Механизмы генерации пептидов эритроцитами человека Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577. 3

МЕХАНИЗМЫ ГЕНЕРАЦИИ ПЕПТИДОВ ЭРИТРОЦИТАМИ ЧЕЛОВЕКА1

© 2006 Н.А. Кленова, Р.О.Кленов2

Изучены механизмы образования пептидных соединений в эритроцитах в условиях активации (действие адреналина), блокирования (действие обзидана) и частичного блокирования (совместное действие лиганда и антагониста). Выявлена зависимость скорости образования пептидов от состояния мембраны, адренорецепции и энергоресурсов эритроцитарных клеток. Условием активации примембранного комплекса протеаз является скорость производства цАМФ и АТФ.

Введение

Известно, что большинство биологически активных соединений имеет пептидную природу. В настоящее время обнаружено более 200 эндогенных пептидных соединений, образуемых в различных тканях животных, которые являются фрагментами цепей гемоглобина [1]. Функция гемоглобина как предшественника сигнальных молекул может быть сравнима по важности с ролью переносчика кислорода и представляет несомненный интерес.

В течение ряда лет были получены данные о наличии у эритроцитов эндокринной функции, связанной с внутриклеточными процессами расщепления гемоглобина и генерацией фрагментов в плазму. Образующиеся пептиды обладают широким спектром биологической активности - опиоидной, рилизинговой, антипролиферативной, эритропоэтиновой. По данным А.А. Карелина и соавторов [1], лизис гемоглобина осуществляется комплексом высокоспецифических протеаз, локализованных на внутренней стороне мембраны эритроцита. Механизмы активации данного комплекса ферментов в настоящее время неизвестны. Можно предположить, что активация протеаз может осуществляться через фос-форилирование специфическими протеинкиназами, которые в свою очередь активируются цАМФ.

Включение аденилатциклазной системы сигнальными молекулами в таком случае будет сопровождаться увеличением производства пептидных соединений внутри эритроцитарных клеток. Целью исследования стало определение содер-

1 Статья представлена доктором биологических наук профессором О.Н .Макуриной.

2 Кленова Наталья Анатольевна ([email protected]), Кленов Роман Олегович, кафедра биохимии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.

жания пептидов в ТХУ-экстрактах эритроцитов в условиях активации и блокирования Р-адренорецепции.

Материалы и методы

Работа проводилась на эритроцитах донорской крови человека, предоставленной Областной станцией переливания крови. Объектом исследования служила чистая фракция эритроцитов человека, разделенная по возрасту на молодые и старые клетки [2]. Отмывку эритроцитов проводили 0,154 М холодным раствором №0 при 600 G в течение 10 минут. Фракцию молодых эритроцитов помещали в среду Рингера-Локка в отношении 1:1. Добавляли растворы адреналина и обзидана в конечной концентрации 10 мкг/мл, что удовлетворяло условиям ги-перадреналинемии. Эритроциты либо подвергали предварительной инкубации с сигнальными молекулами в термостате при 37оС в течение 20 мин., либо пробы сразу отмывали 0,154 М холодным раствором NaCl при 600 G однократно в течение 10 минут. Белки осаждали 10% ТХУ, добавляя к суспензии эритроцитов в отношении 1:2, и центрифугировали при 1000 G в течение 10 минут.

В 0,2 мл надосадочной жидкости (ТХУ-экстракта) каждой пробы определяли содержание пептидных соединений по методу Лоури, с добавлением 0,2 мл )

0,1М ^-фосфатного буфера (pH = 7,2) для нейтрализации излишней кислотности проб [3]. Измерение оптической плотности производили на спектрофотометре СФ-46.

Для статистической обработки результатов использовали критерий Фише-ра-Стьюдента [4].

Результаты и обсуждение

Полученные нами ранее данные показали, что инкубация гетерогенной популяции эритроцитов в условиях активации и блокады адренорецепции не сопровождается достоверным увеличением количества пептидных соединений при активации аденилатциклазной системы. Мы предположили, что это связано с повреждением мембраны эритроцита и выходом части пептидных соединений в инкубационную среду. Вероятно также, что процесс генерации пептидов, как и производство цАМФ, определяется энергоресурсами клетки. Также на производство пептидных молекул внутри клетки могут оказывать влияние состояние мембраны эритроцита и длительность воздействия сигнальных молекул. Чтобы проверить эти предположения, мы определили содержание пептидных соединений во фракции молодых эритроцитов после инкубации с адреналином и обзи-даном, а также без инкубации во фракциях клеток, различающихся по энергостатусу и состоянию мембран: молодых и старых.

Результаты инкубации в течение 20 минут фракции молодых эритроцитов в присутствии адреналина и обзидана не показали достоверных изменений в контрольной, адреналиновой и обзидановой пробах. Однако имелась выраженная

тенденция к повышению количества пептидов при активации адренорецепторов в присутствии адреналина и уменьшению их содержания в условиях блокады адренорецепторов обзиданом (табл.). При совместном инкубировании с адреналином и обзиданом пробы отличались достоверно (р<0,05) более низким содержанием пептидных соединений по сравнению с контролем. Уменьшение составило около 20% от контрольной пробы.

Таблица

Содержание пептидных соединений в ТХУ-экстрактах фракций эритроцитов в условиях активации и блокады Р-адренорецепции, мкг/мл

Контроль Адреналин Обзидан Адреналин + Обзидан

при инкубации (п=11)

Фракция молодых эритроцитов 564,5 ± 19,6 513,6 ± 42,3 622,7 ± 44,3 452,7 ± 37,5*

без инкубации (п=6)

Фракция молодых эритроцитов 196,3 ± 17,4 279,3 ± 16,5** 197,7 ± 26,1** 239,7 ± 25,9

Фракция старых эритроцитов 88,6 ± 10,1 96,3 ± 13,9 81,3 ± 19,9 95,6 ± 10,7

Примечание: * - достоверность различия р<0,05; ** - достоверность различия р<0,01.

Отсутствие достоверных различий в адреналиновых пробах можно объяснить повреждением мембраны эритроцита вследствие продолжительного действия адреналина. Взаимодействие этого гормона с Р-адренорецептором сопровождается активацией фосфолипаз, увеличением ПОЛ, что приводит к росту проницаемости эритроцитарных мембран [6 - 9]. Проба инкубации в присутствии обзидана не имела достоверного увеличения концентрации пептидов, вероятно, из-за того, что обзидан не является лигандом рецептора и не проводит сигнала.

Исследования, проведенные без инкубации на клетках, различных по возрасту, также подтвердили возникшие предположения. Фракции молодых и старых эритроцитов, воздействие на которых сигнальных молекул длилось очень короткий промежуток времени, отличались достоверно (р<0,01) более низким показателем содержания пептидных соединений по сравнению с клетками, подвергавшимися инкубации. Фракция молодых эритроцитов при воздействии адреналина имела достоверно более высокую концентрацию пептидных соединений (табл.). Процентное повышение составило более 40%. При блокировании Р-адренорецепции обзиданом содержание пептидных соединений не отличалось от контрольной пробы. Это обусловлено, видимо, тем, что обзидан не активирут аденилатциклазу через адренорецептор. Совместное воздействие адреналина и

обзидана сопровождается только тенденцией к повышению содержания пептидных молекул. Вероятно, это объясняется эффективной конкуренцией обзидана за Р-адренорецептор в первые мгновения действия лиганда и антагониста [10,11].

Фракция старых эритроцитов отличалась гораздо меньшим фоновым значением содержания пептидных молекул (р<0,01). Возможно, это связано с ухудшением состояния эритроцитарных мембран и энергообеспечения клеток, вызванного возрастными изменениями в составе мембраны и в активности некоторых ферментов [9,16]. Вероятно, по этим причинам в пробах фракций старых эритроцитов не наблюдалось достоверных различий в содержании пептидных соединений. Однако в этих пробах присутствует сходная с фракцией молодых эритроцитов тенденция изменений.

Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать следующие выводы о механизмах генерации пептидных соединений в эритроцитах человека:

1. Активность примембранного комплекса протеаз определяется уровнем производства цАМФ, так как скорость генерации пептидных соединений в эритроцитах человека увеличивается в условиях активации адренорецеп-ции.

2. Скорость генерации пептидных соединений зависит от состояния мембраны и энергоресурсов клетки (возраста клетки).

3. На генерацию пептидных соединений оказывает влияние время воздействия сигнальных молекул.

Литература

[1] Карелин, А.А. Протеолитическая деградация гемоглобина в эритроцитах приводит к образованию биологически активных пептидов / А.А. Карелин, М.М. Филиппов, О.Н. Яцкин // Биоорганическая химия. - 1998. - Т. 24. -№ 4. - С. 271-281.

[2] Варламова, С.В. Методы сепарации возрастных фракций эритроцитов / С.В. Варламова // Лаб. дело. - 1989. - № 9. - С. 32-35.

[3] Большой спецпрактикум по биохимии / сост. Н.А. Кленова. - Самара: Изд-во: «Самарский университет», 1996. - 88 с.

[4] Фролов, Ю.П. Математические методы в биологии. ЭВМ и программирование: Теоретические основы и практикум / Ю.П. Фролов. - Самара: Изд-во: «Самарский университет», 1997. - 266 с.

[5] Борисенко, Г.М. Особенности Р-адренергического рецептора при гипертонической болезни и спонтанной гипертензии у крыс / Г.М. Борисенко // Кардиология. - 1982. Т. XXII. - № 3. - С. 120-125.

[6] Исследование механизмов влияния температурного и химического факторов на функционирование биологических мембран / И.И. Выборнова [и др.] // Физиология человека. - 1997. - Т. 23. - № 1. - С.70-80.

[7] Галактионов, С.Г. Пептиды группы «средних молекул» / С.Г. Галактионов,

B.М. Цейтин, В.И. Леонова // Биоорганическая химия. - 1984. - Т.10. - №1. -

C. 5-17.

[8] Колобова, Е.В., Оценка Р-адренореактивности эритроцитов у рожающих женщин/ Е.В. Колобова, С.А. Дворянский, В.И. Циркин // Физиология человека. - 1998. - Т. 24. - №3. - С. 134-142.

[9] Макшанова, Г.П. Изменение проницаемости эритроцитарных мембран и показателей липидного обмена у больных с политравмой при раннем и отсроченном оперативном лечении / Г.П. Макшанова, И.М. Устьянцева // Физиология человека. - 2003. - Т. 29. - №1. - С.95-99.

[10] Мазур, Н.А. Основы клинической фармакологии и фармакотерапии в кардиологии / Н.А. Мазур. - М.: Медицина, 1988. - 304 с.

[11] Перцева, М.Н. Мембранный комплекс гормон-рецептор-аденилатциклаза и его функциональное формирование в онтогенезе / М.Н. Перцева // Усп. совр. биологии. - 1982. - Т. 93. - Вып. 3. - С.382-396.

Поступила в редакцию 25/IX/2006; в окончательном варианте - 4/X/2006.

MECHANISMS OF PEPTIDES GENERATION BY ERYTHROCYTES OF A MAN3

© 2006 N.A.Klenova, R.O.Klenov4

In conditions of activation epinephrine receptors by an epinephrine the speed of peptides generation in erythrocytes of a man is enlarged, and blocking - the activity of the complex of proteases about the membrane is reduced, therefore, is de-fined(determined) by an output level cAMP. The speed of peptides generation also depends on a state of a diaphragm, power resources of a cell and time of signal molecules operation.

Paper received 25/IX/2006.

Paper accepted 4/X/2006.

3 Communicated by Dr. Sci. (Biology) Prof. O.N. Makurina.

4 Klenova Nataliya Anatolievna ([email protected]), Klenov Roman Olegovich, Dept. of Biochmistry, Samara State University, Samara, 443011, Russia.