при разных сроках контакта с частицами латекса (п = 6)
Время инкубации, Процент Фагоцитар- Фагоцитарный
мин фагоцитоза ное число индекс
10 33,34 ± 2,22 1,77 ± 0,05 0,273 ± 0,015
30 42,11 ± 2,63 1,94 ± 0,25 0,409 ± 0,078
60 64,24 ± 6,04 3,23 ± 0,21 1,076 ± 0,162
Рассчитывали следующие показатели:
1) процент фагоцитоза - количество клеток, захвативших 1 объект фагоцитоза и более из 100 подсчитанных фагоцитов;
2) фагоцитарное число - количество объектов фагоцитоза, которое в среднем приходится на 1 из 100 подсчитанных фагоцитов;
3) фагоцитарный индекс - количество объектов фагоцитоза, которое приходится на 1 истинный фагоцит.
В каждом случае использовали кровь 6 здоровых доноров. МПК и нейтрофилы после выделения оценивали на жизнеспособность, используя витальный краситель - эозин (0,1%). Жизнеспособность клеток во всех пробах была не ниже 97%.
Полученные экспериментальные данные обрабатывали при помощи вариационной статистики. Для переменных, представляющих анализируемую выборку, вычисляли арифметическое среднее и ошибку вычисления среднего (М ± m). В некоторых случаях рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона (г), который считали значимым при p < 0,05.
Результаты. Как видно из табл. 1, лейкоциты периферической крови подавляют биолюминесценцию E. coli lux+. Это проявляется уже на 10-й минуте инкубации и последовательно нарастает в ходе культивирования, приводя на 60-й минуте к почти полному гашению свечения. Аналогичную динамику демонстрирует и снижение содержания жизнеспособных E. coli lux+ (в КОЕ), что говорит о прямой связи гашения биолюминесценции с элиминацией и/или инактивацией бактерий в пробе (г = 0,98; p < 0,05). При этом важно отметить, что биолюминесценция E. coli lux+, как и количество КОЕ в контрольных посевах в отсутствие клеток крови, практически не изменялась в динамике наблюдения.
При оценке фагоцитарной активности лейкоцитов стандартным микроскопическим методом (поглощение частиц латекса) выявили обратную динамику - последовательный рост в ходе инкубации как процента фагоцитирующих клеток, так и удельного числа поглощенных объектов (табл. 2). На рис. 1 приведены относительные показатели фагоцитарной активности цельной крови, ИФА и количества КОЕ. Очевидно, что степень повышения фагоцитарной активности обратно пропорциональна степени снижения биолюминесценции и количеству КОЕ (см. рис. 1), что указывает на фагоцитарный генез гашения биолюминесценции. Результаты корреляционного анализа показали наличие тесной обратной корреляционной связи между процентом фагоцитоза латексных частиц и показателями биолюминесценции (г = -0,87; p < 0,05), а также биолюминесценцией и числом КОЕ (г = -0,72, p < 0,05).
Рис. 1. Изменение уровня биолюминесценции в динамике при контакте с клетками цельной крови (1), числа живых клеток (КОЕ) E.coli lux+ (2) и ИФА (5)
Недостатком оценки фагоцитарной активности лейкоцитов цельной крови является дополнительное гашение биолюминесценции эритроцитами. Однако расчет ИФА от точки 0, т. е. когда за контроль берут готовую фагоцитарную систему, позволяет сопоставлять динамику процесса с другими данными. В определенных условиях этот метод можно использовать как тест первого уровня для оценки нарушений системы фагоцитоза в целом.
В клинической практике и экспериментальных исследованиях необходимо знать, какие клетки и в какой степени участвуют в процессах фагоцитоза. Фракционирование ней-трофилов и моноцитов периферической крови с последующей оценкой их фагоцитарной активности позволяет определить функциональную активность этих клеток. Известно, что в ряде случаев снижение нейтрофильного или моноцитар-ного фагоцитоза тесно ассоциировано с врожденной и/или приобретенной патологией, приводящей к незавершенному фагоцитозу и персистенции патогенов [13]. Благодаря фракционированию лейкоцитов можно идентифицировать, какие клетки и каким образом осуществляют фагоцитоз бактерий. Кроме того, система позволяет определить влияние различных фармакологических агентов и биологически активных соединений на фагоцитарную активность отдельных клеток. Для этого достаточно предварительно фракционированные лейкоциты проинкубировать с интересующими исследователей агентами [14]. Кроме того, можно дифференцировать врожденную патологию и/или наведенную активность со стороны других лейкоцитов периферической крови [15]. В связи с этим дальнейшие исследования проводоли на сепарированных нейтрофилах и фракции МПК, основными фагоцитами среди которых являются моноциты.
Нейтрофилы так же, как и клетки цельной крови, эффективно подавляют биолюминесценцию E. coli lux+, начиная с 10-й минуты инкубации, что сопряжено с процессами физического уничтожения бактерий (табл. 3). Результаты аналогичных исследований по оценке фагоцитарной активности
Таблица 3
Изменение активности биолюминесценции и количества живых клеток E. coli lux+ (в КОЕ) при разных сроках контакта с нейтро-филами крови (n = 6)
Время Биолюминесценция, имп/с КОЕ, кл/мл
инкубации, E. coli lux+ 5-106/мл + физиоло- E. coli lux+ 5-106/мл + ИФА E.coli lux+ 5-106/мл + физиологи- E.coli lux+ 5-106/мл +
мин гический раствор (контроль) суспензия нейтрофилов ческий раствор (контроль) суспензия нейтрофилов
0 347 542 ± 12 041 270 733 ± 12 633 0 163 ± 15,0 (-105) 158 ± 11,0 (-105)
10 384 246 ± 18 757 255 830 ± 11 979 5,5 161 ± 6,8 (-105) 154 ± 16,0 (-105)
30 393 311 ± 14 740 153 022±3 539 43,5 167 ± 11,8 (-105) 149 ± 13,0 (-105)
60 405 574 ± 20 124 33 644 ± 1 555 87,6 154 ± 8,7 (-105) 0,026 ± 0,009 (-105)
120 п
♦ 0
Рис. 2. Изменение уровня биолюминесценции в динамике при контакте с нейтрофилами (1), числа живых клеток (в КОЕ) E.coli lux+ (2) и ИФА (3).
Рис. 3. Изменение уровня биолюминесценции в динамике при контакте с МПК (1), числа живых клеток (в КОЕ) E.coli lux+ (2) и ИФА (3).
микроскопическим методом подтверждают, что главным механизмом в данном случае является процесс фагоцитоза (табл. 4). Гашение биолюминесценции опережает уменьшение количества КОЕ в динамике эксперимента, однако эти процессы прямо коррелируют между собой (r = 0,89; p < 0,05). Возможно, это связано с биоцидным эффектом нейтро-филов, а также с особенностями адгезии и поглощения бактерий данными клетками (рис. 2). Таким образом, гашение биолюминесценции и снижение количества КОЕ в посевах обусловлены процессом фагоцитирования E. coli lux+ ней-трофилами крови. Это подтверждается и наличием тесной обратной корреляционной связи между процентом фагоцитоза латексных частиц нейтрофилами и показателями биолюминесценции (r = -0,98; p < 0,05), а также числом КОЕ (r = -0,97;p < 0,05). Биолюминесценция E. coli lux+ в отсутствие нейтрофилов также менялась весьма незначительно в сравнении с таковой в экспериментальных пробах, в то время как колиество КОЕ оставалось неизменным (см. табл. 3). ИФА в данном случае совпадает с ИФА цельной крови, что подтверждает ключевую роль нейтрофилов в процессах клиренса корпускулярных патогенов и позволяет использовать данный индекс вне зависимости от чувствительности системы.
При оценке фагоцитоза клеточной взвеси, содержащей лимфоциты и моноциты (МПК), установили, что на протяжении всего срока наблюдения моноциты, начиная с 10-й минуты, как и нейтрофилы, гасят биолюминесценцию E. coli lux+. Однако их фагоцитарная активность менее выражена, чем у нейтрофилов. Это подтверждает и тест на жизнеспособность бактерий (табл. 5). Результаты корреляционного анализа показали достоверную корреляцию между показателями биолюминесценции и количеством КОЕ (r = 0,98; p < 0,05). При аналогичном исследовании с латексом установили, что в отличие от нейтрофилов моноциты более активно поглощают корпускулярные объекты небактериальной природы (табл. 6). Из этого следует, что латексный тест не в полной мере отражает способность моноцитов фагоцитировать живые бактериальные объекты.
Как и ранее, установили достоверную обратную корреляцию между процентом фагоцитоза латексных частиц моно-
Таблица 4
Изменение фагоцитарной активности нейтрофилов при разных сроках контакта с частицами латекса (п = 6)
Время инкубации, мин Процент Фагоцитарное Фагоцитарный
фагоцитоза число индекс
10 39,55 ± 3,8 1,26 ± 0,07 0,375 ± 0,057
30 46,58 ± 3,47 1,68 ± 0,12 0,412 ± 0,061
60 63,28 ± 5,22 2,17 ± 0,38 0,548 ± 0,116
цитами и показателями биолюминесценции (r = -0,87; p < 0,05), а также биолюминесценции и количеством КОЕ (r = -0,96;p < 0,05).
Если сопоставить ИФА по всем трем клеточным системам, то можно видеть, что наибольшей активностью обладают нейтрофилы, уровень фагоцитоза которых более полно соотносится с ИФА цельной крови (см. рис. 1, 2; рис. 3). По-видимому, такие результаты связаны еще и с методическими особенностями, заключающимися в более низкой удельной концентрации потенциальных фагоцитов в лейкоцитарной суспензии. При сепарации нейтрофилов их удельная концентрация в общем объеме лейкоцитов существенно выше, чем моноцитов в МПК. Поэтому при использовании разработанной нами методики оценки фагоцитоза применительно к конкретным типам фагоцитирующих клеток необходимо более точно учитывать концентрацию потенциальных фагоцитов.
Следует отметить, что измерение фагоцитарной активности лейкоцитов, согласно предложенной методике, может быть проведено не только на приборе «Биотокс», но и на других биолюминометрах, например Luminoscan Ascent («Thermo electron corporation», Финляндия). На разных приборах интенсивность люминесценции выражают в различных единицах, поэтому расчет ИФА удобен для приведения результатов к единому знаменателю.
Таким образом, чем выше уровень фагоцитарной актив-
Таблица 5
Изменение активности биолюминесценции и количества живых клеток E. coli lux+ (в кое) при разных сроках контакта с МПК (n = 6)
Время Биолюминесценция, имп/с КОЕ, кл/мл
инкубации, E.coli lux+ 5-106/мл + физиологический E.coli lux+ 5-106/мл + ИФА E.coli lux+ 5-106/мл + физиоло- E.coli lux* 5-106/мл
мин раствор (контроль) суспензия МПК гический раствор (контроль) + Суспензия МПК
0 347 542 ± 12 041 362 410 ± 16 741 0 163 ± 15,0 (-105) 165 ± 11,0 (-105)
10 384 246 ± 18 757 335 106 ± 16 380 7,5 161 ± 6,8 (-105) 147 ± 9,4 (-105)
30 393 311 ± 14 740 204 169 ± 15 436 43,7 167 ± 11,8 (-105) 89 ± 5,1 (-105)
60 405 574 ± 20 124 146 917 ± 13 701 59,5 154 ± 8,7 (-105) 27 ± 5,9 (-105)
Таблица 6
Изменение фагоцитарной активности моноцитов при разных сроках контакта с частицами латекса (п = 6)
Время инку- Процент Фагоцитарное Фагоцитарный
бации, мин фагоцитоза число индекс
10 57,90 ± 1,13 2,32 ± 0,31 0,525 ± 0,071
30 63,96 ± 2,07 2,58 ± 0,14 0,755 ± 0,033
60 82,80 ± 2,65 2,21 ± 0,15 2,73 ± 0,301
ности лейкоцитов, тем выше степень снижения биолюминесценции и меньше количество КОЕ. Степень гашения биолюминесценции E. coli lux+ в присутствии клеток крови является маркером фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов по отношению к живым объектам и позволяет дифференцировать как снижение, так и повышение фагоцитарной активности клеток. Приведенные примеры исследований убедительно подтверждают существенные преимущества данного способа в сравнении с микроскопическим методом: он, как и любой инструментальный метод, отличается более высокой объективностью и меньшей трудоемкостью. Кроме того, используя данный метод, можно отслеживать динамику фагоцитоза. Наиболее важным преимуществом, на наш взгляд, является и то, что оценивается фагоцитоз нативных живых микроорганизмов - это что дает более объективную картину процесса фагоцитоза в макроорганизме. Данный метод можно использовать как в научных, так и в клинико-лабораторных исследованиях. По материалам данного исследования получен патент на изобретение [16].
В заключение хотелось бы отметить, что предлагаемый нами метод имеет большой потенциал для модификаций и адаптации к конкретным задачам, стоящим перед исследователями.
ЛИТЕРАТУРА
1. Каплин В.Н. Нетрадиционная иммунология инфекции. Пермь: Издательство Пермской государственной медицинской академии; 1996.
2. Selvaraj R.J., Sbarra A.J., Thomas G.B., Cetrulo C.L., Mitchell G.W. Jr. A microtechnique for studying chemiluminescence response of phagocytes using whole blood and its application to the evaluation of phagocytes in pregnancy. J. Reticuloendoth. Soc. 1982; 31: 3-16.
3. Martin E., Bhakdi S. Flow cytometric assay for quantifying op-sonophagocytosis and killing of Staphylococcus aureus by peripheral blood leukocytes. J. Clin. Microbiol. 1992; 9: 2246-55.
4. Nielsen S.L., Black F.T., Storgaard M., Obel N. Evaluation of a method for measurement of intracellular killing of Staphylococcus aureus in human neutrophil granulocytes. Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand.. 1995; 6: 460-8.
5. Мазуров Д.В., Дамбаева С.В., Пинегин Б.В. Оценка внутриклеточного киллинга фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитометрии. Иммунология. 2000; 2: 57-9.
6. Олиферук Н.С., Пинегин Б.В. Определение фагоцитарного числа лейкоцитов периферической крови по отношению к Staphylococcus aureus с помощью проточной цитометрии. Иммунология. 2007; 4: 236-40.
7. Verhoef J., Peterson P.K., Quie P.G. Kinetics of staphylococcal opsonization, attachment, ingestion and killing by human polymorphonuclear leukocytes: a quantitative assay using [3H]thy-midine labeled bacteria. J. Immunol. Meth. 1977; 3-4: 303-11.
8. Roda A., Guardigli M. Analytical chemiluminescence and bioluminescence: latest achievements and new horizons. Anal. Bioanal. Chem. 2012; 402(1): 69-76.
9. Дерябин Д.Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты. М.: Наука; 2009.
10. Данилов В.С., Зарубина А.П., Ерошников Г.Е., Соловьев Л.Н., Карташев Ф.В., Завильгельский Г.Б. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий. Вестник МГУ. 2002; 3: 20-4.
11. Дерябин Д.Г., Поляков Е.Г. Влияние сыворотки крови человека на уровень свечения природных и рекомбинантных лю-минесцирующих бактерий. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004; 9: 311-15.
12. Дерябин Д.Г., Поляков Е.Г. Определение бактерицидной активности сыворотки крови с использованием рекомбинант-ных штаммов Escherichia coli. Клиническая лабораторная диагностика. 2005; 2: 53-5.
13. Козинца Г.И., Макарова В.А. ред. Исследование системы крови в клинической практике. М.: Триада-Х; 1997.
14. Ширшев С.В., Некрасова И.В. Комплексное исследование иммуномодулирующей активности эстриола. Иммунология. 2011; 32 (2): 72-4.
15. Некрасова И.В., Ширшев С.В. Эстриол в регуляции функций иммунокомпетентных клеток. Медицинская иммунология. 2009; 11 (4-5): 327-8.
16. Ширшев С.В., Куклина Е.М., Заморина С.А., Никитина Н.М., Некрасова И.В. Способ определения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека по степени гашения биолюминесценции. Патент РФ № 2292553, 2007.
Поступила 27.03.14
REFERENCES
1. Kaplin V.N. Unconventional Iinfection Immunology. [Netradit-sionnaya immunologiya infektsii]. Perm': Izdatel'stvo Permskoy gosudarstvennoy meditsinskoy akademii; 1996. (in Russian)
2. Selvaraj R.J., SbarraA.J., Thomas G.B., Cetrulo C.L., Mitchell G.W. Jr. A microtechnique for studying chemiluminescence response of phagocytes using whole blood and its application to the evaluation of phagocytes in pregnancy. J. Reticuloendoth. Soc. 1982; 31: 3-16.
3. Martin E., Bhakdi S. Flow cytometric assay for quantifying opsonophagocytosis and killing of Staphylococcus aureus by peripheral blood leukocytes. J. Clin. Microbiol. 1992; 9: 2246-55.
4. Nielsen S.L., Black F.T., Storgaard M., Obel N. Evaluation of a method for measurement of intracellular killing of Staphylococcus aureus in human neutrophil granulocytes. Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. 1995; 6: 460-8.
5. Mazurov D.V., Dambaeva S.V., Pinegin B.V. Flow cytometry in assessment of intracellular killing of staphylococci by phagocytes from peripheral blood. Immunologiya. 2000; 2: 57-9. (in Russian)
6. Oliferuk N.S., Pinegin B.V. The phagocytic number definition of peripheral blood leukocytes in the ratio Staphylococcus aureus with flowing cytofluorimetry. Immunologiya. 2007; 4: 236-40. (in Russian)
7. Verhoef J., Peterson P.K., Quie P.G. Kinetics of staphylococcal opsonization, attachment, ingestion and killing by human polymorphonuclear leukocytes: a quantitative assay using [3H] thymidine labeled bacteria. J. Immunol. Meth. 1977; 3-4: 303-11.
8. Roda A., Guardigli M. Analytical chemiluminescence and bioluminescence: latest achievements and new horizons. Anal. Bioanal. Chem. 2012; 402(1): 69-76.
9. Deryabin D.G. Bacterial bioluminescence: Fundamentaland Applied Aspects [Bakterial'naya biolyuminestsentsiya: fundamental'nye i prikladnye aspekty]. Moscow: Nauka; 2009. (in Russian)
10. Danilov V.S., Zarubina A.P., Eroshnikov G.E., Solov'ev L.N., Kartashev F. V., Zavil'gel'skiy G.B. Sensor bioluminescence systems on the basis of lux-operons of different luminescence bacteria species. VestnikMGU. 2002; 3: 20-4. (in Russian)
11. Deryabin D.G., Polyakov E.G. Effect of human serum on bioluminescence of natural and recombinant luminescent bacteria. Byulleten'. Eksperimental'noy biologii i meditsiny. 2004; 9: 31115. (in Russian)
12. Deryabin D.G., Polyakov E.G. Determination of the bactericidal activity of blood serum by recombinant luminescence strains of escherichia coli. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2005; 2: 53-5. (in Russian)
13. Kozintsa G.I., Makarova V.A., eds. Investigation of Blood System in Clinical Practice. [Issledovanie sistemy krovi v klinicheskoy praktike]. Moscow: Triada-X; 1997. (in Russian)
14. Shirshev S.V., Nekrasova I.V. Comprehensive evaluation of estriol immunomodulating potency. Immunologiya. 2011; 32 (2): 72-4. (in Russian)
15. Nekrasova I.V., Shirshev S.V. Estriol in regulation of immunocompetent cells functions. Meditsinskaya immunologiya. 2009; 11 (4-5): 327-8. (in Russian)
16. Shirshev S.V., Kuklina E.M., Zamorina S.A., Nikitina N.M., Nekrasova I.V. Method for Determining Phagocytic Activity of Human Peripheral Blood Neutrophils from Bioluminescence Extinction Degree Data. Patent RF№ 2292553, 2007. (in Russian)
Received 27.03.14
ИММУНООНКОЛОГИЯ
© коллектив авторов, 2014 удк 615.373.03:616-006.04].012
Афанасьева Д.А., Барышникова М.А., Щербаков А.И., Косоруков В.С., Барышников А.Ю.
разработка модели противоопухолевой липосомальной вакцины
ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН, 115478, г. Москва, Россия
Цель данной работы - создание модели противоопухолевой липосомальной вакцины, содержащей лизат опухолевых клеток крысиной глиомы С6. В процессе работы нами была оптимизирована методика получения клеточного лизата для получения малых однослойных липосом. Липосомы, содержащие лизат клеток линии крысиной глиомы С6, имели размер частиц 185 ± 10 нм, уровень включенного белка при этом составил 60±5%. Методом гель-фильтрационной хроматографии показано, что эффективность лизиса клеток повышалась при дополнении методики «замораживание-оттаивание» ультразвуком с 5-10 до 90-95%. Методом иммуноблот Т-анализа показано, что при ультрацентрифугировании в лизате клеток сохраняются мембранные антигены на том же уровне, что и в лизатах, полученных известными методами.
Ключевые слова: липосомы; лизат; глиома С6; ультразвук; ультрацентрифугирование; гель-фильтрационная хроматография; иммуноблот.
Для цитирования: Иммунология. 2014; 35 (6): 317-321. AfanasievaD.A., BaryshnikovaM.A., ShcherbakovA.I., Kosorukov V.S., BaryshnikovA.Yu. THE DEVELOPMENT OF ANTICANCER LIPOSOMAL VACCINE MODEL FSBI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center» RAMS, Moscow
The aim of this study was to develop model anticancer liposomal vaccine containing a lysate of rat glioma C6. We have optimized the method of cell lysate preparation to get a small single-layer liposomes. The size of liposomes containing a lysate of rat glioma C6 was 185±10 nm, the percent of the included protein was 60±5%. We have confirmed by gel-filtration that the efficacy of cell lysis was increased from 5-10% to 90-95% if we lysed cells using ultrasound technique in addition to freezing- thawing method of cell lysis. We have also shown by Western Blot analysis that ultracentrifugation of cell lysate does not influence the level of membrane antigenes, tested using other approach for cell lysis.
Key words: liposomes; lysate; C6 glioma; ultrasound; ultracentrifugation; gel-filtrational chromatography; immunoblot.
citation: Immunologiya. 2014; 35 (6): 317-321. (in Russian)
введение. В настоящее время активно ведутся поиски новых средств, которые могли бы способствовать мобилизации защитных систем организма на борьбу с онкологическими заболеваниями. Одним из таких средств является вакцинотерапия опухолей, вызывающая и поддерживающая иммунный ответ, который направлен на распознавание и элиминацию опухолевых клеток [ 1-7]. В НИИЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» ведутся разработки противоопухолевых вакцин, некоторые из которых прошли I и II фазы клинических испытаний [8-16]. Новое направление в этих разработках - создание липосомальных противоопухолевых вакцин [17]. Липосомальная лекарственная форма является удобным инструментом для направленной доставки как лекарственных препаратов, так и соединений белковой приро-
Для корреспонденции: Афанасьева Дарья Андреевна, [email protected]
For correspondence: Afanas'eva Dar'ya Andreevna,
ды, в том числе опухолевых антигенов [18, 19]. Липосомы предохраняют свое содержимое от преждевременного разрушения в организме, а при конъюгировании с различными лигандами они могут направленно доставить его в целевые ткани организма. В качестве лигандов, обеспечивающих специфическое накопление липосом в целевых областях, можно использовать антитела (АТ) к маркерным антигенам определенных тканей, создавая иммунолипосомы. С помощью иммунолипосомальной формы вакцины можно улучшить презентацию опухолевых антигенов, содержащихся в лизате опухолевых клеток, клеткам иммунной системы и вызвать противоопухолевый ответ. В модельном эксперименте в качестве источника опухолевых антигенов использовали лизат клеток перевиваемых линий меланомы, полученных в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» [20-22].
Чаще всего лизат клеток используют при создании дендритно-клеточных вакцин. Его получают по стандартной методике «замораживание - оттаивание» [16, 17, 23-29]. Клетки несколько раз замораживают в жидком азоте, затем оттаивают при комнатной температуре или на водяной бане
