Специфические циркулирующие иммунные комплексы у больных хронической HCV-инфекцией Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

по материалам диссертационных работ

УДК 616.36-002-036.12-07

н.н. софронова3, а.п. цибулькин1, и.м. хаертынова1, с.я. зверев3, р.б. гальбрайх2

1Казанская государственная медицинская академия, 410012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 36 2Гепатологический центр Пермской краевой клинической инфекционной больницы, 614990, г. Пермь, ул. Пушкина, д. 6

3Пермский краевой центр СПИД и ИЗ, 614088, г. Пермь, ул. Свиязева, д. 21

Специфические циркулирующие иммунные комплексы у больных хронической HCV-инфекцией

Софронова Наталья Николаевна — врач-инфекционист, тел. (342) 227-58-62, e-mail: [email protected]

Цибулькин Анатолий Павлович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики,

тел. +7-917-269-65-76, e-mail: [email protected]

Хаертынова ильсияр Мансуровна — доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой инфекционных болезней, тел. +7-987-262-96-62, e-mail: [email protected]

Зверев Сергей яковлевич — заведующий диагностической лабораторией, тел. (324) 223-61-36, e-mail: [email protected] Гальбрайх Рамиса Борисовна — кандидит медицинских наук, заведующая гепатологическим центром, тел. (342) 236-46-09, e-mail: [email protected]

В работе использован метод определения циркулирующих иммунных комплексов для антигенов HCV (core, NS3, NS4, NS5) у больных хроническим гепатитом С (ХГС) в процессе проведения противовирусной терапии. Полученные результаты указали на достаточную иммуногенность всего спектра изучаемых HCV-антигенов до начала противовирусной терапии. После эффективной противовирусной терапии с длительным подавлением репликации вируса происходило снижение уровня анти-Сore IgG в составе ЦИК, но не полноценное исчезновение самой Сore-антигенемии. Происходило 3-кратное снижение уровня анти-NS5 IgG в составе ЦИК, что полностью соответствовало подавлению репликации вируса. Доказано, что образование ЦИК при HCV-инфекции несет признаки специфичности, подтверждением чего являются выраженные различия в частоте их встречаемости на антитела HCV, наиболее часто проявляющиеся в группе больных с успешной терапией.

Ключевые слова: циркулирующие иммунные комплексы, хронический гепатит С, спектр антител.

N.N. sOFRONOVA3, A.P. TsiBUL'KIN1,1.M. KHAERTYNOVA1, s.Ya. ZVEREV3, R.B. GALBRAYH2

1Kazan State Medical Academy, 36 Butlerov St., Kazan, Russian Federation, 420012

2Hepatology Centre of the Perm Regional Clinical Infectious Diseases Hospital, 6 Pushkin St., Perm,

Russian Federation, 614990

3Perm Regional Center of AIDS and ID, 21 Svazieva St., Perm, Russian Federation, 614088

Specific circulating immune complexes in patients with chronic HCV-infection

sofronova N.N. — infectious disease physician, tel. (342) 227-58-62, e-mail: [email protected]

tsibul'kin A.P. — D. Med. Sc., Professor, Head of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics, tel. +7-917-269-65-76,

e-mail: [email protected]

Khaertynova i.M. — D. Med. Sc., Professor, Head of the Department of Infectious Diseases, tel. +7-987-262-96-62, e-mail: [email protected]

Zverev s.Ya. — Head of Diagnostic Laboratory, tel. (324) 223-61-36, e-mail: [email protected] Galbrayh R.B. — Cand. Med. Sc., Head of Hepatology Centre, tel. (342) 236-46-09, e-mail: [email protected]

We used the method of detecting the circulating immune complexes (CIC) for antigen HCV (core, NS3, NS4, NS5) in patients with chronic hepatitis C in the course of antiviral therapy. The obtained results showed a sufficient immunogenicity of the entire spectrum of the studied HCV antigens prior to antiviral therapy. After the effective antiviral therapy with prolonged suppression of viral replication, the reduction Core anti-IgG in the composition of the CIC occurred, but not a complete disappearance of the Core-antigenemia. There was a 3-fold reduction in the level of anti-NS5 IgG in the composition of the CIC, which is fully consistent with the suppression of viral replication. It is proved that the formation of the CIC in the HCV-infection bears signs of specificity, which is confirmed by marked differences in the frequency of their occurrence in the HCV antibodies, manifested most frequently in patients with successful therapy.

Key words: circulating immune complexes (CIC), chronic hepatitis C virus (HCV), spectrum of antibodies.

Иммунные комплексы участвуют в патогенезе многих заболеваний — инфекционных, ревматических, онкологических и большой группы смешанных заболеваний [1]. Клиническая необходимость привела к разработке многочисленных подходов их измерения. Все предложенные методы разделились на две группы. Биологические методы, которые основывались на способности комплексов антиген/антитело взаимодействовать с гуморальными и клеточными рецепторными системами. Наибольшей популярностью пользовались методы с идентификацией рецепторов для С^и С3 (С3Ь, С3Ы) и Fc рецепторов. Однако указанные методы оказались технологически сложными и, что особенно важно, недостаточно воспроизводимыми.

Метод преципитации циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) с использованием полиэтилен-гликоля (ПЭГ) позволяет проводить количественные измерения иммуноглобулинов, находящихся в составе полученного преципитата. Метод ПЭГ преципитации широко используется до настоящего времени, особенно в отечественных иммунологических лабораториях. При этом часто не учитывается факт пересмотра подхода к оценке диагностической значимости прямого ПЭГ-теста. Оказалось, что ПЭГ метод имеет незначительную диагностическую ценность, у него очень низкая специфичность и чувствительность. После выяснения причин низкой чувствительности и специфичности ПЭГ метода в прямом (одношаговом) варианте он не был рекомендован к использованию не только в научных исследованиях, но и для клинических лабораторных анализов, а полученные на основе него результаты рекомендовались к пересмотру. Однако сама возможность получения преципитата с помощью ПЭГ не была исключена из лабораторных исследований. Оказалось, что ПЭГ преципитат является исходным материалом для дальнейшего исследования качественных и количественных характеристик иммунного комплекса, что особенно важно в случаях изучения специфических ЦИК при инфекционных заболеваниях.

Современные подходы к исследованиям ЦИК связаны с использованием более специфичных методов с анализом именно особенностей и специфичности прежде всего антигенов, формирующих комплексы при различных заболеваниях из групп ЦИК-ассоциированных [2, 3].

Цель исследования — апробация модифицированного метода полуколичественной характеристики специфичных для антигенов HCV циркулирующих иммунных комплексов, проведенная на больных хроническим гепатитом С (ХГС) в динамике противовирусной терапии (ПВТ) с использованием альфа-интерферонов.

Материал и методы исследования

Исследования проводились в диагностической лаборатории ГКУЗ «ПКЦ СПИД и ИЗ». Диагноз ХГС

подтверждали определением в сыворотке крови суммарных анти-HCVметодом иммуноферментно-го анализа (ИФА) с использованием тест-системы «ДС-ИФА-Анти-HCV» (НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород). Качественное и количественное определение РНК HCV в крови и ге-нотипирование вируса проводили методом ПЦР с использованием набора «ГЕНОТИП С» (ЗАО НПФ «ДНК Технология», г. Москва) и «Гепатоген С количественный» (ЗАО НПФ «ДНК Технология», г. Москва).

Определение анти-HCV класса IgG к структурным и неструктурным белкам HCV в сыворотке крови и в составе ЦИК на фоне ПВТ у больных ХГС проводили методом ИФА на тест-системах «ИФА-АНТИ-ВГС-СПЕКТР-G» производства НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород. Для статистической обработки полученных результатов использовали величину «индекса позитивности» (ИП), которая выражалась отношением оптической плотности исследуемого образца сыворотки или ЦИК к величине критической оптической плотности (cut-off) в каждом отдельном исследовании.

Для получения ЦИК из сыворотки крови за основу был взят метод преципитации 7%-ным раствором полиэтиленгликоля в 0,1М боратном буфере с рН 8,8 [8] по методике Digeon и др. [7]. Для этого к 0,1 мл исследуемой сыворотки добавляли 4,9 мл охлажденного раствора ПЭГ и смесь инкубировали при температуре 4oC в течение 16-18 часов, затем центрифугировали при 5000 оборотов/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливали, а ПЭГ-преципитат растворяли в 0,3 мл Na-фосфатного буфера pH 7,4 в течение одного часа при комнатной температуре. Диссоциацию комплексов антиген-антитело проводили нагреванием образцов на водяной бане при температуре + 58oC в течение 10 минут. Серологический мониторинг проводили на этапах: до лечения, на 24-й неделе лечения, по окончании ПВТ и каждые 24 недели после ПВТ в течение двух лет.

Полученные результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что у всех больных ХГС до начала ПВТ в сыворотке были зафиксированы анти-HCV IgG по всем испытуемым структурным (core) и неструктурным (NS3, NS4, NS5) антигенам. Проводимая ПВТ не сказалась заметно на частоте идентифицируемого гуморального иммунного ответа по большинству изучаемых антигенов HCV. Исчезновение фиксируемого уровня анти-HCV IgG NS5 обнаружено только у 20% больных с эффективной противовирусной терапией (УВО+), в то время как у больных ХГС с неэффективной ПВТ (УВО-) анти-HCV IgG к NS5 антигену фиксировались у 100% больных. Последнее логично проистекает из того, что в случае достижения УВО при проводимой ПВТ происходит снижение уровня циркулирующих вирусных антигенов. При изучении характера ЦИК всегда целесообразно проводить сравнение с уровнем специфического гуморального ответа.

ПЕЛИАТРИЯ I

Таблица 1.

Частота выявления анти^ОД IgG в сыворотке крови и в составе ЦИК у больных ХГС до и после противовирусной терапии (в %)

Спектр IgG антител Подгруппы

До противовирусной терапии n=25 После противовирусной терапии

Всего n=25 УВО+ n = 19 УВО-n = 6

Core сыворотка 100,0 100,0 100,0 100,0

ЦИК 92,0 89,5 100,0

NS3 сыворотка 100,0 100,0 100,0 100,0

ЦИК 88,0 84,2 100,0

NS4 сыворотка 100,0 100,0 100,0 100,0

ЦИК 84,0 80,0 73,7 100,0

NS5 сыворотка 100,0 84,0 78,9 100,0

ЦИК 88,0 48,0 36,8 83,3

Наши исследования поддержали ту часть исследований, авторы которых свидетельствуют о достаточной антигенной HCV вирусной нагрузке для развития достаточного для фиксации уровня гуморального иммунного ответа ко всему спектру вирусных антигенов. Идентификация положительных результатов на наличие в циркуляции специфических ЦИК подтвердила высокую частоту их формирования у больных с ХГС. При этом до начала ПВТ ЦИК включающие анти-HCV core IgG обнаруживались у 100% обследуемых с данной патологией. Частота положительного ответа на неструктурные антигены была также высокой и во всех случаях (NS3, NS4, NS5) превышала 80%. Проведение ПВТ практически не повлияла на частоту возможной идентификации ЦИК, содержащих анти-HCV (core, NS3 и NS4) IgG.

При сравнении полученных результатов в группах с разной эффективностью ПВТ наибольший уровень снижения частоты положительных реакций достигал при идентификации анти-HCV (NS4 и NS5) IgG в составе ЦИК. Четкое снижение частоты до 73,7% обнаружено в случаях ЦИК, содержащих анти-HCV (NS4) IgG. Частота же встречаемости специфических ЦИК к неструктурному антигену NS5 упала чрезвычайно низко, и составила 36,8% при 88% до начала терапии. Малоэффективная терапия характеризовалась отсутствием серьезных изменений частоты положительных ответов.

Сравнение результатов определения частоты встречаемости спектра анти-HCV IgG в свободном состоянии в сыворотке крови и в составе ЦИК как в исходном состоянии, так и после проведенной ПВТ свидетельствуют о том, что быстрое снижение в случае эффективной терапии формирования специфических ЦИК к NS4 и NS5 неструктурным антигенам HCV связана с дефицитом последних в крови на фоне отсутствия виремии HCV как основного показателя достижения УВО.

Сделанные предположения требовали, несомненно, количественных подтверждений. В связи с чем мы проанализировали динамику количественных изменений спектра анти-HCV IgG у пациентов с ХГС на разных этапах противовирусной терапии. Результаты исследований представлены на рис. 1-4. Поскольку выраженность иммунных ответов на различные антигены HCV оказались не однотипны,

особенно в сопоставлении с уровнем ЦИК целесообразно было рассмотреть их характеристики по отдельности с каждым из изучаемых антигенов HCV.

Наиболее устойчивую картинку иммунных ответов в динамике ПВТ мы наблюдаем в случае структурного антигена HCV-сore. До начала терапии у всей группы больных наблюдался выраженный гуморальный ответ, с максимальными показателями сывороточных анти-гаге IgG на уровне ИП = 14. Важно, что исходный их уровень не отличался достоверно между больными ХГС в подгруппах с последующими вариантами эффективности УВО (УВО(+) или УВО(-). В подгруппе с УВО(+) на фоне терапии в период достижения авиремии сохранялся, при кратковременном снижении, устойчивый гуморальный иммунный ответ, сохраняющийся без снижения длительный период (24-49 недель наблюдения после завершения ПВТ).

В полученных результатах, на первый взгляд, мало новизны, поскольку длительное сохранение анти-core-IgG в сыворотке больных ХГС после ПВТ отмечалось разными авторами [2]. Однако проведенное нами сопоставление с состоянием специфических ЦИК позволило по-новому посмотреть на имеющуюся трактовку результатов. Во-первых, в циркуляции у больных одновременно с анти-гаге IgG присутствовало достаточное количество свободного антигена HCV-core в форме доступной для образования большого количества ЦИК. При дислокации последних мы получали высокие уровни анти-гаге IgG (в среднем на уровне 11 ИП, рис. 1). Сывороточная авиремия на фоне ПВТ сопровождалась падением показателя ИП для ЦИК в среднем до 8,0 с последующим незначительным добавочным падением в среднем до 7,0 в случаях длительного периода наблюдения за больными ХГС после завершения ПВТ с УВО(+). При этом уровни циркулирующих анти-гаге IgG возвращались к исходным значениям. Подобное соотношение показателей анти-гаге IgG в сыворотке и в составе ЦИК свидетельствовали о снижении в циркуляции свободного гаге-антигена в форме, доступной для образования специфических ЦИК, т.е. комплексы образовывались в условиях нарастающего избытка антител. Полученные результаты позволяют по-новому оценить эффект длительного сохранения гуморального ответа гаге-антигена у больных ХГС. Соглашаясь с

Рисунок 1. Уровень анти-HCV IgG к Core антигену в сыворотке крови и в составе ЦИК у больных ХГС в динамике противовирусной терапии в зависимости от достижения УВО (в ИП)

14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

Core Ag ХГС УВО

100%

1 г\г\о м

ч "Ч 100% S

L N. "Ч У S Ц

*

1 1

С

перед ПВТ на фоне ПВТ после ПВТ (24-48 нед) (24-96 нед)

Рисунок 2. Уровень анти^ОД IgG к NS3 антигену в сыворотке крови и в составе ЦИК у больных ХГС в динамике противовирусной терапии в зависимости от достижения УВО (в ИП)

14 13 12 11 10 9 8 7 б 5 4 3 2 1

N83 Ag ХГС" УВО+

100%т

С

V

84,2%

ЦИК

-1-1-

перед ПВТ на фоне ПВТ после ПВТ (24-48 нед) (24-96 нед)

14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

NS3 Ag ХГС УВО-

100%

100% ЦИК

С

-1-1-

перед ПВТ на фоне ПВТ после ПВТ (24-48 нед) (24-96 нед)

ртггттп

Рисунок 3. Уровень анти-HCV IgG к NS4 антигену в сыворотке крови и в составе ЦИК у больных ХГС в динамике противовирусной терапии в зависимости от достижения УВО (в ИП)

14 13 12 11 10 9

NS4 Ag ХГС УВО

100%

С

100%

ЦИК

перед ПВТ на фоне ПВТ после ПВТ (24-48 нед) (24-96 нед)

наличием у данного антигена высокой иммуноген-ности [4, 8], что регистрируется на стадии до начала терапии, следует отметить, что длительное сохранение иммунного ответа во многом связано с длительным сохранением антигенов core (HCV) в иммуногенной форме.

В подгруппе с неэффективной ПВТ (УВО-) уровни циркулирующих анти-core IgG в сыворотке достоверно не изменялись на протяжении всего периода наблюдения, а уровень анти-core IgG в составе ЦИК, характеризующей в основном наличие доступного антигена, свидетельствовал о кратковременном его снижении в период проводимой терапии с последующим возвратом к исходным цифрам. Подобный характер ответа отражает наличие в этой подгруппе больных с рецидивными формами заболевания.

Неструктурные NS3, NS4, NS5 антигены, представляя различные группы ферментов, были достаточно иммуногены и вызывали развитие выраженного гуморального ответа с образованием анти-HCV (спектра) IgG. Средние показатели у больных ХГС до начала терапии колебались на уровне 13-14 ИП. Динамика же изменений показателей в процессе ПВТ имела существенные отличия от таковых в ответ на структурный HCV-core-антиген. Эффективная терапия с достижением УВО сопровождалась постепенным незначительным снижением показателя ИП анти-NS3 IgG в свободном состоянии в сыворотке. Одновременно ИП анти-NS3 IgG в составе ЦИК резко падал до средних показателей в 6,0 на фоне авиремии в период терапии и продолжил снижение в период наблюдения после завершения ПВТ (до низких средних показателей ИП в пределах 3,0).

Отсутствие параллелизма в характере изменения уровней анти-ыБз IgG в сыворотке и в составе ЦИК в динамике ПВТ свидетельствует в пользу специфичности формирования изучаемых ЦИК и образования последних в условиях сохранения уровня циркулирующих анти-ЫБ3 IgG на фоне снижения уровня самого ЫБ3 антигена, доступного для связывания с антителами в иммунные комплексы (т.е. на фоне избытка специфических антител). Высокие проценты сохранения положительных результатов выявления ЦИК свыше 80% от следуемых на фоне длительной авиремии позволяют свидетельствовать в пользу возможного частичного ускользания (анти-ЫБ3 IgG — ЫБ3 антиген) ЦИК малых размеров (образующихся в избытке антител) от преципитации от 7% раствором полиэтиленгликоля. Хотя с точки зрения поставленных нами задач это не столь принципиально. Источник длительного сохранения в циркуляции неструктурного ЫБ3 антигена не выявлен.

Неэффективная ПВТ с кратковременным периодом снижения уровня образования специфических ЦИК быстро вновь, на фоне интенсивной репликации вируса Н^ и сопутствующего увеличения свободного антигена, доступного для образования ЦИК, увеличивало детектируемые уровни последних. А положительные реакции в случаях идентификации анти-ЫБ3 IgG как в свободном состоянии, так и в составе ЦИК, как и следовало ожидать, составляли 100% выраженности иммунного ответа.

Изменение уровней ИП анти-ЫБ3 IgG в свободной циркуляции и в составе ЦИК в динамике ПВТ в зависимости от степени достижения УВО представлено на рис. 3. Графики, имея некоторые отличия

Рисунок 4. Уровень анти-HCV IgG к NS5 антигену в сыворотке крови и в составе ЦИК у больных ХГС в динамике противовирусной терапии в зависимости от достижения УВО (в ИП)

14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

N85 Ag ХГС УВО+

78,9%

С

\ т

36,8%

ч

ЦИК

-1-1-

перед ПВТ на фоне ПВТ после ПВТ (24-48 нед) (24-96 нед)

14 13 12 11 10 9 8 7 б 5 4 3 2 1

N85 Ag ХГС УВО-

100%

С

83,3%

ЦИК

-1-1-

перед ПВТ на фоне ПВТ после ПВТ (24-48 нед) (24-96 нед)

для антигенов NS3 и NS4, по основным, принципиальным, характеристикам оказались однотипными. Подгруппы больных с УВО(+) на фоне длительной авиремии продолжали формировать специфические ЦИК на фоне видимого дефицита специфического антигена, необходимого для образования ЦИК, остающегося достаточным для поддержания гуморального иммунного ответа в виде 100% высокого уровня ИП анти-NS3 IgG в свободном виде в сыворотке. Характер ответов в случае УВо (-) результатов был принципиально одинаков как в случае NS3-, так и NS4-антигенов.

Характеристика изменений иммунного ответа и уровня образования специфических ЦИК в случае NS5 антигена имело свои количественные особенности (рис. 4). На фоне эффективной ПВТ с достижением УВО происходило выраженное подавление уровня образования NS5 IgG как по выраженности (средний ИП падал с 13 до 8,0), так и по частоте (уменьшение частоты положительных ответов ниже 80%). Основой такого ответа могло быть почти полное исчезновение NS5 антигена из состава ЦИК (уровень ИП анти-NS5 IgG составил всего 1,7 — при показателе ИП = 1,0 было отсутствие образования специфических ЦИК) на фоне очень низкой частоты положительных ответов, упавшей до 36,8% в отличие от 88% в исходном состоянии.

Выводы

1. Поскольку максимальный уровень образования ЦИК происходит в зоне эквивалентности анти-

ген-антитело, то по величине ИП спектра анти-HCV IgG в составе ЦИК можно судить об уровне антигена, доступного для образования специфических иммунных комплексов.

2. Все исследуемые компоненты HCV обладают высокой степенью антигенности, вызывая у 100% больных IgG гуморальный иммунный ответ и специфически взаимодействуют с антителами, образуя ЦИК.

2. Образование ЦИК при HCV несет признаки специфичности, подтверждением чего являются выраженные различия в частоте их встречаемости на различные антитела HCV, наиболее часто проявляющиеся в группе с успешной противовирусной терапией. Одновременно в пользу высокой специфичности ЦИК свидетельствует выраженное снижение частоты их образования на фоне УВО+ при сохранении выраженного уровня специфических IgG.

ЛИТЕРАТУРА

1. Меньшиков В.В. Обеспечение качества лабораторных исследований / Меньшиков В.В., Делекторский Л.Н., Золотницкий Р.П. // Оправочник под ред., Меньшикова В.В. — М.: Медицина, 1987. — 368 с.

2. Николаева Л.И. Вирус гепатита С: антигены вируса и реакция на них иммунной системы макроорганизма // Информационно-методическое пособие. — Новосибирск: Вектор-Бест, 2009. — 78 с.

3. Николаева Л.И. Снижение содержания антител к вирусу гепатита С при антивирусной терапии / Л.И. Николаева, В.В. Макашова, Е.В. Петрова [и др.] // Биомедицинская химия. — 2009. — №2. — С. 201-211.

ртггттп