CC BY
36
Вестник СамГУ — Естественнонаучная серия. 2009. №2(68) 155
БИОЛОГИЯ
УДК 577.3: 612.111
СПЕКТРЫ ПЕПТИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ЭРИТРОЦИТАХ РАЗНОГО ВОЗРАСТА В УСЛОВИЯХ ДЕЙСТВИЯ ЭКЗОГЕННОГО АТФ
© 2009 Р.О. Кленов, Е.В. Чернова, Н.А. Кленова1
Исследованы спектры пептидных соединений в эритроцитах разного возраста при добавлении экзогенного АТФ в концентрациях 60-200 мкг/мл. Установлено, что экзогенный АТФ не изменяет спектра генерируемых пептидов, повышая лишь их количество при действии в концентрации 100-200 мкг/мл как на молодые, так и на старые клетки.
Ключевые слова: эритроциты, пептиды, АТФ.
Введение
Многочисленные исследования конца прошлого века показывают, что очень широкий спектр функций организма высших животных и человека регулируется олигопептидами и пептидами. Пептидная система межклеточной сигнализации оказалась наиболее многочисленной, а сами пептидные регуляторы особенно полифункциональными [1]. Изучение взаимосвязанных механизмов пептидной регуляции стало основой появления концепции существования в организме непрерывной совокупности регуляторных пептидов, обеспечивающих стимуляцию или подавление любых процессов жизнедеятельности.
В настоящее время известно несколько классов регуляторных пептидных соединений, это - нейропептиды, пептиды иммунной системы, регуляторы процессов пищеварения, атриопептиды и другие. Пути их регуляторных эффектов достаточно пристально исследуются, построены физикохимические модели межмолекулярных взаимодействий пептидов с клетками, однако в литературе мало освещаются молекулярные механизмы их
хКленов Роман Олегович, Чернова Екатерина Васильевна, Кленова Наталья Анатольевна ([email protected]), кафедра биохимии Самарского государственного университета, 43011, Россия, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.
внутриклеточного производства. Существует гипотеза В.Т. Иванова о специфическом пептидном пуле, который происходит из функционально активных высокомолекулярных белков путем тканеспецифичного ферментативного гидролиза этих белков до пептидов определенного размера [2]. Одним из таких белков-предшественников служит гемоглобин, для которого известно более 200 эндогенных пептидных соединений, получивших название гематиды. Они производятся различными клетками, а также обнаружены в эритроцитах [3].
Молекулярные механизмы внутриклеточного производства биологически активных фрагментов гемоглобина в эритроцитах недостаточно выяснены. Ранее нами были получены данные о зависимости уровня пептидных соединений от возраста клетки и активации адренорецеп-ции. Установлено, что активация примембранного комплекса протеаз цАМФ является одним из условий увеличения скорости гидролитического расщепления гемоглобина [4].
Целью данного исследования стало изучение влияния экзогенного АТФ как предшественника цАМФ на скорость производства пептидов в разных возрастных фракциях эритроцитов человека.
1. Материалы и методы
Работа проводилась на эритроцитах крови человека, предоставленной Областной станцией переливания крови. Объектом исследования служила чистая фракция эритроцитов человека, разделенная по возрасту на молодые и старые клетки [5]. Чистоту фракций определяли, используя индекс фильтруемости эритроцитов [6] и активности глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы [7].
В пробы, содержавшие фракции эритроцитов, добавляли раствор АТФ в конечных концентрациях 60, 100 и 200 мкг/мл с 400 мкг/мл тритона для увеличения проницаемости мембраны. После перемешивания и 5-минутного выдерживания проб при комнатной температуре белки осаждали 10 % ТХУ, добавляя к суспензии эритроцитов в отношении 1:2, и центрифугировали при 1000 g в течение 10 минут. В 0,2 мл надосадочной жидкости (ТХУ-экстракта) каждой пробы определяли содержание пептидных соединений по методу Лоури и при длине волны 254 нм. Измерение оптической плотности производили на спектрофотометре СФ-26.
По 0,5 мл экстракта каждой пробы фракции эритроцитов исследовали с помощью гель-хроматографии (колонка 8 х 190 мм, заполненная сефадек-сом 0-10; 0,1М фосфатный буфер pH 6,86 в качестве подвижной фазы, скорость элюции 0,5 мл/мин). Детекцию проводили на СФ-26 при длине волны 254 нм. Результаты выражали в усл.ед. — ОПхЮОО.
Для статистической обработки результатов использовали критерий Стьюдента.
2. Результаты и их обсуждение
Полученные ранее данные свидетельствовали, что активность примем-бранного комплекса протеолитических ферментов в эритроцитах человека зависит от уровня производства цАМФ, так как содержание пептидных соединений увеличивалось в условиях активации бета-адренорецепции. Причем возможность активации в значительной степени зависела от возраста клеток и наиболее отчетливо обнаруживалась в молодых, функционально полноценных клетках. Так как предшественником цАМФ в клетках является АТФ, было интересным проанализировать, что в данном случае имеет первостепенное значение - состояние рецепторного аппарата и возможность проведения сигнала или уровень производства АТФ, то есть состояние метаболических систем клетки.
Верификация разделенных на фракции по возрасту эритроцитов показала, что молодые клетки отличались более высоким индексом филь-труемости и значительной активностью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, что характеризовало их как функционально полноценные эритроциты (табл. 1) [8,9].
Таблица 1
Индекс фильтруемости и активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы фракций молодых и старых
эритроцитов человека
Фракция эритроцитов Индекс фильтру-емости, %, п = = 15* Активность глю-козо-6-фосфат-дегидрогеназы, Е**/эрит. в мл гемолизата, 25°С, п = 7* Активность глю-козо-6-фосфат-дегидрогеназы, Е**/эрит. в мл гемолизата, 37°С, п = 7*
Молодые клетки 83, 2 ± 5, 0*** 1, 278 ± 0, 032*** 2, 830 ± 0,142***
Старые клетки 41, 0 ± 0, 5 0, 940 ± 0, 051 2, 056 ± 0,115
Примечания: * — указано количество фракций, выделенных из крови разных доноров; ** — Е — международная единица активности ферментов; *** — достоверность различий р<0,01.
Кратковременная инкубация проб эритроцитов разного возраста с АТФ в концентрациях 60, 100 и 200 мкг/мл показала, что уровень пептидных соединений, регистрируемых по методу Лоури, достоверно не повышается по отношению к контрольным пробам. Причем эффект не зависит ни от возраста клеток, ни от концентрации вводимого извне АТФ.
Мы предположили, что очень малое возможное увеличение количества пептидов не регистрируется из-за недостаточной чувствительности метода Лоури, показывающего лишь повышение уровня пептидных связей. Действительно, анализ проб на наличие поглощения при Л = 254 нм позволил
обнаружить достоверное увеличение УФ-поглощения во фракциях молодых и старых клеток при добавлении АТФ в концентрации 100 и 200 мкл/мл (табл.2).
Таблица 2
УФ-спектры поглощения ТХУ-экстрактами эритроцитов в условиях действия экзогенного АТФ (у.е.)
Пробы Контроль 60 мкг/мл 100 мкг/мл 200 мкг/мл
Фракция молодых эритроци- тов 480 ± 44 576 ± 60 660 ±47* 768 ± 55*
Фракция старых эритроци- тов 588 ± 25 684 ± 41 792 ± 35** 876 ± 50**
Примечания: количество исследуемых фракций — 7, каждая имела по три повтора; * — достоверность различия р<0,05; ** — достоверность различия р<0,01.
Проведенная гель-хроматография проб обнаружила наличие одного узкого пика пептидных соединений средней молекулярной массы, величина которого повышается в зависимости от концентрации АТФ (см. рисунок).
Данные гель-хроматографии позволяют выявить лишь незначительные отличия в реакции разных по возрасту клеток на экзогенный АТФ, которые выражаются в отсутствии увеличения пика у старых клеток в ответ на введение АТФ в концентрации 100 мкг/мл, тогда как у молодых клеток он обнаруживается.
Анализ полученных данных позволяет с большой степенью достоверности утверждать, что производство биологически активных пептидов эритроцитами зависит прежде всего от наличия гормонального сигнала, а не от уровня АТФ в клетках. Полученные нами ранее данные хроматографии пептидных соединений, генерируемых в ответ на активацию бета-адреноре-цепции эритроцитов адреналином, свидетельствуют о наличии пика пептидов, присутствующего только в пробах с гормональным воздействием [10]. В пробах, содержавших адреналин, имелся пик, свидетельствующий о наличии пептидных соединений предположительно массой 700-1000 Да, тогда как общий пептидный фон, представленный во всех пробах, и при действии АТФ, вероятно, принадлежит пептидам массой более 1000 Да.
Таким образом, в концепцию производства биологически активных соединений пептидной природы в клетках путем гидролитического расщепления белковых предшественников можно включить наличие этапа акти-
Рис. Гель-хроматография пептидных соединений, выделенных из фракции молодых (А) и старых (Б) эритроцитов при внесении экзогенного АТФ (у.е.)
вации протеолитических ферментов с помощью предварительного сигнала,
полученного клеткой извне.
Литература
[1] Шатаева, Л.К. Пептидная саморегуляция живых систем (факты и гипотезы) / Л.К. Шатаева, В.Х.Хавинсон, И.Ю. Ряднова — СПб.: Наука, 2003. — 222 с.
[2] Ivanov,V.T. Hemoglobin as a source of endogenous bioactive peptides: the concept of tissue-specific peptide pool / V.T. Ivanov, A.A. Karelin, M.M. Philippova // Biopolimers (peptide Sci). — 1997. — V. 43. — №2. — P.171-188.
[3] Карелин, А.А. Протеолитическая деградация гемоглобина в эритроцитах приводит к образованию биологически активных пептидов / А.А. Карелин, М.М. Филиппов, О.Н. Яцкин // Биоорганическая химия. — 1998. — Т.24. — №4. — С.271-281.
[4] Кленова, Н.А. Механизмы генерации пептидов эритроцитами человека / Н.А. Кленова. Р.О. Кленов // Вестник СамГУ. — 2006. — №7. — С.75-79.
[5] Варламова, С.В. Методы сепарации возрастных фракций эритроцитов / С.В. Варламова // Лаб. дело. — 1989. — №9. — С.32-35.
[6] Tannert, T.C. Spreading of red cell blood suspensions on paper as simple test of cell deformability / T.C. Tannert, K. Lux // Acta biol.med germ. — 1981. — Bd.40. — P. 739-742.
[7] Beutler, E. Clucose-6-phosphate-dehydrogenase deficiency / E. Beutler // Am.J.Clin. Pathol and Clin.med. — 1963. — 63(3). — P. 203.
[8] Clarc, M.R. The Red Cell Production, Metabolism, Destruction / M.R. Clarc, N. Mohandas, S.B. Shohet // Blood. — 1983. — V.610. — P.899-910.
[9] Зинчук, В.В. Деформируемость эритроцитов:физиологические аспекты / В.В. Зинчук //Усп.физиол.наук. — 2001. — Т.32. — №. 3. — С.66-78.
[10] Кленова, Н.А. Механизм образования пептидных соединений в эритроцитах человека / Н.А. Кленова, Р.О. Кленов // Естествознание и гуманизм. — 2006. — Т.3. — №4. — С.16-17.
Поступила в редакцию 2/77/2009;
в окончательном варианте — 2/77/2009.
SPECTRA OF PEPTIDES IN ERYTHROCYTES DIFFERENT BY AGE IN THE CONDITIONS OF EXOGENOUS ATP ACTION
© 2009 R.O. Klenov, E.V. Chernova, N.A. Klenova2
Spectra of peptides in erythrocytes different by age at addition of exogenous ATP in concentration of 60-200 mkg/ml are investigated. It is established, that exogenous АТP does not change a spectrum of generated peptides, raising only their quantity at action in concentration of 100-200 mkg/ml both on young and on old living cells.
Key words and phrases: erythrocytes, peptides, ATP.
Paper received 2/77/2008. Paper accepted 2/77/2008.
2Klenova Nataliya Anatolievna ([email protected]), Chernova Ekaterina Vasilievna, Klenov Roman Olegovich, Dept. of Biochemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russia.
