CC BY
32СОВРЕМЕННАЯ ЦИТОМОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ОПУХОЛЕЙ ЛЕГКИХ
М.В. САВОСТИКОВА, Е.Ю. ФУРМИНСКАЯ, Е.С. ФЕДОСЕЕВА
Лаборатория клинической цитологии, ФГБУ «РОНЦим. Н.Н. Блохина» М3 РФ4
Ключевые слова: цитологическая диагностика, опухоли легкого, иммуноцитохимический метод.
Введение
Рак легкого (РЛ) — наиболее частое онкологическое заболевание и наиболее частая причина онкологической смертности в мире. В 2012 г. в России выявлено 55 475 новых случаев этого заболевания. За последние 5 лет абсолютное число заболевших мужчин снизилось на 4,4%, женщин — увеличилось на 3,8%. Доля РЛ в структуре онкологической заболеваемости мужского населения варьировала от 10,5% до 17-26%; у женщин 2,5-5,2% [3].
Цитологическое исследование является первичным звеном в морфологической диагностике опухолей легких. Метод обладает рядом преимуществ в виде малой инвазивности, сравнительной дешевизны и быстроты исполнения. Карциномы легкого цитологически выявляются в 83% наблюдений: при локализации опухоли в прикорневой зоне — у 62% пациентов, в средней — у 79% и плащевой — у 88% больных. При диаметре новообразования до 3 см (Т1) результативность метода составляет около 70%, более 3 см (Т2-ТЗ) — 85-90%. По данным литературы цитологическое исследование материала, полученного при тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ) позволяет определить гистологическую форму в 65% исследований и в 40% установить степень ее диф-ференцировки. [1, 5, 6, 11]. При проведении ТАБ такие осложнения как гемоторакс, гидроторакс и имплантационное метастазирование крайне редки [4].
Распределение больных в зависимости от формы заболевания легких (в том числе доброкачественные и инфекционные) следующее: эпителиальные злокачественные опухоли составляют 27,9%, метастатические опухоли — 0,9%, саркомы 0,5% [7]. Из злокачественных новообразований легких 99% составляют карциномы, в большинс-
тве своем представленные аденокарциномой (АК), плоскоклеточным раком (ПКР), мелкоклеточным раком (МКР) и крупноклеточным раком (ККР).Типический карциноид и атипический карциноид составляют небольшую долю опухолей легких. Некоторые варианты немелкоклеточ-ного РЛ (как правило, АК) могут иметь нейроэн-докринную дифференцировку, выявляемую при иммуногистохимии. Ввиду особенностей клинического течения и лечения РЛ подразделяют на две категории — мелкоклеточный и немелкок-леточный. Аденокарцинома — самый частый вариант РЛ в мире у женщин, а в некоторых странах — и у мужчин (США, Канада, Китай, Япония). Плоскоклеточный рак — самая распространенная форма РЛ у курящих пациентов. Мелкоклеточный рак легкого встречается примерно в 20% карцином, его возникновение тесно связано с курением. Крупноклеточный РЛ составляет около 9% всех карцином легкого (часто его относят в категорию «низкодифференцированный рак»), чаще обнаруживается у курящих мужчин, локализуется в периферических отделах бронхиального дерева. Крупноклеточный нейроэндокрин-ный рак (подтип ККР) встречается примерно в 3% случаев карцином легкого[18].
Учитывая тот факт, что цитологический метод является первичным морфологическим диагностическим исследованием, результаты его во многом определяют дальнейшую лечебную тактику. Однако возникают трудности диагностики при идентификации низкодифференциро-ванных карцином, анапластических, диморфных раков, метастатических новообразований. В связи с чем возникает необходимость в применении новых, дополнительных, уточняющих методов, таких как иммуноцитохимическое исследование (ИЦХ) [2]. В этом контексте ИЦХ является одним из методов, который позволяет различить эти типы опухолей и на дооперационном этапе уточнить гистогенез, диагностировать первично-множественные поражения, степень распространения и оценить некоторые показатели прогноза
и чувствительность опухоли к химиогормоно-терапии [1]. Значимыми маркерами для первичной диагностики опухолей легких являются: СК7, СК20, тиреоидный фактор транскрипции TTF 1, хромогранин А, синаптофизин, CD 56; белки сур-фактанта; р63, СК5/6.[9, 15, 16, 17]. По данным литературы уровень экспрессии TTF1 в АК легкого колеблется от 73-92% [8, 10, 12, 13, 15]. Данный антиген не является непосредственной мишенью для таргетной терапии, но может являться предсказательным фактором-маркером чувствительности при выборе терапии пеметрекседом. MaoxinWu, Beverly Wangandal (2003) в своей работе на небольшом материале изучили и показали целесообразность использования ИЦХ маркеров р63 и TTF-1 для дифференциальной диагностики низкодифференцированного ПКР и МКР легкого. Авторы отмечают, что ядерное TTF-1 окрашивание было положительным и чаще выраженным у 20 (87%) из 23 наблюдений МРЛ (14/17 гистологических срезов, 6/6 цитоблоков). В своей работе они подтверждают, что TTF-1 является фактором, определяющим дифференциацию клеток легких, щитовидной железы. Его экспрессия выявляется в 81% — 100% наблюдений МКР, и только редкие случаи ПКР показывают положительное окрашивание антигена TTF-1 — всего 7-9%[14]. Помимо TTF-1 экспрессии, МКР подтверждается положительной реакцией на синаптофизин (сильной, диффузной), хромогранина А (фокусно) и NSE (фокусно, слабо). Белок рбЗ играет важную роль в поддержании целостности и дифференциации плоского эпителия, поддерживая баланс между базалоидными и недифференцированными стволовыми клетками. В работе показано, что чувствительность и специфичность иммуногисто-химического определения белка р63 в качестве маркера для выявления ПКР легкого составили 100%, положительная и отрицательная прогностическая ценность и общая точность теста (правильной классификации) также 100%. TTF-1 и р63, являясь ядерными белками, позволяют избежать проблем, связанных с обнаружением цитоп-лазматических антигенов в опухолевых клетках со скудной цитоплазмой. Использование СК7 и СК20 дает возможность установить, является ли опухоль легкого первичной АК (СК7+ и СК20-), АК со слизеобразованием (СК7+ и СК20+) или метастазом опухоли желудочно-кишечного тракта (СК7- и СК20+). [14, 15, 17].
Цель исследования:
Оценить возможности иммуноцитохимичес-кого метода в цитологической диагностике пер-
вичных и метастатических образований легкого с использованием жидкостной технологии Cytospin.
Материалы и методы:
В лаборатории клинической цитологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» М3 РФ в 2014-2015 гг. выполнено 955 ИЦХ исследований на материале от 291 пациента с различной онкопатологией. Из них для уточнения гистологической формы новообразования легкого (первичного или метастатического) проведено 440 ИЦХ исследований 118 пациентам (77 мужчин и 41 женщина). Средний возраст пациентов составил 63,6 года (23-84 г.). Большинство пациентов имело клинический диагноз: «Рак легкого», в трети случаев врач не исключал и вторичное поражение легкого метастазом другой опухоли.
Цитологический материал был получен при трансторакальной пункции от 105 пациентов (89%), при бронхоскопическом исследовании — 7 (5,9%), при аспирации содержимого бронхов — 4 (3,4%). В одном исследовании проводился ИЦХ анализ мокроты (0,85%) и,также в 1 — отпечаток кусочка образования главного бронха (0,85%).
ИЦХ исследования проводились на иммуно-гистостейнере Вентана (BenchMark ULTRA). Для ИЦХ анализа применяли МКАТ фирмы ДАКО: к общим цитокератинам (клон MNF116, разведение 1:50-1:100), цитокератину 20 (клон KS20.8, разведение 1:25-1:50), цитокератину 5/6 (клон D5/16 В4, разведение 1:50), TTF-1 (клон 8G7G3/1, разведение 1:200), хромогранину А (клон DAK-A3, разведение 1:100-1:200), синаптофизину (клон SY38, разведение 1:10-1:20), Cdx2 (клон DAKCdx2, 1:50), RCC (клон SPM3/4, разведение 1:50), MelanA (клон А103, разведение 1:25), НМВ 45 (клон НМВ45, разведение 1:50), ER а (клон 1D5, разведение 1:60), PR (клон RgR 636, разведение 1:50), Thyroglobulin (клон DAK-Tg6, разведение 1:100), СА125 (клон МН, разведение 1:20), CD45 (клон 2В11+РР7/26), белок S100 (поликло-нальные кроличьи антитела Anti-5100, разведение 1:400), Vimentin (клон V9, разведение 1:100); моноклональные кроличьи антитела CellMarque: к CD56 (MRQ-42, разведение 1:250), цитокерати-ну7 (OV-TL 12/30, разведение 1:400). Цитопре-параты докрашивали гематоксилином Майера и заключали в бальзам. Реакции проводились на цитологических монослойных мазках, полученных при накоплении пунктатов в специальной питательной среде с последующим центрифугированием на системе Cytospin 3 в режиме 1000 g/ мин. в течение 5 минут (Cytospin — технология).
С учетом формулировок цитологических заключений материал был распределен на несколько групп:
• уверено поставленный диагноз первичной А К легкого,
• предположительное заключение об АК,
• низкодифференцированный рак, возможно немелкоклеточный,
• дифференциальная диагностика первичной- АК легкого и метастаза,
• злокачественная опухоль неэпителиальной природы (табл. 1).
Из 118 пациентов 55 был поставлен уверенный цитологический диагноз АК, подтвержденный ИЦХ в 94,5% наблюдений положительной экспрессией СК7 и ТТР1 (стр. 40, рис. 1, 2, 3). В 50% исследований первичных АК отмечалась выраженная экспрессия СК20, что характерно для слизеобразующих карцином.
В этой группе заключений в одном варианте АК показала ТТР-1 негативный фенотип и также в 1 — был выявлен метастаз (МТС) АК кишки, ИЦХ наблюдалась экспрессия Сёх2 и СК20 при СК7(-) и ТТР-1(-) (стр. 40, рис. 4, 5, табл. 1).
В 6 наблюдениях из 118 диагноз АК легкого был поставлен в предположительной форме. После проведения ИЦХ исследования: в
2 случаях подтвердилась АК (ТТР1+/СК7+), в 4 экспрессия ТТР1 отсутствовала (табл. 1).
В 31 наблюдении необходимо было исключить метастаз другой опухоли. После ИЦХ исследования в 13 наблюдениях верифицировали первичную АК легкого (ТТР1+/СК7+) (табл. 2). В 4 наблюдениях был выявлен метастаз АК кишки (Сах2+/СК20+/ ТТР1-/СК7-), в 4 — метастаз почечно-клеточного рака (ИСС+/ СК20-/ТТР1-/ СК7-), в 4 — метастаз уротелиаль-ной карциномы (СК20+/ТТР1-/СК7+) и 2 — метастаз рака молочной железы (ЕК+/СК20-/ТТР1-/ СК7+) (стр. 40, рис. 6, 7, 8, 9, стр. 41, рис. 10, 11).
Пятую часть исследований (п = 22)составили опухоли наиболее сложные для цитоморфологи-ческой верификации — низкодифференцирован-ные карциномы (табл. 3).
Из 22 наблюдений (18,6%) после ИЦХ исследования 15 оказались первичными АК легкого (ТТР1+/СК7+). Экспрессия нейроэндокринных маркеров синаптофизина, хромогранина А, СБ56 и ТТР1+ при отсутствии реакций с МКАТ к СК7-/ СК20- позволили в 4 наблюдениях утвердительно поставить диагноз МКР, в одном — ПКР (СК5/6+/ ТТР1-/СК7-/СК20-) (стр. 41, рис. 12, 13, 14, 15, 16).
Злокачественные опухоли неэпителиальной природы — самая малочисленная группа, всего 4 наблюдения, из которых в 2 метастазы мелапо-
Таблица 1
Варианты цитологических заключений
Типы цитологических заключений Число наблюдений Количество исследований, направленных на ИЦХ. ИЦХ заключения
Аденокарцинома (уверенно) 55 (46,6%) 52 — АК легкого (уверенно)
1 — АК легкого (предположительно)
1 — Метастаз АК кишечного типа
1 — ИЦХ неинформативно
Аденокарцинома (предположительно) 6 (5,08%) 4 — АК легкого (предположительно)
2 — АК легкого (уверенно)
Низкодифференцированный рак Немелкоклеточный рак? 22(18,6%) 15 — АК легкого
4 — Мелкоклеточный рак
1 — Плоскоклеточный рак
2 — ИЦХ неинформативно
Первичная аденокарцинома легкого или метастаз другой опухоли 31 (26,3%) 13 — АК легкого
4 — Метастаз почечно-клеточного рака
4 — Метастаз уротелиального рака
2 — Метастаз рака молочной железы
4 — ИЦХ неинформативно
Злокачественная опухоль неэпителиальной природы 4 (3,4%) 2 — Злокачественная опухоль неэпителиальной природы/ не требовалась детализация
2 — Метастаз меланомы
Неинформативный материал - 7 (5,9%)
Итого: 118 (100%) -
Таблица 3
Таблица 2
Типы цитологических заключений Число наблюдений Количество исследований, направленных на ИЦХ/ ИЦХ заключения
Первичная АК легкого? Метастазы в легкое? Первичномножественные опухоли? 31 (26,32%) 13 — АК легкого: (1 — ПММР-ПКР) (1— ПММР — рак тела матки)
4 — Метастаз АК кишки
4 — Метастаз почечно-клеточного рака
4 — Метастаз уротелиального рака
2 — Метастаз рака молочной железы
4 — ИЦХ неинформативно
Типы цитологических заключений Число наблюдений Количество исследований, направленных на ИЦХ/ ИЦХ заключения
Низкодифференцированный рак Немелкоклеточный рак? 22 (18,6%) 15 — АК легкого
4 — Мелкоклеточный рак
1 — Плоскоклеточный рак
2 — ИЦХ неинформатив- но/выражен воспалительный компонент, мало опухолевых клеток
мы, подтвержденные ИЦХ реакциями с маркерами к меланосомным антигенам НМВ45, Ме1апА и белку Б100. В 2 случаях требовалось подтвердить или исключить наличие рецидива опухоли легкого неэпителиальной природы (ЭМА-/общие ци-токератины-/виментин+) без дополнительных уточнений.
Неинформативный материал составил 5,9% и был обусловлен выраженными дистрофическими и дегенеративными изменениями клеток, полученных из очагов некроза, кистозными изменениями, малым количеством материала.
Особенно актуально использование ИЦХ исследований при множественных опухолевых поражениях, что ярко подтверждается следующим клиническим примером.
Клиническое наблюдение: пациент И., мужчина, 69 лет.
Из анамнеза: потерял сознание на улице, был госпитализирован в стационар одной из московских больниц. После проведенного обследования диагностированы:
• ацинарный рак предстательной железы (верифицирован гистологически),
• перстневидноклеточный рак желудка (верифицирован гистологически),
• солитарное периферическое образование в нижней доле правого легкого размерами около 1,5 см,
• множественные метастазы в головной мозг.
В лабораторию клинической цитологии РОНЦ
был доставлен материал, полученный при ТАБ образования нижней доли правого легкого.
Цитологическое исследование:
Цитограмма представлена небольшим количеством полиморфных эпителиоподобных и ве-ретеновидных клеток, в цитоплазме которых отмечалась «пылевидная запорошенность» пигментом, встречались двуядерные клетки (рис. 17). Аденокарцинома? Метастаз меланомы?
Было рекомендовано ИЦХ исследование: реакции с антителами к маркерам уже выявленных карцином предстательной железы и желудка, а также легкого: ЦК7, ЦК20, ПСА, ТТБ1, Сёх2 — были отрицательные. Однако опухолевыми клетками экспрессировались маркеры мела-номы НМВ45 и протеин Б100 (стр. 41, рис. 18, 19, стр. 42, рис. 20).
Было принято решение о повторной гастроскопии с биопсией. При цитологическом исследовании отпечатков с биоптата опухоли желудка клеточный состав имел те же морфологические «черты», что и опухоль в легком (стр. 42, рис. 21).
Принадлежность опухоли к меланоме была подтверждена ИЦХ реакциями. И, наконец, после тщательного осмотра пациента было выявлено пигментное образование кожи в правой подлопаточной области. В связи с полученными результатами гистологические препараты биопсии желудка были пересмотрены, дано заключение: «вероятнее всего, меланома» (стр. 42, рис. 22).
Иммуногистохимическое исследование подтвердило наличие эпителиоидноклеточной
пигментной меланомы (стр. 42, рис. 23, 24, 25, 26).
Окончательный диагноз: «Первично-множественное синхронное злокачественное заболевание: ацинарный рак предстательной железы, меланома кожи подлопаточной области слева с метастазами в легкое, желудок, головной мозг».
ВЫВОДЫ:
Чувствительность ИЦХ исследования в диагностике опухолей легких (первичных и метастатических) составила 95,6%.
При ИЦХ исследовании АК легкого экспрессия TTF-1 наблюдалась в 90,6%.
Определение данного маркера в категории предположительных заключений в 24% наблюдений позволило уверенно диагностировать первичную АК легкого.
Применение ИЦХ метода при низкодиффе-ренцированных карциномах и недифференцированных новообразованиях в 53% случаев позволило верифицировать первичную АК легкого и в 27% — определить наличие метастаза и его органную принадлежность.
При ИЦХ исследовании карцином с низкой дифференцировкой в 20% наблюдений верифицирован МКР легкого, в 80% — НМКР.
Проведение ИЦХ исследований необходимо при первично-множественных опухолевых заболеваниях.
Таким образом, использование иммуноцито-химических исследований в диагностике опухолей легких позволяет расширить возможности современных цитоморфологических методов: уточнить гистогенез новообразования на доопе-рационном этапе, диагностировать первично-множественные поражения, оценить степень распространения патологического процесса.
Литература
1. Волченко Н.Н., Савостикова М.В./Атлас цитологической и иммуноцитохимической диагностики опухолей-Москва: Репроцентр — 2010 г. — с. 158-162.
2. Волченко Н.Н., Савостикова М.В. «Возможности иммуноцитохимического исследования в онкологии».// «Новости клинической цитологии России»-2003 — т. 7 — № 1-2, с. 49-50.
3. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2012 г. — Москва, Издательская группа РОНЦ — 226 с.
4. Медиастинальная лимфоаденэктомия при немелкоклеточном раке легкого.// Трахтен-берг А.Х., Франк П.А., Волченко Н.Н., Стука-
лов М.А., Колбанов К.И. — Пособие для врачей — 2003.
5. Оценка эффективности цитологической диагностики злокачественных новообразований легких/ Филимонова Е.С., Тарасенко С.Л., Дыхно Ю.А., Хлебникова Ф.Б. Сибирское медицинское обозрение. 2014. №3 (87). С. 65-69.
6. Трансторакальная пункция как метод выбора для морфологической верификации новообразований средостения в амбулаторных условиях /Маринов Д.Т. Полоцкий Б.Е., Лактионов К.К., Юдин Д.И., Маргарян А.Г., Аллахвердиев А.К., Назлиев П.Б..// Вестник ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина, том 26, № 1 — С. 56.
7. Шапиро Н.А. //Цитологическая диагностика заболеваний легких// Цветной атлас, 2005. с. 8-33.
8. Bakir К, Ko^er NE, Deniz Н, Guldur ME. TTF-1 and surfactant-B as coadjuvants in the diagnosis of lung adenocarcinoma and pleural mesothelioma. Ann DiagnPathol 2004, 8: 337-41.
9. Comparison of thyroid transcription factor-1 expression by 2 monoclonal antibodies in pulmonary and nonpulmonary primary tumors. /Matoso A, Singh K, Jacob R, Greaves WO, Tavares R, Noble L, Resnick MB, Delellis RA, Wang LJ: Appl Immuno-histochem- MolMorphol2010, 18: 142-9
10. llhan Demirci, Susanne Herold, Andreas Kopp et al. Overdiagnosis of a typical carcinoid tumor as an adenocarcinoma of the lung: a case report and review of the literature / World Journal of Surgical Oncology 2012,10:19.
11. Do liquid-based preparations of pulmonary bronchial brushing specimens perform differently from classically prepared cases for the diagnosis of malignancies?: Observations from the college of American pathologists interlaboratory comparison program in nongynecologic cytology/Tabatabai Z.L., Auger M, Kurtycz D.F.I., Laucirica R, Sorters R.J., Nayar R Kh-albuss W.E., Moriarty A.T., Fraig М-Archives of Pathology and Laboratory Medicine — Volume 139, Issue 2,1 February 2015, Pages 178-183.
12. The value of thyroid transcription factor-1 in cytologic preparations as a marker for metastatic adenocarcinoma of lung origin / Hecht JL, Pinkus JL, Weinstein LJ, Pinkus GS.//American Journal of Clinical Pathology 2001, 116: 483-8.
13. The role of TTF-1 in differentiating primary and metastatic lung adenocarcinomas I Moldvay J, Jack-el M, Bogos K, Soltesz I, Agocs L, Kovacs G, Schaff Z. — Pathology and Oncology Research — 2004, 10:85-8.
14. P63 and TTF-1 Immunostaining / Maoxin Wu, MD, PhD; Beverly Wang, MD; Joan Gil, MD; Edmond Sabo, MD; Lorraine Miller, PhD; Li Gan, MD; David E. Burstein, MD. — American Journal of Clinical Pathology — 2003; 119(5).
15. Su YC, Hsu YC, Chai CY. Role of TTF-1, CK20, and CK7 immunohistochemistry for diagnosis of primary and secondary lung adenocarcinoma.// American Journal of the Medical Sciences — 2006, Jan. 22 (1): 14-9.
16. TTF1 expression in normal lung neuroendocrine cells and related tumors: immunohistochemical study comparing two different monoclonal antibodies. / La Rosa S, Chiaravalli AM, Placidi C, Papan-ikolaou N, Cerati M, Capella C. Virchows Archv — 2010, 457: 497-507.
17. Variable sensitivity and specificity of TTF-1 antibodies in lung metastatic adenocarcinoma of colorectal origin./ Comperat E, Zhang F, Perrotin C, Molina T, Magdeleinat P, Marmey B, Regnard JF, Audouin J, Camilleri-Broet S.- Modern Pathology — 2005, 18: 1371-6.
18. Y.S. Erozan, I. Ramzy, Pulmonary Cytopatholo-gy, Essentials in Cytopathology, 2nd ed. 2014 Edition, Springer.
