CC BY
38УДК 544.032.732
С.С. Лысова1, Ю. Э. Зевацкий2
Константа ионизации (рКа) - важная физико-химическая характеристика органических соединений, отражающая их кислотно-основные свойства, знание которой имеет фундаментальное значение в широком диапазоне областей исследования. В последнее время рост интереса к определению констант ионизации органических соединений объясняется интенсивным развитием фармакологии и смежных с ней наук (life science), для которых главным методом исследования является высокоэффективный биоскрининг. В фармацевтических исследованиях для открытия и оценки новых органических молекул особенно важной задачей является определение физико-химических параметров биологически активных веществ [1]. В данный комплекс основных параметров, которые могут быть использованы для прогноза фармакодинамических и фармакокинетических свойств веществ, таких как, поглощение, распределение, метаболизм, выведение и токсичность, так называемый ADMET-профиль, входит численная характеристика кислотно-основных свойств молекул -рКа [2-4]. Кроме того, эта величина определяет состояние протонирования соединения в заданной среде, поэтому от значения рКа зависят любые транспортные свойства, а именно, возможность, направление и интенсивность процессов переноса.
Термодинамическая величина рКа является ключевой характеристикой вещества, используемой в физической органической химии. Поскольку рКа является константой равновесия простейшей реакции переноса протона, то анализ изменения этой величины позволяет количественно оценить влияние структуры вещества и реакционной среды на состояние химического равновесия. Поэтому величина константы кислотности (основности) также полезна для изучения количественных зависимостей структура - свойство [5-8]. С этой точки зрения особую ценность представляют классические методы, позволяющие получить именно термодинамические значения рКа. К ним можно отнести потенциометрический, кондуктомет-рический и спектрофотометрический методы определения
СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗНАЧЕНИЙ КОНСТАНТ ИОНИЗАЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26.
Обзор посвящен рассмотрению опубликованных к настоящему времени работ по определению констант ионизации органических соединений в водных растворах с использованием современных и более экономичных по времени экспресс-методов. Проведен сравнительный анализ преимуществ и недостатков методов, указаны границы их применимости. Рассмотрены их основные подходы, а также проблемы несогласованности экспериментальных данных с традиционными методами определения констант ионизации.
Ключевые слова: константы ионизации, водные растворы, экспресс-методы, погрешности измерений
констант ионизации, а также менее распространенный ЯМР метод, и в редких случаях, когда другие методики непригодны - метод растворимости. Традиционные методы имеют хорошую точность, но относительно медленны и могут требовать большого количества анализируемого вещества.
Зачастую для решения прикладных задач биохимии и химической технологии знание точных термодинамических значений рКа не требуется, а важность быстроты и удобства используемых методик ставится на первый план, что сказывается на тенденциях развития быстрых экспресс-методов, сочетающих в себе одновременное определение рКа и разделение смеси на компоненты, а также проведение анализа в режиме on-line. К ним относятся различные варианты жидкостной хроматографии (ЖХ) [9-13] и капиллярного электрофореза (КЭ) [9,14-35]. Кроме того, в биохимии важной задачей является определение кислотно-основных свойств отдельных активных центров, т.е. микроконстант ионизации, для определения которых лучше всего подходит метод 13С или 15N ЯМР титрования [36-39]. Это особенно важно при анализе биологических и других многокомпонентных материалов характеризуемых одним фармакологическим свойством.
Главной целью разрабатываемых новых экспресс-методик является поиск компромисса между скоростью измерения и точностью определения рКа. Иногда точность измерений может пострадать, в зависимости от преследуемой цели. Например, быстрота измерений важна на ранних стадиях разработки новых препаратов. Поэтому погрешности экспресс-методов выше, чем у традиционных, однако это является допустимым для большинства задач в фармацевтической промышленности.
Биологические среды - водоподобные, поэтому для биоскрининга наиболее важными являются значения рКа в воде и водно-органических смесях.
Как известно, сила любой кислоты АН в водном растворе оценивается константой кислотности Ка реакции переноса протона от кислоты к воде:
1 Лысова Светлана Сергеевна, аспирант, каф. химии и технологии органических соединений азота, e-mail: [email protected]
2 Зевацкий Юрий Эдуардович, канд. хим. наук, заведующий лабораторией ЗАО «Новбытхим», докторант СПбГТИ(ТУ), e-mail: [email protected]
Дата поступления - 01 апреля 2009 года
АН + Н20 «• А" + Н30+
(1)
Термодинамическая или «истинная» константа диссоциации кислоты НА в соответствии с равновесием (1) рав-на:
а.. а„ „+
Ка =
(2)
"ан"Н2О
где аА, анзо, оан, ан2о - активности соответствующих веществ.
В разбавленных растворах активность воды можно принять постоянной и обычно анзо+ обозначают как аН -активность ионов водорода, тогда можно записать:
Ка1
(3)
Термодинамические константы могут быть выражены через концентрации с и коэффициенты активности £
Ка1 =
ан + сл- fA-
if А.
(4)
После логарифмирования с учетом того, что pH = - Ig ан+, получаем
Т _ „LT , 1„САН , 1 „fAH
рКа = pH + lg-^ + lg
Сл fA-
Аналогично, для протонированного основания:
С— Л,
рК = pH + lg-^ + lg^
BH+ св J в
(5)
(6)
Для ориентировочных расчетов можно использовать концентрационную константу кислотности, которая изменяется при разбавлении:
Ка * == ^я!.
(7)
-лн
Здесь сА, сн+, сан - концентрации соответствующих веществ. Часто применяют так называемую наблюдаемую или «кажущуюся» константу диссоциации:
Ка"
сл- ан+
(8)
где ан+- определяется из уравнения рН = - 1д ан+, причем рН определяется различными экспериментальными методами.
Термодинамическая константа диссоциации связана с наблюдаемой и концентрационной константами следующим соотношением:
Кат = Кана6л -а- = Кас , (9)
/ан /на
где £а, £ан - коэффициенты активности соответствующих равновесных форм, которые зависят от концентрации, температуры и среды.
При бесконечном разбавлении термодинамическая, концентрационная и наблюдаемая константы становятся равными КаТ = Кас = Ка,"36". Так как измерения проводятся в реальных условиях, именно зависимость коэффициентов активности от многих факторов и определяет различие между КаТ, КасиКа"6".
Существующие в настоящее время методы определения рКа основаны на анализе зависимости любого свойства изучаемого вещества (оптическая плотность, химический сдвиг, емкостной фактор и т.д.) от показателя кислотности среды рН, определяемый как отрицательный ло-
гарифм активности протонов в данной среде - ран+. Как известно, экспериментальное определение активностей индивидуальных ионов в водных растворах - трудноразрешимая задача [40]. Для их получения неизбежны различные приближения и допущения принятые в этой области и закрепленные в рекомендациях IUPAC [41]. Наибо-лее распространенным приближением является классическое уравнение Дебая-Хюккеля [42], по которому рассчитывается средний коэффициент активности ионов.
Очевидно, что несоблюдение таких условий, как поддержание постоянной ионной силы и температуры, а также неправильный выбор буфера приводит к закономерному снижению достоверности получаемых результатов.
Современные экспресс-методы определения констант ионизации
Физико-химические основы определения рКК современными экспресс-методами были заложены еще в 80-е годы двадцатого века [14, 43-45]. В последнее время из-за активного применения этих методов в биохимии, разработка и усовершенствование их бурно продолжается, о чем свидетельствуют большое количество публикаций [9-13, 15-35]. Некоторые из них уже достигли определенной степени зрелости, такие как капиллярный электрофорез (КЭ) [9, 14-35], который является рекордсменом по количеству издаваемых работ.
Капиллярный электрофорез
КЭ - это метод разделения и определения различных компонентов сложных смесей, в котором при создании разности потенциалов на концах капилляра происходит протекание двух процессов. Первый процесс называется электрофоретическим разделением и представляет собой движение заряженных индивидуальных ионов в жидкости. Второй процесс - электроосмос, который приводит в движение всю жидкость в капилляре.
Впервые КЭ как удобный и быстрый метод определения констант ионизации водных растворов был предложен в 1991 г. Becker и др. [14]. В силу своих плюсов, интерес к КЭ заметно увеличивается, в основном для определения рКа активных фармацевтических ингредиентов (APIs) [1, 22, 34-35].
Определение значений рКа капиллярным электрофорезом основано на регистрации зависимости эффективной подвижности ионов аналита meff, при постоянной ионной силе, от рН. В данной методике meff используют для описания полной электрофоретической подвижности всех прототропных форм аналита. Для одновалентной кислоты эффективную подвижность можно записать как meff = xrmep, где л;- - мольная доля одновалентной кислоты анионной формы, mep - электрофоретическая подвижность аниона. Неионизированная форма аналита имеет относительную нулевую подвижность, а в полностью ионизированном состоянии - максимальную подвижность ионов. Мольная доля анионной формы одновалентной кислоты рассчитывается по уравнению:
Ка 1 х А " Пгл—или х =--—р—77Т .(10)
А [н +|+ Ка А 1 + 10<рКа- H v '
Для общего случая эффективную подвижность можно
записать:
m
eff
-I
хж*
(11)
где х, - мольная доля ¡-ой прототропной формы аналита и ее электрофоретическая подвижность тер,. Таким образом, величину рКа для одновалентной кислоты можно получить из уравнения:
10
рКа
10-рКа + 10
рН
■ т„
(12)
Математическая модель, связывающая указанную зависимость со значениями рКа для многопротонных кислот и оснований, более сложная и подробно описана в [15-16]. Для веществ содержащих до трех реакционных центров, соответствующие модели были получены в обзоре [17].
Эффективную подвижность аналита экспериментально определяют при различных рН используя следующее уравнение [18]:
LLr
т
<ff
V
1 1
t, t„„
(13)
где L - общая длина капилляра, LD - расстояние между точкой ввода пробы и детектором, V - прикладываемое напряжение, ts - время миграции анализируемого раствора, tea - время перемещения нейтрального состава маркера. В качестве нейтрального состава маркера используют метанол, ацетон или диметилсульфоксид [18-20]. К часто используемому составу для определения tea относится диметилсульфоксид, который имеет сильное ультрафиолетовое поглощение ниже 230 нм и высокую стабильность. Критический подход в выборе буфера, который не должен обладать ультрафиолетовым поглощением в соответствующей длине волны, а также обязан иметь подобную элек-трофоретическую подвижность, как и у ионизированной формы образца, приводит к улучшению результатов. Самыми популярными буферами для КЭ являются ацетатный, фосфатный и цвиттерионный [18].
К основным достоинствам КЭ с позиций современных требований можно по праву считать:
- одновременное определение термодинамической рКа и разделение смеси на компоненты, что не требует выделения анализируемого вещества в чистом виде;
- использование для анализа небольшого количества анализируемого вещества (до нескольких нанограммов);
- не требует знание точной концентрации определяемого вещества, так как в расчетах используется только электрофоретическая подвижность ионов;
- применение с успехом для определения рКа неустойчивых в воде составов [21];
- легкость автоматизации процесса и сокращение времени анализа.
В свою очередь, непостоянство рН буфера по всей длине капилляра, которое может быть вызвано электрохимической реакцией в электродах или поглощением углекислого газа из воздуха, по мнению авторов в работе [22], является одним из препятствий, сдерживающим получение адекватных результатов. Самая общая электрохимическая реакция - гидролиз воды, которая ведет к накоплению водородных ионов на катоде и гидроксильных ионов на аноде. В данной работе проведены измерения рН на концах анода и катода, где были выявлены расхождения в величинах рН на 0,10-0,24 лог. единиц. В серии работ [28-30, 33], измерения рН обычно проводили до введения в капилляр, что может приводить к соответствующим погрешностям в рКа.
Существенным недостатком метода является ополаскивание капилляра соответствующим буфером перед каждой инжекцией, что увеличивает время анализа. Хотя разность эффективных подвижностей, полученных с ополаскиванием и без ополаскивания капилляра составляет 2%, что по мнению авторов [23] значительно не воздействует на величину рКа. Для сокращения времени проведения
измерений, в работах [22, 24] использовали дополнительное внешнее давление воздуха, но это приводит к уменьшению эффективности разделения.
Детектор с фотодиодной матрицей - самый распространенный детектор, используемый в КЭ [9, 25], который сводит его к классическому спектрофотометрическому методу, и придает ему некоторые преимущества. Комбинация КЭ с масс-спектрометром [24] гарантирует точное обнаружение примесей.
Жидкостная хроматография
Определение величин рКа в жидкостной хроматографии (ЖК) основано на регистрации зависимости времени удерживания анализируемого вещества от рН подвижной фазы (элюента). Фактор удерживания (коэффициент емкости) к может быть установлен непосредственно из хро-матограммы на основании общего времени удерживания интересующего компонента ^ и времени подвижной фазы
и:
к =
t - t
г п
t„
(14)
Для одновалентной кислоты, наблюдаемый фактор удерживания можно записать, как функцию фактора удерживания нейтральной и анионной формы (кн и к) и их мольной доли (хна и Ха) [10]:
к = ХНА кНА + кА
или более общий случай:
к = \ к .
(15)
Мольные доли одновалентной кислоты анионной и нейтральной формы рассчитываются по формуле (10) и (16)
[я+] 1^.РКа- рн )
х- = [7К- илихнА = тгт^Н).(16)
Таким образом, уравнение (15) для одновалентной кислоты можно записать в следующем виде:
к =
кНЛ 10
рН
+ к,- ■ 10
рКа
10- рН + 10
рКа
(17)
Это уравнение связывает фактор удерживания анализируемого вещества с рН подвижной фазы и может использоваться для определения величины рКа одновалентной кислоты, а также для предсказания хроматографиче-ского поведения аналита.
В настоящее время для определения констант ионизации наиболее широко используется обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ) с постоянным рИ элюента [9, 11]. В качестве элюента применяются в основном смесевые растворители воды с метанолом [9], ацетонитрилом [10] и др. [12]. Для неподвижной фазы обычно применяют гидрофобные вязкие среды. Эта традиционная схема ОФ ВЭЖК не обеспечивает высокую скорость измерения, так как при каждом значении рН необходимо проводить прогон хроматограм-мы. Для достижения сокращения времени анализа активно применяется метод ОФ ВЭЖК с линейным градиентом рН, в различных модификациях [12, 13]. При этом состав элюента непрерывно изменяется по определенной программе и линейно зависит от времени. Благодаря этому сокращается время анализа, а пики можно обрабатывать с одинаковой точностью по всей хроматограмме. Очевидно, что точность определения констант ионизации с линейно
зависящим от времени градиентом рН значительно ниже, чем с постоянным, поскольку значения рН получаются приближенно из эмпирической зависимости, а поддержание ионной силы крайне осложнено.
К основному недостатку метода ЖХ, можно также отнести нестабильность рН элюента за счет взаимодействия его с неподвижной фазой, которая более выражена, чем при КЭ. Кроме того, вода и водно-органические смеси с низким содержанием органического растворителя имеют большие времена удерживания, что неблагоприятно для оценки рКа.
На основании результатов работы [10] можно сделать вывод, что средние отклонения значений рКа в ЖХ более высоки, чем полученные потенциометрическим и спектро-фотометрическим методами. Однако разделяющую способность и универсальность современной ВЭЖХ трудно переоценить.
Комбинированные методы
В последние годы появились новые гибридные методы, использующие методологию КЭ и ЖХ в комбинации с современными скоростными приемами регистрации спектров поглощения, с использованием диодных матриц (DAD) [9, 10, 19, 32]. В этих случаях значения рКа могут быть определены, используя спектры поглощения, полученные при максимумах электрофоретических (CE-DAD) или хроматографических (LC-DAD) пиков. Одновременное применение двух методик в определенной мере дополняют друг друга, что позволяет подтверждать результаты, не увеличивая при этом время анализа. Другие возможности, используемые на практике - это комбинации КЭ и ЖХ с масс-спектрометрией, что значительно ускоряет процесс анализа [24,46]. КЭ с масс-спектрометрическим детектированием (CE-MS) успешно применяется для труднорастворимых веществ, а также соединений с мало выраженными различиями в спектрах прототропных форм [24]. Главное ограничение масс-детектора - использование составов с близкими молекулярными массами, которые при анализе могут быть не распознаны.
Традиционные методы определения констант ионизации
В настоящее время, несмотря на широкое применение экспресс-методов измерения рКа, параллельно с ними применяются и традиционные методы. Об этом свидетельствует целый ряд публикаций, где значения рКа определяются современными высокоскоростными и классическими методами, дающими более адекватные результаты [9-10, 24, 31, 38, 46-48].
Потенциометрическое титрование
Исторически, среди традиционных методов, потенциометрическое титрование - наиболее удобный и быстрый метод определения констант ионизации, особенно для определения рКа в водных растворах. При правильной эксплуатации эта методика точна и имеет хорошую воспроизводимость [48].
При потенциометрическом титровании значение рН, входящее в уравнение (5) и (6), определяют чаще всего при помощи потенциометрического прибора, который обычно называют рН-метром. Практически невозможно измерять потенциалы отдельного электрода. Поэтому со -ставляют гальванический элемент из двух электродов: водородного (стеклянного) и какого-нибудь вспомогательного, между которыми возникает разность потенциалов. Предварительно прибор калибруется с помощью ряда эталонных буферных растворов.
Для получения адекватных значений рКа важно также учитывать особенности и ограничения электродов, используемых для измерения величин рН. По международному соглашению в качестве стандартного электрода сравнения принят стандартный водородный электрод [49]. Этот электрод малопригоден в обычных условиях работы, так как он легко отравляется, а часто и взаимодействует с исследуемым веществом. Поэтому на практике широко применяется стеклянный электрод, а в качестве вспомогательного используют насыщенный каломелевый электрод или хлорсеребряный.
Логарифм ионизационного отношения уравнений (5) и (6) рассчитывается исходя из количества добавленного к анализируемому раствору кислоты (основания) известные порции титранта - сильного основания (или сильной кислоты). Такой метод применим лишь для кислот средней силы (рКа 4-10), так как для более сильных кислот следует вводить поправку на самоионизацию, а для слабых учитывать гидролиз ионов. Тем не менее, обрабатывая зависимость (кривую титрования) рН раствора с известной концентрацией анализируемого вещества от объема добавленного титранта различными способами, такими как, метод Грана [50], метод второй производной (Д2рН/ДУ2) [51], можно определить константу ионизации соединения в интервале 1-11 лог. ед.
Основным недостатком метода является использование достаточно большого количества анализируемого вещества (10-2 - 10-3) моль/л для существенного изменения в форме кривой титрования. Кроме того, для анализа следует брать лишь аналитически чистые вещества. К достоинствам потенциометрического метода можно отнести легкость автоматизации процесса титрования.
Спектрофотометрический метод
Дополнительным вариантом к потенциометрии относится спектрофотометрия, так как является идеальным методом при определении констант ионизации труднорастворимых веществ и позволяет работать с низкими концентрациями образцов (10-4 - 10-5 моль/л), а также в случае очень низких или высоких значений рКа (менее 1,5 или более 11 лог.ед.). Однако в этом случае, должно быть хорошее разрешение полос поглощения равновесных форм в видимой области спектров.
Спектрофотометрический метод определения констант ионизации основан на измерении электронных спектров смеси прототропных форм при нескольких значениях рН в окрестности предполагаемого значения рКа. Второй член уравнений (5) и (6) - ионизационное отношение - находится в соответствии с принципом аддитивности Фирордта и закона Бугера-Ламберта-Бера, а также материального баланса. Таким образом, смешанная величину рКа для нейтральной кислоты типа (НА) определяется при фиксированной длине волны и постоянной аналитической концентрации по уравнению:
d - d
pKa = pH + lg A , (18)
d d ha
где d - оптическая плотность анализируемого раствора при данном рН; dA~ и dm - оптические плотности раствора, содержащего только форму А или НА (аналогично для протонированного основания ВНН).
Для поддержания в водных растворах постоянной ионной силы на уровне 0.01 моль/л были разработаны специальные буферные составы [52]. Также необходимо учитывать и возможность специфического действия буферного раствора на исследуемое вещество. Очевидно, что при измерениях в ультрафиолетовой области спектра
следует пользоваться буферными растворами, слабо поглощающими в этой области спектра [53].
Более подробно спектрофотометрический метод определения значений рКа описан в ряде фундаментальных работ [53-56].
Классическая спектрофотометрическая методика требует приготовления большого числа серий буферных растворов и связана с большим расходом анализируемого вещества. Поэтому, в последнее время используют много-волновое спектроскопическое титрование (multiwave-length spectrophotometry titration) [57-59], в котором отсутствуют рассмотренные выше ограничения.
Важно заметить, что в литературе встречаются неудовлетворительные результаты, полученные и традиционными методами, где большинство данных по значениям рКа получено до 50-60 г.г. ХХ века. Поэтому вполне возможно, что несогласованность результатов полученных по разным методикам и в разное время, в обозримом будущем может создать почву для появления трудностей в отборе данных, предназначенных для задач физической органической химии. Встречающиеся в литературе очень высокие или очень низкие значения рКа следует всякий раз критически рассматривать, прежде чем окончательно принимать.
Кондуктометрический метод Кондуктометрический метод основан на измерении электропроводности растворов соединений с различной концентрацией. В данном методе определяют степень ионизации электролита а, как отношение молярной электропроводимости при данной концентрации (Лс) к предельной молярной электропроводимости (Л™), которая определяется экстраполяцией к бесконечному разведению:
а = Лс /Л™ (19)
В соответствии с законом действия масс:
К.
а 2 • с
1 -а
(20)
Различные подходы к расчету констант диссоциации наиболее полно рассмотрены в обзоре [60].
Определение констант ионизации с помощью кондук-тометрического метода занимает обычно несколько больше времени, нежели потенциометрически. Это менее гибкий и удобный метод, но он полезен при работе со слабыми кислотами и основаниями [61]. Большая часть констант ионизации, определенных до 1930 г., была найдена именно этим методом, но многие из полученных значений оказались неточными.
Метод ЯМРР
Применение ЯМР для определения рКа [36-39, 62] основано на регистрации зависимости химического сдвига ядра (13С или 151\1) ближайшего к активному центру атома от рН. Зависимость химического сдвига от отношения концентрации протонированной и непротонированной форм аналита линейна, что является одним из достоинств данного метода [63]. Значительные усовершенствования метода привели к созданию двумерного ЯМР анализа [37, 62].
Метод растворимости
Метод растворимости основан на измерении возрастания растворимости в воде исследуемого вещества при различных значениях рН раствора. Этот метод не так то -чен, как другие традиционные методики, но бывает полезен в тех случаях, когда нельзя использовать другие методы, в силу их вышеуказанных ограничений. Все определения выполняются при высокой ионной силе, поэтому полученные величины значительно отличаются от значений термодинамических констант.
Заключение
Вместе с тем, критическое рассмотрение современных экспресс-методов [12, 13, 24], а также справедливое признание авторов работы [9, 22], позволяет заключить, что точность и достоверность данных полученных традиционными методами все же значительно выше, чем современными.
Литература
1. Babic S, Horvat J.M., Mutavdzic Pavlovic D, Kastelan-Macan M. //Trends Anal. Chem. 2007. Vol. 26. P. 1043-1061.
2. Tehan B.G., Lloyd EJ., Wong M.G., Pttt W.R., Garcia E, Manal-aackD.T. // Quant. Struct. Act. Relat. 2002. Vol. 21. P. 473-485.
3. JelfsS., ErtiP., SelzerP. // J. Chem. Inf. Model. 2007. Vol. 47. P. 450-459.
4. Avdeef A, Testa B. // Cell. Mol. Life Sci. 2002. Vol. 59. P. 1681-1689.
5. GieleciakR, PolanskiJ. // J. Chem. Inf. Model. 2007. Vol. 47. P. 547-556.
6. Carabias-Martinez R., Rodrigues-Gonzalo E., Dominguez-Alvarez J., Miranda-Cruz E. // Anal. Chim. Acta. 2007. Vol. 584. P. 410-418.
7. JoverJ., Bosque R, Sales J. // QSAR & Comb. Sci. 2008. Vol. 27. P. 563-581.
8. Shan X, Qin W, Zhou Z, Dai Y. // J. Chem. Eng. Data. 2008. Vol 53. P. 331-334.
9. Erdemgll F.Z., Sanii S, Sanii N, Oezkan G, Barbosa J., Guiteras J,, Beltran J.L. // Talanta. 2007. Vol 72. P. 489-496.
10. Beltran J.L., Sanii N, Fonrodona G, Barron D, Ozkanb G, Barbosa J. // Anal. Chim. Acta. 2003. Vol. 484. P. 253-264.
11. Sancho M.I., JubertAH., Blanco S.E., FerrettiF.H., Castro E.A. // Can. J. Chem. 2008. Vol. 86. P. 462-469.
12. Wiczling P., Kawczak P., Nasal A., Kaliszan R. // Anal. Chem. 2006. Vol. 78. P. 239-249.
13. Markuszewski M.J, Wicziing P., Kaiiszan R. // Comb. Chem. High Throughput Screening. 2004. Vol. 7. N. 4. P. 281-289.
14. Beckers J.L, Everaerts F.M., Ackermans M. T. // J. Chromatogr. 1991. Vol. 537. P. 407-428.
15. Ishihama Y.I, Oda Y, Asakawa N. // J. Pharm. Sci. 1994. Vol. 83. N. 10. P. 1500-1507.
16. GluckS.J, Steele K.P., Benko M.H. // J. Cromatogr. A. 1996. Vol. 745. P. 117-125.
17. Poole S.K., Patel S, Dehring K, Workman H, Poole C.F. // J. Chromatogr. A. 2004. Vol. 1037. P. 445-454.
18. Poole C.F. The Essence of Chromatography. Elsevier, Amsterdam, The Netherlands., 2003. 623 pp.
19. Jimenez-Lozano E, Marques I, Barron D, Beltran J.L, Barbosa J. // Anal. Chim. Acta. 2002. Vol. 464. P. 37-45.
20. JanosP. // J. Chromatogr. A. 2004. Vol. 1037. P. 15-28.
21. Ornskov E, Linusson A, Folestad S. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2003. Vol. 33. P. 379-391.
22. Jia Z, Ramstad T, ZhongM. // Electrophoresis. 2001. Vol. 22. P. 1112-1118.
23. Yang L, Yuan Z. // Electrophoresis. 1999. Vol. 20. P. 2877-2883.
24. Wan H, Holmen H.G., Wang Y, Lindberg W, Englund M, Nagard M.B., Thompson R.A. // Rapid Commun. Mass Spectrom.
2003. Vol. 17. P. 2639-2648.
25. Curie C.A., Heineman W.R., Hassall H.B., Seiiskar C.J., Limbach P.A., Arias F, Wehmeyer K.R. // J. Chromatogr. B. 2005. Vol. 824. P. 201-205.
26. Bartrak P., Bednar P., Stransky Z, Bocer P., Vespalec R. // J. Chromatogr. A. 2000. Vol. 878. P. 249-259.
27. Zuskova I, Novotna A, Vcelakova K, Gas B. // J. Chromatogr. B. 2006. Vol. 841. P. 129-134.
28. Lin Ching-Erh, Deng Yan-Jr, Lao We--Ssu, Sun Shao-Wen, Lin Wann-Yin, Chen Chia-Chong. // Journal of Chromatogr. A.
2004. Vol. 1051. P. 283-290.
29. Glukhovskiy P.V., Vigh G. // Electrophoresis. 1998. Vol. 19. P. 3166-3170.
30. Jankowsky R, Friebe M, Noll B, Johannsen B. // J. Chromatogr. A. 1999. Vol. 833. P. 83-96.
31. Andrasi M., Buglyo P., ZekanyL, GaspiarA. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2007. Vol. 44. P. 1040-1047.
32. Perez-Urquiza M., Bettran J.L. // J. Chromatogr. A. 2001. Vol. 917. P. 331-336.
33. Foulon C., Danes C., VaccherC., YourS, BonteJ.-P, Goossens J.-F. // J. Chromatogr. A. 2004. Vol. 1035. P. 131-136.
34. Kibbey C.E., Poole S.K., Robison B., Jackson J.D., Durham D. // J. Pharm. Sci. 2001. Vol. 90. P. 1164-1175.
35. Wan H, Holmen A., Nagard M., Lindberg W. // J. Chromatogr. A. 2002. Vol. 979. P. 369-377.
36. Grispony G., Casu M., Nurchi V.M., Cesare-Mirincola F., Pivetta T., SilvagniR. // Talanta. 2002. Vol. 56. P. 441-449.
37. Rabenstein D.L., Hari S.P., KaernerA. // Anal. Chem. 1997. Vol. 69. P. 4310-4316.
38. Gomez-Zaleta B., Ramrez-Sllva M. T, Gutierrez A, Gonzalez-Ver-gara E., Guizado-Rodriguez M, Rojas-Hemandez A. // Spec-trochimica Acta, A. 2006. Vol. 64. P. 1002-1009.
39. Luptak A., Ferre-D'Amare A.R., Zhou K., Zllm K.W., Doudna J.A. // J. Am. Chem. Soc. 2001. Vol. 123. N. 35. P. 8447-8452.
40. Guggenheim E. A. // J. Phys. Chem. 1930. Vol. 34. P. 1758-1766.
41. Buck R.P., Rondinini S., Covington A.K., Baucke F.G.K., Brett C.M.A., Camxes M.F., Milton M.J.T., Mussini T, Naumann R., Pratt K. W,, Spitzer P., Wilson G.S. // Pure Appl. Chem. 2002. Vol. 74. N. 11. P. 2169-2200.
42. Mussini T, Covington A.K., Longhi P., Rondinini S. // Pure Appl. Chem. 1985. Vol. 57. P. 865-876.
43. Pa/aiiktt D., Block J. // Anal. Chem. 1980. Vol. 52. N. 4. P. 624-630.
44. GluckS.J., Cleve/and J.A. //J. Chromatogr. A. 1994. Vol. 680. P. 43-48.
45. Mock W.L., TsayJ.T. // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263. N. 18. P. 8635-8641.
46. Foulon C., Duhal N., Lacrox-Callens B., Vaccher C., Bontea J.P., Goossens J.F. // Eur. J. Pharm. Sc-. 2007. Vol. 31. P. 165-171.
47. Barbosa J., Barron D, JimenezLozano, Sanz-Nebot V. // Anal. Chim. Acta. 2001. Vol. 437. P. 309-321.
48. Benet L.Z., Goyan J.E. // J. Pharm. Sci. 1967. Vol. 56. P. 665-680.
49. Бейтс P. Определение рН. Л.: Химия, 1972. 400 с.
50. AndrasiМ, Buglyo P., ZekanyL., GasparA. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2007. Vol. 44. P. 1040-1047.
51. QiangZ,, Adams C // Water Res. 2004. Vol. 38. P. 2874-2890.
52. Perrin D.D. //Austr. J. Chem. 1963. Vol. 16. N. 4. P. 572-578.
53. Никольский Б.Н., Пальчевский В.В. Спектрофотометрическое определение констант протолитических равновесий. в кн. Спектроскопические методы в химии комплексных соединений. / Под ред. В.М. Вдовенко. М.: Химия. 1964. С. 74-101.
54. Гаммет Л. Основы физической органической химии. М.: Мир. 1972. 535 c.
55. Берштейн И.Я., Каминский Ю.Л. Спектрофотометрический анализ в органической химии. Л.: Химия. 1986. 200 с.
56. Meloun М, Havel J. Computation of solution equilibria. 1. Spectrophotometry. 1984. P. 184.
57. Shamsipur M, Maddam B, Hemmateenejad B., Rouhani S, Haghbeen K., Alzadeh K. // Spectrochimica Acta Part A. 2008. Vol. 70. P. 1-6.
58. Takacs-Novak K., Tam K. Y. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2000. Vol. 21. P. 1171-1182.
59. Mitchell R.C., Satter C.J., Tam K.Y. // J. Pharm. Biomed. Anal. 1999. Vol. 20. P. 289-295.
60. Сафонова Л.П., КолкерА.М. // Усп. Хим. 1992. Т. 61. N. 9. C. 1748-1775.
61. Альберт А., Сержент Е. Константы ионизации кислот и оснований. М.: Химия. 1964. 182 с.
62. Liu T., Ryan М, Dahlquist F.W., Grffth О. // Protein Science. 1997. Vol. 6. N. 9. P. 1937-1944.
63. SzakacsZ., Häge/e G. // Talanta. 2004. Vol. 62. P. 819-825.
