ОЦЕНКА ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ФОТОЭМИССИОНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ PКА ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 535.33

Введение

Последнее время характеризуется широкомасштабными исследованиями в области фармакологии и прикладной биохимии, для которых необходимы методы экспресс определения значений физико-химических параметров изучаемых биоактивных соединений. Численное значение рКа существенно для оценки транспортных свойств изучаемых веществ и их метаболитов для развития высокоэффективного биоскрининга [1-5].

Наряду с быстрым развитием расчетных методов предсказания рКа в водных растворах активно развиваются экспресс-методы основанные на применении ВЭЖХ, капиллярного электрофореза, 13С- и 15Ы-ЯМР и спектрофотометри-ческого титрования [6-10].

Постановка задачи

Учитывая возможности спектрофото-метрического метода, позволяющие количественно интерпретировать сложные системы равновесий, ранее нами был предложен фотоэмиссионный метод (ФЭМ), также основанный на анализе спектров поглощения, но с принципиально иным способом их регистрации [11].

Первоначально метод разрабатывался для регистрации спектров излучения, но в силу технической невозможности полного исключения обратного фототока с анода и неизбежных искажений, вносимых в вольтамперную характеристику разбросом фотоэлектронов по энергиям, задача восстановления спектров излучения, падающего на фотоэлемент не была решена с достаточной для практического применения точностью.

В основе методики применения фотоэмиссионной спектроскопии для определения рКа лежит изучение характера изменения интегральных спектров излучения, прошедшего через раствор изучаемого вещества в зависимости от рН водных растворов соединений.

Ю. Э. Зевацкий1, Д. В. Самойлов2, Д.О. Рузанов3

ОЦЕНКА ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ

ФОТОЭМИССИОНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ pКа ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

ЗАО «Новбытхим»

199026, С.-Петербург, В.О. Косая линия, д.15«б»

На примере разнообразных органических кислот была проверена воспроизводимость значений рКа получаемых фотоэмиссионным методом и определены несколько значений рКа для кислот, которые проблематично получить традиционными методами. Предложенный метод позволяет достаточно достоверно определять рКа для плохо разрешенных спектров прототропных форм и при неизвестной концентрации вещества. Показано, что фотоэмиссионный метод является пригодным для определения значений констант ионизации многоосновных органических кислот

Ключевые слова: фотоэмиссионный метод, спектроскопия, константа кислотности, многоосновные кислоты.

В дальнейшем обсуждении для краткости изложения вместо точного выражения типа «вольтамперная характеристика запирания фототока вакуумного фотоэлемента, облучаемого светом от лампы накаливания, прошедшим через стеклянную кювету с раствором изучаемого вещества с определенным значением рН» будет использовано более компактное выражение типа «ВАХ изучаемого вещества при определенном рН».

Раннее, на примере трех нитропроизвод-ных фенола нами установлено [11], что указанные ВАХ имеют характеристическую точку - пересечение с осью абсцисс (1Ф = 0). Зависимость значения запирающего напряжения в этой точке (и0) от рН имела характерный вид, подобный представленному на рисунке 1 для бромкрезоло-вого пурпурного. Как видно, кривая зависимости запирающего напряжения, при котором суммарный фототок (катодный вместе с анодным) равен нулю (и0) от рН имеет скачок, соответствующий положению на шкале рН максимума первой производной по рН (см. рисунок 2.) Для нитрофено-лов значение рН, соответствующее данному максимуму согласовывалось с литературными значениями рКа с погрешностью менее 6%

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5

РН

Рис. 1. График зависимости Uo бромкрезолового пурпурного от рН среды

1 Зевацкий Юрий Эдуардович, канд. хим. наук, заведующий научно-исследовательской лабораторией, e-mail: [email protected]

2 Самойлов Денис Владимирович, канд. хим. наук, ст. науч. сотр. научно-исследовательской лаборатории e-mail: [email protected]

3 Рузанов Даниил Олегович, канд. хим. наук, инженер-технолог, e-mail: [email protected]

Дата поступления - 20 октября 2010 года

2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0

рн

Рис. 2. Дифференциальная зависимость с1ио/с1рИ от рН водного раствора бромкрезолового пурпурного (рКа эксп = 6.25)

Цель настоящего исследования - оценка границ применимости методики определения значений рКа по вольтамперным характеристикам запирания фототока в ряду разнообразных по типу и количеству центров протонирования органических соединений. Анализ результатов для возможно более широкого ряда позволит установить, носит ли указанная зависимость общий характер или характерна для соединений определенных групп.

В качестве объектов для проверки достоверности определения рКа по ФЭМ использованы растворы: 1-нафтола, 2-нафтола, 2,4-динитрофенола, фенолфталеина, бромкрезолового пурпурного, бромфенолового синего, метилового оранжевого, пикриновой кислоты, тимолфталеина, азолитмина, флуоресцеина, 4,5-дибромфлуоресцеина,

сульфофлуоресцеина, ализаринового желтого, литературные значения рКа для которых приведены в таблице , а также 4,5-динитрофлуоресцеина, 2,4,5,7-тетранитрофлуоресцеина для которых достоверные значения рКа известны только в 50% этаноле. Для оценки возможностей метода также были выбраны некоторые соединения, для которых данные по рКа отсутствуют в литературе: хромовый темно-синий, бриллиантовый желтый.

Таблица. Значения рКа, полученные фотоэмиссион-

ным методом и литературные данные

Соединение рКа ЛИТ. а РКЭ эксп. 8, %

2,4-динитрофенол 3.92 [13] 3.9 0.5

1-нафтол 9.37 [13] 9.5 1.4

2-нафтол 9.57 [13] 9.5; 9.2в 0.7; 3.8

Фенолфталеин 9.30 [13] 9.3 0.0

Бромкрезоловый пурпурный 6.30 [14] 6.3 0.0

Метиловый оранжевый 3.46 [14] 3.3 3.3

Пикриновая кислота 0.72 [13] 0.9 24.2

Бромфеноловый синий 3.75 [14] 3.7 1.1

Тимолфталеин 9.7 [14] 9.7 0.3

Азолитмин 6.4 [15] 5.8 9.1

Хромовый темно-синий — 5.4 —

Ализариновый желтый 11.1 [15] 11.0 0.1

Бриллиантовый желтый — 6.7 —

Флуоресцеин 4.45; 6.80 [16] 4.2; — 5.6;—

2,4,6,7-тетранитрофлуоресцеин б 2.02; 2.06 [17] 2.0 0.1

4,5-динитрофлуоресцеинб 5.0; 5.36 [17] 4.7; — 6; 11

4,5-дибромфлуоресцеин 4.24; 5.00 [16] 4.1; 5.4 4.5; 8.0

Сульфофлуоресцеин 3.21; 6.76 [16] 3.4; 6.7 5.9; 0.03

Соединение рКа лит. а рКа эксп. 8, %

Фенол 9.99 [13] 9.1 в 8.9

4-метиланилин 5.08 [13] 4.8 в 5.5

а - если указаны несколько значений, то они соответствуют разным ступеням диссоциации, б - приведено литературное значение рКа. в 50% водном этаноле, в - значение получено при использовании источника УФ-излучения

Объекты для проверки достоверности значений рКа были выбраны так, чтобы они имели хорошую разрешенность спектров прототропных форм, положение максимумов поглощения которых ограничено «красной границей» фотоэффекта для калия (500 нм) и границей пропускания стеклянной кюветы (300 нм).

Экспериментальная часть

Установка для регистрации ВАХ запирания фототока вакуумного фотоэлемента оригинальной конструкции с калиевым фотокатодом описана ранее [11]. Время регистрации одной ВАХ составляло около 2 минут. Для облучения использовался источник света от спектрофотометра СФ-26 с лампами 0П-33-0.3 для работы в видимой области спектра и ДДС-30 - для ультрафиолетовой.

Спектры поглощения растворов индикаторов регистрировались в стеклянной кювете типа КФК (>=2 см) на спектрофотометре СФ-56. Концентрации индикаторов растворах составляли 0.2-5 -10-4 моль/л. Требуемые значения рН в водном растворе создавались добавлением к буферному раствору, содержащему изучаемое соединение (со значением рН близким к значению рКа изучаемого вещества) концентрированных растворов хлорной кислоты (60% масс) или раствора гидроксида натрия (50% масс.) по аналогии с работой [12]. Концентрированные растворы титрантов использованы, чтобы свести разбавление к минимуму и условно считать концентрацию изучаемого вещества постоянной. Рабочие значения рН контролировались цифровым ио-номером И-500.

Обсуждение результатов

На рисунке 1. на примере бромкрезолового пурпурного показана характерная для большинства одноосновных органических кислот в изученном ряду тенденция изменения и0 в зависимости от рН. В ходе работы установлено, что для всех изученных в настоящей работе одноосновных кислот кривая имеет сходный вид, но зависимость и0 от рН является восходящей для рКа ниже примерно 5,8 или восходящей для рКа выше 5, что также может являеть-ся индивидуальной характеристикой для каждого вещества.

Результаты определения рКа ряда органических кислот различных типов фотоэмиссионным методом в приведены в таблице в сравнении с литературными значениями.

Положение скачка (максимума первой производной по рН) на вышеуказанной кривой зависимости и0 от рН отличается от экспериментальных значений рК, незначительно. Относительное расхождение составляет не более 10%, за исключением пикриновой кислоты.

Достаточно большое расхождение в значении рКа экспериментального пикриновой кислоты с литературным может быть вызвано тем, что задаваемое рН для пикриновой кислоты находится близко или за рабочей границей стеклянного электрода (112 ед. рН) и следовательно для предложенного метода свойственного ограничение на значения измеряемых рКа, присущее и другим методам.

Характер изменения самих ВАХ изучаемых веществ от рН для 3 изученных веществ имел вид либо представленный на рисунке 3, где все ВАХ пересекаются в одной точке, а для 11 соединений - вид представленный на рисунке 4, где ВАХ пересекаются произвольным образом. В некоторых случаях вид ВАХ очень незначительно изменяется в зависимости от рН, например для азолитмина (см. рисунок 5), что однако не стало препятствием для определения значения р/^ этого вещества.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 Напряжение, В

Рис. 3. Характер изменения ВАХ от рН для пикриновой кислоты. Числа на графике соответствуют значениям рИ

150

Чг - 9.13

^8.20

7.06 Л 3.21 Ь.20 / 4.68

\

\ 1.85 5.9"

1 1

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 Напряжение, В Рис. 4. Характер изменения ВАХ от рН для бромкрезолового пурпурного. Числа на графике соответствуют значениям рИ

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Напряжение, В

Рис. 5. Характер изменения ВАХ от рН для азолитмина.

Хотя в предыдущей работе [11] было теоретически обосновано наличие максимума первой производной по рН для зависимости и0 от рН, это усло-

вие может не выполняться в том случае, если изменение вида спектра поглощения в зависимости от рН происходит таким образом, что интеграл спектра остается практически неизменным. Этот случай и отражает серия ВАХ, представленная на рисунке 5.

Значение и0 для исследуемых соединений находится в зависимости, приведенной, от вида его спектра поглощения при одних и тех же рН в случае, когда спектр разрешен в области от 300 до 500 нм и можно сопоставить полученные ВАХ с ЭСП вещества.

Поскольку в предложенном методе количественные параметры спектров поглощения не является необходимыми, то концентрация образца может быть точно не известна, но не должна быть слишком высокой, чтобы максимумы в электронных спектрах лежали бы ниже 2 лог.ед. по оптический плотности.

Для выявления влияния концентрации органических кислот и ионной силы на величину получаемых фотоэмиссионным методом значений рКа была проведена серия измерений для фенолфталеина (выбор сделан на основании хорошей воспроизводимости результатов рКа) с концентрацией 10" 3,10"4,10"5 М, во всех растворах ионная сила не превышала 0.5 М.

Полученные зависимости и0 от рН для растворов фенолфталеина приведены на рисунке 6. При дифференцировании любой из этих кривых получается значение рКа близкое к литературному - 9.3. Отсюда видно, что для настоящего метода измеряемое значение рКа практически не зависит от концентрации исследуемого вещества в пределах 10"3-10"4 моль/л. Этот факт подтверждает адекватность применения титрования концентрированными растворами для создания заданных величин рН в растворе, вместо приготовления серии растворов с постоянной концентрацией красителя, заданным рН и постоянной ионной силой.

Рис. 6. Зависимость ио от рН для фенолфталеина при различных концентрациях

Электронный спектр поглощения многих индикаторов в аналитических концентрациях (10"4М) в максимумах имеет слишком высокое для корректного измерения значение оптической плотности (й>3). Однако для большинства изученных веществ регистрация ВАХ проводилась и при более высоких концентрациях и оптических плотностях соответственно. Следовательно, фотоэмиссионным методом в указанных условиях возможно получить значения рКа, тогда как для спектрофотометрического метода получение корректного значения крайне затруднительно.

Для многих известных индикаторов, таких как фенолфталеин, бромкрезоловый пурпурный, метиловый оранжевый, тимолфталеин в литературе при-

водится только одно значение рКа в рабочей области рН индикатора, тогда как по сути они являются двухосновными кислотами.

Это связано, прежде всего с тем, что изменение спектра поглощения при изменении рН происходит вне видимой области спектра или является очень незначительным, а с другой стороны объясняется близостью значений рКа первой и второй ступени ионизации для таких соединений. Такие случаи представляют существенную проблему для спек-трофотометрического метода [13-15], и поэтому только в немногих работах [16, 17] этому факту уделено достаточное внимание.

В рамках фотоэмиссионного метода было важно узнать, насколько информативны будут ВАХ для таких соединений, и возможно ли определить для них более одного значения рКа. Обработка ВАХ сульфофлуоресцеина, и 4,5-дибромфлуоресцеина дает два четкие перегиба на кривой зависимости и0 от рН, дифференцируя которую получаем два экстремума (рисунки 7, 8), то есть характер кривой и0-рН в данном случае позволяет наблюдать две ступеней диссоциации. При этом для близкого по структуре к предыдущим соединениям Флуоресцеи-на наблюдается только одна ступень диссоциации.

0.90 0.880.86 0.84 0.82-

Ш 08° 0.78

0.760.740.72 0.70-

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5

Рис. 7. График зависимости и0-рН (а) для 4,5-дибромфлуоресцеина и ее производной по рН (б)

б)

Рис. 8. График зависимости ио-рН сульфофлуоресцеина (а) и ее производной по рН (б)

Нами также была предпринята попытка расширения области применения фотоэмиссионного метода для определения рКа бесцветных веществ. Для этого был использован ультрафиолетовый источник света (дейтериевая лампа ДДС-30) и стандартная кварцевая кювета толщиной 1 см. Для 2-нафтола была получена характерная серия ВАХ, сходная по виду с представленной на рисунке 4, которая обрабатывалась тем же способом, что и для окрашенных веществ. В результате получены типичные зависимости и0 - рН (рисунок 9) и Ш0^рН -рН (рисунок 10) из которых получено значение рКа близкое к литературному. В процессе изменения рН среды электронный спектр поглощения в видимой области практически не менялся, а все изменения наблюдались только в ультрафиолетовой области спектра. Аналогичные результаты получены еще для двух бесцветных соединений - фенола и 4-метиланилина (см. рисунки 11 и 12). Из чего следует, что данным методом возможно определять значения рКа для бесцветных соединений с использованием источника УФ-излучения и применением кварцевой кюветы.

В случае отсутствия четко выраженного максимума на зависимости Ш0^рН от рН применялось аппроксимация исходной зависимости Ш0 от рН сигмовидной кривой и дифференцировалось полученная кривая. Пример применения аппроксимации для 4-метиланилина приведен на рисунке 12.

6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0

рН

Рис. 9 Зависимость Uo от pH среды 2-нафтола

0.06-,

-0.01 -|-.--.--.--,--,--.--.--1--.-1

7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5

рН

Рис. 10. Дифференциальная зависимость dUo/dpH от рН водного раствора 2-нафтола (рКаэксп = 9.2)

6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5

рн а)

6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5

б)

Рис. 11. График зависимости Uo-рН фенола (а) и ее производной по рН (б). рКалит = 9.99

0.62

0.52-|-,--■--,--■--,--■--,--■--,-1

2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0

рн а)

0.045

-0.005 -

2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0

б)

Рис. 12. График зависимости Uo-рН 4-метиланилина (а) и ее производной по рН (б). рКалит = 5.08.

Линией без символов показаны аппроксимированные кривые.

Заключение

На данном этапе можно отметить, что значения рКа, получаемые фотоэмиссионным методом соответствуют литературным значениям с хорошей точностью. Основными преимуществами ФЭМ является практически отсутствие влияния концентрации на получаемое значение pKa, возможность работы с соединениями, у которых электронные спектры неразрешимы или их невозможно корректно зарегистрировать при выбранной концентрации. Также показано, что данным методом возможно определять значения рКа для бесцветных или слабо окрашенных соединений при использовании источника света, изучающего в УФ области.

Литература

1. Avdeef B., Testa G. Physicochemical profiling in drug research: a brief survey of the state-of-the-art of experimental techniques. // Cell. Mol. Life Sci. 2002. Vol. 59. N. 19. P. 1681-1689.

2. Babic S.A., Horvat J.M., Mutavdzic-Pavlovic D., Kastelan-Macan M. Determination of pKa values of active pharmaceutical ingredients. // Trends Anal. Chem. 2007. Vol. 26. N. 12. P. 1043-1061.

3. Tehan B.G., Lloyd E.J., Wong M.G., Pitt W.R., Manallack D.T., Gancia E. Estimation of pKa Using Semiempirical Molecular Orbital Methods. Part 2: Application to Amines, Anilines and Various Nitrogen Containing Heterocyclic Compounds. // Quant. Struct.-Act. Relat. 2002. Vol. 21. N. 5. P. 473-485.

4. Box K., Bevan C, Comer J., Hill A., Allen R., Reynolds D. High-Throughput Measurement of pKa Values in a Mixed-Buffer Linear pH Gradient System. // Anal. Chem. 2003. Vol. 75. N. 4. P. 883-892.

5. Erdemgil F.Z., Sanli S., Sanli N., Oezkan G., Barbosa J., Guiteras J., Beltran J.L. Determination of pKa values of some hydroxylated benzoic acids in

methanol-water binary mixtures by LC methodology and potentiometry. // Talanta 2007. Vol. 72. N. 2. P. 489-496.

6. Cemil O., Hakan D., Halil B., Fadime F.T. Spectroscopic Determination of Acid Dissociation Constants of Some Pyridyl Shiff Bases. // J. Chem. Eng. Data. 2006. Vol. 61. N. 1. P. 46-50.

7. Shamsipur M., Maddah B., Hemmateenejad B., Rouhani S., Haghbeen K., Alizadeh K. Multiwavelength spectrophotometry determination of acidity constants of some azo dyes. // Specrochim. Acta., A. 2008. Vol. 70A. N. 1. P. 1-6.

8. Takacs-Novak K., Tam K.Y. Multiwavelength Spectrophotometric Determination of Acid Dissociation Constants: A Validation Study. // Anal. Chim. Acta. 2001. Vol. 434. N. 1. P. 157-167.

9. Derya K., Mahir A. Determination of acidity constants of acid-base indicators by second-derivative spectrophotometry. // Specrochim. Acta., A. 2000. Vol. 56. N. 14. P. 2753-2761.

10. Chiou S.T., Block J.H. / Partition Coefficient. Determination and Estimation. New York: Pergarnon. 1986. 320 p.

11. Зевацкий Ю.Э., Самойлов Д.В. Фотоэмиссионный метод измерения спектров для спектрофо-тометрического определения констант ионизации. // Известия СПбГТИ(ТУ). 2009. N. 6(32). C. 44-49.

12. Kong X., Zhou T., Liu Z., Hider R.C. pH indicator titration: a novel fast pKa determination method. // J. Pharm. Sci. 2007. Vol. 96. N. 10. P. 27772783.

[13] Castro G.T., Ferretti F.H., Blanco S.E. Determination of the overlapping pKa values of chrysin using UV-vis spectroscopy and ab initio methods. // Specrochim. Acta., A. 2005. Vol. 62. N. 1-3. P. 657-665.

14. Meloun M., Syrovy T., Bordovska S., Vrana A. Reliability and uncertainty in the estimation of pKa by least squares nonlinear regression analysis of multiwavelength spectrophotometry pH titration data. // Anal. Bioanal. Chem. 2007. Vol. 387. N. 3. P. 941955.

15. Mitchell R.C., Salter C.J., Tam K.Y. Multiwavelength spectrophotometry determination of acid dissociation constants Part III. Resolution of multiprotic ionization systems. // J. Pharm. Biomed. Anal. 1999. Vol. 20. N. 1-2. P. 289-295.

16. Мчедлов-Петросян Н.О. Кислотные свойства и строение фталеиновых индикаторов в растворах. // ЖАХ 1986. Т. 41. N. 10. C. 1771-1779.

17. Мчедлов-Петросян Н.О., Романенко А.В., Никишина Л.Е. Кислотно-основные равновесия в водных растворах фенолфталеина. // ЖАХ 1984. Т. 39. N. 8. C. 1395-1403.