CC BY
91
Медицинская Иммунология 2009, Т. 11, № 6, стр. 509-514 © 2009, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТОВ РАЗНЫХ ХЕМОТИПОВ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ ИЗ ESCHERICHIA COLI И SALMONELLA НА СИНТЕЗ TNFa И IL-6 МАКРОФАГОПОДОБНЫМИ КЛЕТКАМИ ТНР-1
Волошина Е.В.1, Зубова С.В.1, Прохоренко С.В.3, Косякова Н.И.2, Прохоренко И.Р.1, 3
1 Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино
2 Отделение аллергологии и иммунологии ПНЦ РАН, г. Пущино
3 Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, Москва
Резюме. Проведено исследование влияния ЛПС, различающихся по структуре липидного или полисахаридного фрагмента, на индукцию цитокинов TNFa и IL-6. Исследование проводилось на линии клеток THP-1, дифференцированных в макрофагоподобные клетки с помощью форбол-миристат-ацетата (РМА). В работе использовали ЛПС S. typhimurium (S-хемотип), S. typhimurium SL1181 (R-хемотип), E. coli O55:B5 (S-хемотип) и E. coli JM103 (R-хемотип). Показано, что уменьшение молярной доли липида А/КДО в S-форме ЛПС из E. coli сопровождается пониженной экспрессией TNFa и IL-6. Наоборот, для S-формы ЛПС из Salmonella снижение молярной доли липида А/КДО значительно усиливало экспрессию TNFa. Для R-хемотипов вклад структуры липида А в биологическую активность ЛПС более значим, чем для S, независимо от вида бактерий.
Ключевые слова: липополисахариды, THP-1 клетки, TNFa, IL-6
Voloshina E.V., Zubova S.V., Prokhorenko S.V., Kosjakova N.I., Prokhorenko I.R.
A COMPARISON OF DIFFERENT LIPOPOLYSACCHARIDE CHEMOTYPES FROM ESCHERICHIA COLI AND SALMONELLA UPON SYNTHESIS OF TNFa AND IL-6 BY MACROPHAGE-LIKE THP-1 CELLS
Abstract. Present study was performed to investigate the influence of polysaccharide fragment or lipid A upon induction of TNFa and IL-6 cytokines. The study was performed with human THP-1 monocytic leukemia cells that were induced to differentiate into macrophage-like cells using PMA treatment. Bacterial lipopolysaccharides from S. typhimurium (S-chemotype form), S. typhimurium SL1181 (R-chemotype, Re-mutant), E. coli O55:B5 (S-chemotype), and E. coli JM103 (R-chemotype, Re-mutant) were used in this study. A decreased molar ratio for lipid A-KDO in S-form of LPS from E. coli is accompanied by diminished TNFa and IL-6 expression. By the contrast, for S-form of LPS from Salmonella, a decrease in lipid A-KDO molar ratio did cause a sufficient enhancement of TNFa expression. A contribution of lipid A structure into biological activity of LPS is more significant for Re-chemotype than for S-chemotype, independently on bacterial species. (Med. Immunol., vol. 11, N 6, pp 509-514)
ЛПС является главным молекулярным маркером, по которому клетки хозяина узнают грам-отрицательные бактерии [1]. Взаимодействие ЛПС с клетками врожденной иммунной системы приводит к образованию и высвобождению
Адрес для переписки:
Волошина Евгения Валерьевна,
ИФПБ РАН
142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 2.
Тел.: (4967) 73-07-44.
Факс: (4967) 33-05-32.
E-mail: [email protected]
509
Волошина Е.В. и др.
Медицинская Иммунология
эндогенных медиаторов, инициирующих воспаление и иммунные ответы, необходимые для антибактериальной защиты [2]. Моноциты и макрофаги являются главными регуляторными и эффекторными клетками врожденного иммунитета. Они экспрессируют специфические рецепторные системы для узнавания ЛПС, которые представлены мембранно-связанной изоформой CD14 и трансмембранным сигнальным рецептором TLR4 с аксессорным белком MD-2 [2]. Согласно современным представлениям, активации TLR4 предшествует перенос ЛПС к мембранно-связанному или растворимому рецептору CD14 с помощью ЛПС-связывающего белка LBP [4, 22]. Предполагается, что в общих чертах этот механизм справедлив для ЛПС-сигнализации. Рецепторная система позволяет распознать малейшие различия в структуре ЛПС и cформировать оптимальный ответ организма [24, 25].
Ранее предполагали, что биологическая активность ЛПС связана с липидом А [3], а саха-ридный фрагмент ЛПС выполняет вспомогательную роль. Недавно показано, что Re-форма ЛПС и липид А, в отличие от S-формы, способна индуцировать синтез TNFa в отсутствие CD14 [5]. Однако в состав молекулы эндотоксина помимо липида А входят кор, а также полисахарид. Вклад каждой из этих структур в биологическую активность эндотоксинов исследован очень мало (Shiba et al.) [14] показали, что S-форма ЛПС из Salmonella abortus equi индуцирует синтез TNFa в мышиных макрофагоподобных клетках J774.1 по механизму, отличному от механизма, индуцированного ЛПС R-формы из этой же бактерии. Позднее были получены прямые доказательства участия О-антигенной полисахаридной части ЛПС в индукции синтеза IL-6 на дифференцированных с помощью 1,25-дигидроксивита-мина D3 клетках моноцитарной линии ТНР-1 [15]. Эти клетки продуцировали высокий уровень IL-6 в ответ на ЛПС из E. coli O111:B4 (S-форма), но не отвечали на стимуляцию соединением 506 (синтетический аналог липида А, не содержащий 2-кето-3-дезокси^-манно-октулозоновую кислоту (КДО)) или на ЛПС из Re-мутанта E. coli. Более того, соединение 406 (синтетический предшественник липида А) и антитела к CD14 ингибировали продукцию IL-6 в ответ на эндотоксин. Полученные авторами результаты указывают на то, что полисахаридная часть ЛПС вносит свой вклад или действует как кофактор в активации дифференцированных ТНР-1 клеток.
В связи с изложенным целью настоящей работы было изучить влияние как состава липида А, так и роль полисахаридного фрагмента в активации клеток THP-1, дифференцированных в макрофаго-подобные клетки с помощью РМА [13].
Материалы и методы
В экспериментах с культурой клеток были использованы: коммерческие препараты ЛПС из Salmonella typhimurium (S-хемотип), Salmonella typhimurium SL 1181 (R-хемотип, Re-мутант), ЛПС Escherichia coli 055:B5 (S-хемотип); ЛПС из E. coli К12 штамм JM103 (R-хемотип, Re-мутант) (Sigma). Для определения IL-6, TNFa использованы коммерческие наборы (Diaclone, USA).
Клетки суспензионной промоноцитарной линии THP-1 (коллекция клеточных культур Института цитологии РАН, г. Санкт-Петербург) культивировали в среде RPMI 1640 (Институт полиомиелита им. М.П. Чумакова), содержащей 10% фетальной сыворотки телят (HyClone, USA), 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 40 мкг/мл гентамицина, 2 ммоль/л L-глутамина, 2 х 10-5 М 2-меркаптоэтанола (Merck) в культуральных флаконах (Costar, USA) при 37 °С в присутствии 5% СО2 в СО2-камере «Joan» (Франция).
Жизнеспособность THP-1 клеток определяли окраской трипановым синим по стандартной методике.
Дифференциация и активация THP-1 клеток
Дифференциацию клеток (2 х 105 кл/мл) проводили в 24-х луночных планшетах (Costar, USA), добавляя 10-8М PMA (phorbol-12-myristate-13-acetate, Sigma) по [13]. Клетки культивировали в среде инкубации при 37 °С в присутствии 5% СО2 в течение 48 часов. Дифференцировалось около 80% клеток. Жизнеспособность дифференцированных клеток составляла не менее 90%. Прикрепившиеся клетки однократно промывали свежей средой и инкубировали 24 часа в среде для культивирования, содержащей 50 нг/мл различных ЛПС. После инкубации супернатант отбирали и хранили при -70 °С до процедуры определения содержания цитокинов.
Определение содержания цитокинов TNFa и IL-6 в пробах
Концентрацию цитокинов TNFa и IL-6 определяли с использованием коммерческих наборов (Diaclone, USA) согласно методике, предложенной производителем. Оптическую плотность образцов определяли при длине волны 450 нм
510
2009, Т. 11, № 6
Эффекты эндотоксинов на синтез цитокинов
на планшетном спектрофотометре «STAT FAX 3200» (USA).
Хемотип используемых ЛПС подтвердили методом электрофореза по [6]. Окрашивание геля проводили аммиакатом серебра по [21].
Результаты
Морфология и адгезивность недифференцированных и дифференцированных клеток THP-1
Исходные клетки THP-1 имеют округлую форму с диаметром 12-14 мкм и образуют в суспензии гроздья. В недифференцированной культуре почти нет клеток, прикрепленных к поверхности культурального флакона.
После дифференциации с помощью РМА клетки изменяли размер и форму, превращаясь в макрофагоподобные клетки. В культуре наблюдается высокий процент (около 80%) адгезиро-ванных к поверхности пластика клеток.
Агонистическая активность эндотоксинов
Представленная на рисунке 1 электрофоре-грамма демонстрирует различия в структурах используемых в работе ЛПС. В высокомолекулярной области геля от 15 кДа и выше расположены зоны, указывающие на присутствие полисахаридных фрагментов для S-структур ЛПС. Зоны, ответственные за липид А/КДО и липид А, локализованы в низкомолекулярной области геля и характерны для Re-структур.
Агонистическую активность ЛПС в отношении недифференцированных и дифференцированных клеток THP-1 определяли по экспрессии цитокинов TNFa и IL-6 в среду после инкубации клеток с ЛПС различной структуры. Чтобы исключить собственный вклад РМА в экспрессию цитокинов [18], клетки перед добавлением ЛПС тщательно отмывали культуральной средой. На недифференцированных клетках THP-1 все исследованные типы ЛПС не вызывали индукции TNFa. Индукция IL-6 наблюдалась в следовых количествах.
Экспериментальные данные по индукции TNFa и IL-6 РМА-дифференцированными клетками THP-1 представлены на гистограммах (рис. 2, 3). Из полученных результатов видно, что все типы ЛПС индуцировали синтез TNFa и IL-6.
Наибольшей активностью в индукции TNFa из всех исследованных ЛПС обладала S-структура ЛПС Salmonella. Активность Re-структуры ЛПС Salmonella оказалась ниже по сравнению с S-структурой ЛПС Salmonella в 1,5 раза. Активность ЛПС E. coli в индукции TNFa, как и в случае с индукцией IL-6, была ниже по сравнению с ЛПС Salmonella (рис. 2).
На индукцию IL-6 наиболее заметное влияние также оказывали ЛПС Salmonella, причем их активность не зависила от хемотипа (рис. 3). Влияние ЛПС E. coli различалось по хемотипам. Re-тип ЛПС E. coli имел большую агонистическую активность, чем S-тип ЛПС.
E. coli JM 103
S. typhimurium E. coli O55:B5 о о о о
kDA
170 -130 -95 — 72 —
55 -43 —
34
26 -
17
11
15 мгк 3 мгк 3 мгк 15 мгк
Рисунок 1. Электрофореграмма ЛПС из разных хемотипов Е. coli и S, typhimurium
Рисунок 2. Действие ЛПС различной структуры на высвобождение TNFa, дифференцированными с помощью РМА THP-1 клетками
Примечание. Приведены средние значения эффектов и средняя квадратичная ошибка по результатам трех независимых экспериментов в двух повторностях.
511
Волошина Е.В. и др.
Медицинская Иммунология
5.0 4,5
4.0
3,5
«? 3,0 12.5
I
8-2,0
СП
о
о 1,5
1,0
0,5
0,0
Рисунок 3. Действие ЛПС различной структуры на высвобождение IL-6, дифференцированными с помощью РМА THP-1 клетками
Примечание. Приведены средние значения эффектов и средняя квадратичная ошибка по результатам трех независимых экспериментов в двух повторностях.
Обсуждение
В настоящей работе исследовалось влияние структурных элементов ЛПС из E. coli и S. typhimurium на экспрессию цитокинов макрофагоподобными клетками THP-1. Дифференциация THP-1 клеток посредством РМА увеличивает их чувствительность к ЛПС, что показано по продукции TNFa этими клетками [25]. Это связано с многократным увеличением экспрессии TLR4 на поверхности дифференцированных клеток [23]. Ранее было обнаружено, что экспозиция THP-1 клеток к РМА сопровождается накоплением транскрипционного фактора NF-kB в цитоплазме и его транслокацией в ядро [18]. Также известно, что многие гены, кодирующие цитокины, и в том числе TNFa, включают сайты связывания NF-kB в свои промоторные области [17]. В другой работе на моноцитах человека показано, что адгезия клеток сама по себе не индуцирует продукцию заметного количества TNFa, однако праймирует их к продукции цитокинов в ответ на стимул, в том числе на ЛПС [12]. Таким образом, хотя дифференцированные THP-1 клетки являются удобной моделью для исследований из-за наличия на них рецепторов к ЛПС, эти клетки были подвержены двум прай-мирующим факторам — дифференцирующему агенту РМА и адгезии к поверхности плашек.
ЛПС из E. coli [11] и из Salmonella [20] активируют клетки через TLR4. Активация эндотоксинами TLR4 сопровождается передачей сигнала по MyD88-зависимому пути и приводит к быстрой активации ядерного фактора NF-kB
и высвобождению таких провоспалительных цитокинов, как TNFa, IL-1 в, IL-6 и других [7]. Интенсивность ответа зависит от состава ЛПС. Общепринято, что биологическая активность ЛПС связана с составом и структурой липида А. Липиды А, входящие в состав ЛПС из E. coli и из Salmonella typhimurim, имеют асимметричное распределение жирных кислот, являются бифосфо-рилированными, но, что принципиально, различаются по количеству жирных кислот [9, 10]. В состав липида А из E. coli входит 6 жирных кислот (максимальная эндотоксическая активность), а в состав липида А из Salmonella typhimurim — 7 жирных кислот (минимальная эндотоксическая активность). Ранее было показано, что липид А из разных штаммов Salmonella, в отличие от липида А из E. coli, практически не активирует дифференцированные THP-1 клетки к синтезу TNFa [19]. Нами показано, что R-ЛПС из обоих видов бактерий, в состав которых помимо липида А входят два остатка КДО, практически одинаково стимулировали клетки к синтезу TNFa (рис. 2, 3). Таким образом, молекулы КДО выполняют не только структурную функцию, соединяя кор с липидом А, но также являются важными компонентами биологической активности ЛПС. ЛПС из всех хемотипов E. coli включают в свой состав липид А/КДО-структуру, оптимальную для проявления эндотоксической активности. На то, что именно эта структура существенна для активности ЛПС из E. coli, указывает тот факт, что снижение удельного вклада липида А/КДО в ЛПС снижает экспрессию TNFa и IL-6 при активации клеток S-ЛПС в сравнение с R-ЛПС (рис. 2, 3).
Наоборот, для S-формы ЛПС из Salmonella снижение молярной доли липида А/КДО значительно усиливало экспрессию TNFa. Эти результаты могут быть объяснены ролью полисахаридного фрагмента ЛПС в активации NF-kB, показанной в работе [8]. Авторы с использованием метода определения активности NF-KB-за-висимой репортерной люциферазы показали, что при активации дифференцированных ТНР-1 клеток липид А и S-ЛПС из E. coli одинаково сильно увеличивали люциферазную активность. Липид А из Salmonella даже в концентрации 1 мг/мл не влиял на активность люциферазы, тогда как S-форма ЛПС из Salmonella была еще более активна, чем из E. coli. Полученные в нашей работе результаты хорошо согласуются с данными по влиянию разных хемотипов ЛПС из Salmonella на внутриклеточный уровень NF-kB [8] и позволяют заключить, что полисахаридный фрагмент модулирует биологическую активность липида А из Salmonella.
512
2009, Т. 11, № 6
Эффекты эндотоксинов на синтез цитокинов
Список литературы
1. Alexander C., Rietschel E.T Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity // J. Endotoxin Res. — 2001. — Vol. 7. — P 167-202.
2. Beutler B., Hoebe K., Du X., Ulevitch R.J. How we detect microbes and respond to them: the Toll-like receptors and their transducers // J. Leukoc. Biol. - 2003. - Vol. 74. - P. 479-485.
3. Galanos C., Luderitz O., Rietschel E.T. In Lipopolysaccharide: properties of an amphipathic molecule // Ed., Elsevier, Amsterdam. — 1984. — Vol. 1. - P. 46.
4. Hamann L., Alexander C., Stamme C., Zahringer U., Schumann R.R. Acute-phase concentrations of lipopolysaccharide (LPS)-binding protein inhibit innate immune cell activation by different LPS chemotypes via different mechanisms // Infection and Immunity. - 2005. -Vol. 73, N 1. - P 193-200.
5. Jiang Z., Georgel P, Du X., Shamel L., Sovath S., Mudd S., Huber M., Kalis C., Keck S., Galanos C., Freudenberg M., Beutler B. CD14 is required for MyD88-independent LPS signaling // Nat. Immunol. - 2005. - ЛЫ. 6, N 6. -P. 565-570.
6. Krauss J.H., Seydel U., Weckesser J., Mayer H. Structural analisis of the nontoxic lipid A of Rhodobacter capsulatus 37b4. // Eur. J. Biochem. -1989. - Vol. 180. - P 519-526.
7. Miyake K. Endotoxin recognition molecules, Toll-like receptor 4-MD-2. // Seminars in Immunology. - 2004.- Vol. 16, N 1. - P 11-16.
8. Muroi M., Tanamoto K. The polysaccharide portion plays an indispensable role in Salmonella lipopolysaccharide-induced activation of NF-{kappa} B through human Toll-like receptor 4 // Infect. Immun. - 2002. -Vol. 70, N 11. - P 6043-6047.
9. Oshiumi H., Matsumoto M., Funami K., Akazawa T., Seya T. TICAM-1, an adaptor molecule that participates in Toll-like receptor 3-mediated interferon-beta induction // Nat. Immunol. - 2003. -Vol. 4. - P 161-167.
10. Oshiumi H., Sasai M., Shida K., Fujita T, Matsumoto M., Seya T. TIR-containing adapter molecule (TICAM)-2, a bridging adapter recruiting to toll-like receptor 4 TICAM-1 that induces interferon-beta // J. Biol. Chem. - 2003. - ЛЫ. 278. -P 49751-49762.
11. Poltorak A., Ricciardi-Castagnoli P, Citterio S., Beutler B. Physical contact between lipopolysaccharide and Toll-like receptor 4 revealed by genetic complementation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000. - Vol. 97. - P 2163-2167.
12. Rosengart M. R., Arbabi S., Bauer G.J., Garcia I., Jelacic S., Maier R.V. The actin cytoskeleton: an essential component for enhanced TNF alpha production by adherent monocytes // Shock. - 2002. - Vol. 17, N 2. - P 109-113.
13. Schwende H., Fitzke E., Ambs P, Dieter P Differences in the state of differentiation of THP-1 cells induced by phorbol ester and
I, 25-dihydroxyvitamin D3 // J. Leukoc. Biol. -1996. - Vol. 59, N 4. - P 555-561.
14. Shiba T, Kusumoto S., Inage M., Chaki H., Shimamoto T. Recent developments in the organic synthesis of lipid A in relation to biologic activities // Res. Infect. Dis. - 1984. - Vol. 6. - P 478-482.
15. Suda Y., Aoyama K., Arimoto K., Tamura T., Shoichi Kusumoto S. S-form lipopolysaccharide (LPS), but not lipid A or R-chemo-type LPS, induces interleukin-6 production in vitamin D3-differentiated THP-1 cells // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 1999. - Vol. 257, N 2. -P. 327-332.
16. Suda Y., Aoyama K., Arimoto K., Tamura T., Shoichi Kusumoto S. S-form lipopolysaccharide (LPS), but not lipid A or R-chemo-type LPS, induces interleukin-6 production in vitamin D3-differentiated THP-1 cells // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 1999. -Vol. 257, N 2. -P. 327-332.
17. Takashiba S., Shapira L., Amar S., Van Dyke T.E. Cloning and characterization of human TNF alpha promoter region // Gene. - 1993. -Vol. 131. - P 307-308.
18. Takashiba S., Van Dyke T.E., Amar S., Mu-rayama Y., Soskolne A.W., Shapira L. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor B // Infect. Immun. -1999. - Vol. 67, N 11. - P 5573-5578.
19. Tanamoto K.-i., Azumi S. Salmonella-type heptaacylated lipid A is inactive and acts as an antagonist of lipopolysaccharide action on human line cells. // J. Immunol. - 2000. - Vol. 164. -P. 3149-3156.
20. Tapping R.I., Akashi S., Miyake K., Godowski PJ., Tobias PS. Toll-like receptor 4, but not Toll-like receptor 2, is a signaling receptor for Escherichia and Salmonella lipopolysaccharides //
J. Immunol. - 2000. - Vol. 165. - P 5780-5787.
21. Tsai C.M. and Frasch C.E. A sensitive silver stain for detecting liupopolysaccharides in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. - 1982. -Vol. 119. - P 115-119.
22. Wright S.D., Ramos R.A., Tobias PS., Ulevitch R.J., Mathison J.C. CD14, a receptor for
513
Волошина Е.В. и др.
Медицинская Иммунология
complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein // Science. — 1990. — Vol. 249. — P. 1431-1432.
23. Zarember K.A., Godowski PJ. Tissue expression of human Toll-like receptors and differential regulation of Toll-like receptor mRNAs in leucocytes in response to microbes, their producs, and cytokines // J. Immunol. — 2002. — Vol. 168. — P. 554-561.
24. Zughaier S.M., Tzeng Y.L., Zimmer S.M., Datta A., Carlson R.W., Stephens D.S. Neisseria meningitidis lipooligosaccharide structure-dependent activation of the macrophage CD14/Toll-like
receptor 4 pathway // Infection and Immunity. — 2004. - Vol. 72, N 1. - P. 371-380.
25. Zughaier S.M., Zimmer S.M., Datta A., Carlson R.W., Stephens D.S. Differential induction of the Toll-like receptor 4-MyD88-dependent and -independent signaling pathways by endotoxins // Infect. Immun. - 2005. - Vol. 73, N 5. -P. 2940-2950.
поступила в редакцию 16.06.2009 отправлена на доработку 19.06.2009 принята к печати 25.06.2009
514
