CC BY
2124
Ветеринарный врач. 2025. № 1. С. 124 - 131
The Veterinarian. 2025; № 1: 124 - 131
Научная статья
УДК 619:579
DOI: 10.33632/1998-698Х 2025 1 124
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И ТРЕБОВАНИЯ К НИМ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ ПРИ ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
Бирюкова Юлия Михайловна', [email protected]
Мельник Роман Николаевич', кандидат биологических наук, [email protected]
Мельник Николай Васильевич', доктор ветеринарных наук, [email protected]
Стариков Вячеслав Алексеевич', кандидат ветеринарных наук, [email protected]
Мингалеев Данил Наильевич^, доктор ветеринарных наук, [email protected]
Панкова Екатерина Витальевна^, кандидат биологических наук, katerinkaja@bk. ru
1
и
Всероссийский научно-исследовательский
технологический
институт
биологической
промышленности, г/о Лосино-Петровский, Московская область. Российская Федерация
Федеральное государственное бюджетное научное
учреждение
«Федеральный
центр
токсикологической, радиационной и биологической безопасности», Казань, Российская Федерация
2
Автор, ответственный за переписку: Роман Николаевич Мельник.
Аннотация. В статье отражены научные направления усовершенствования питательных сред для крупномасштабного культивирования противовирусных вакцин. Основными задачами приоритетных прикладных исследований, результаты которых широко используются в производстве, являются: создание новых вакцин, лечебных сывороток, диагностикумов, лекарственных препаратов, без создания высококачественных питательных сред для глубинного культивирования их рецептурных составов под тот или иной производственный штамм. Огромное значение при изготовлении противовирусных и бактерийных препаратов имеет качество питательных сред, которые способствуют в изготовлении вакцин нового поколения. Одной из важных предпосылок успешного применения технологии глубинного культивирования является разработка питательных сред, в составе которых играют важную роль заменимые и незаменимые аминокислоты, включая: лизин, гистидин, и т.д. Конструирование качественных питательных сред для крупномасштабного производства противовирусных вакцин против ящура и антирабических вакцин, представляется обоснованной и актуальной задачей. Для решения этих задач есть три пути усовершенствования питательных сред. Первый путь - добавление различных питательных добавок и стимуляторов роста (Macfarlane D.E., Elian-Jones Т.Е., 1980). Второй путь -связывают с поиском нового сырья, богатого белками для приготовления питательных основ, среди которых особое место отводится белковым гидролизатам (Трошкова Г.П. и др., 2006). В последнее время проводят исследования, связанные с возможностью использования белковых гидролизатов из нетрадиционного сырья: отходы мясной, молочной, рыбной и птицеперерабатывающей промышленности (Трошкова Г.П. и др., 2006). Третий путь - это разработка путей и методов повышения качества сырья, используемого для приготовления микробиологических питательных сред, направленных на увеличение в нём биологически активных компонентов. Сообщения о реальных результатах в этом направлении единичные (Панова Н.В., 2006).
Ключевые слова: питательная среда, культивирование, аминокислоты, вирусная суспензия, фильтрация, вода очищенная, вода для инъекций, глубинное культивирование
Для цитирования: Бирюкова Ю. М., Мельник Р. Н., Мельник Н. В., Стариков В. А., Мингалеев Д. Н., Панкова Е. В. Совершенствование питательных сред и требования к ним для получения противовирусных антигенов при глубинном культивировании // Ветеринарный врач. 2025. № 1. С. 124- 131. DOI: 10.33632/1998-698Х 2025 1 124
IMPROVEMENT ОЕ NUTRIENT MEDIA AND THEIR REQUIREMENTS EOR OBTAINING ANTIVIRAU ANTIGENS DURING DEEP CUUTIVATION
Yulia М. Biryukov', [email protected]
125
Roman N. Melnik', candidate of biological sciences, [email protected]
Nikolai V. Melnik', doctor of veterinary sciences, [email protected]
Vyacheslav A. Starikov', candidate of veterinary sciences, [email protected]
Danil N.Mingaleev^, doctor of veterinary sciences, [email protected]
Ekaterina V. Pankova^, candidate of biological sciences, [email protected]
1
All-Russian Scientific Research and Technological Institute of the Biological Industry, Losino-Petrovsky,
Moscow Region, Russian Federation
2
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological safety, Kazan, Russian Federation
Corresponding author: Roman Nikovaevich Melnik.
Abstract. The article reflects the scientific directions of improving nutrient media for large-scale cultivation of antiviral vaccines. The main objectives of priority applied research, the results of which are widely used in production, are: the creation of new vaccines, therapeutic serums, diagnostics, medicines, without creating high-quality nutrient media for deep cultivation of their prescription formulations for a particular production strain. The quality of nutrient media, which contribute to the manufacture of new generation vaccines, is of great importance in the manufacture of antiviral and bacterial preparations. One of the important prerequisites for the successful application of deep cultivation technology is the development of nutrient media in which essential and irreplaceable amino acids play an important role, including: lysine, histidine, etc. Designing high-quality nutrient media for the large-scale production of antiviral vaccines against foot-and-mouth disease and rabies vaccines seems to be a reasonable and urgent task. To solve these problems, there are three ways to improve nutrient media. The first way is the addition of various nutritional supplements and growth stimulants (Macfarlane D.E., Elian-Jones T.E., 1980). The second way is associated with the search for new raw materials rich in proteins for the preparation of nutritional bases, among which a special place is given to protein hydrolysates (Troshkova G.P. et al., 2006). Recently, research has been conducted related to the possibility of using protein hydrolysates from non-traditional raw materials: waste from the meat, dairy, fish and poultry processing industries (Troshkova G.P. et al., 2006). The third way is to develop ways and methods to improve the quality of raw materials used for the preparation of microbiological nutrient media aimed at increasing its biologically active components. There are few reports of real results in this direction (Panova N.V., 2006).
Keywords: nutrient medium, cultivation, amino acids, viral suspension, filtration, water, water for injection, deep cultivation
Введение. Совершенствование промышленных технологий глубинного культивирования обусловлено глубокими переменами, произошедшими в биотехнологии за последние три десятилетия. Основу этих событий составляют новые представления в области микробиологического синтеза биологически активных веществ, методические, технологические и технические усовершенствования, приблизившие нас к познанию превращений материального субстрата и проложившие дорогу промышленным нововведениям. Как бы то ни было, но названные выше направления изменили лицо традиционной биотехнологии, основанной на использовании методов культивирования микроорганизмов, культур клеток и вирусов, и расширили границы применения биологических процессов в производстве. Новые веяния ни в какой мере не умаляют значение технической микробиологии как важной составляющей биотехнологии, они остаются одной из основ биологической промышленности, ещё далеко себя не исчерпавшей.
Основными задачами приоритетных прикладных исследований, результаты которых широко используются в производстве, являются: создание новых вакцин, лечебных сывороток, диагностику-мов, лекарственных препаратов, без создания высококачественных питательных сред для глубинного культивирования их рецептурных составов под тот или иной производственный штамм. Огромное значение при изготовлении противовирусных и бактерийных препаратов имеет качество питательных сред, которые способствуют в изготовлении вакцин нового поколения. Для ликвидации и профилактики инфекционных болезней животных и птиц отечественная промышленность выпускает разнообразные биопрепараты, вакцины, сыворотки, диагностикумы. Одним из перспективных способов производства биопрепаратов является суспензионное (глубинное) культивирование [5].
Одной из важных предпосылок успешного применения технологии глубинного культивирования является разработка питательных сред, в составе которых играют важную роль заменимые и незаменимые аминокислоты, включая: лизин, гистидин, и т.д. Очень важно конструирование качественных
126
питательных сред для крупномасштабного производства противовирусных вакцин против ящура и антирабических вакцин, представляется обоснованной и актуальной задачей.
Среди научных задач, влияющих на уровень технологии при изготовлении противовирусных вакцин, влияющих на получение качественных антигенов - это конструирование и технология получения питательных сред. Производство биопрепаратов в агробиологической промышленности представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных биохимических, биофизических и физико - химических процессов.
Решение задач совершенствования промышленной технологии производства ветеринарных препаратов потребовало научного обоснования и разработки основ оптимизации питательных сред с использованием современных методов исследования. Заслуживают внимание три пути оптимизации и совершенствования питательных сред. Первый путь - добавление различных питательных добавок и стимуляторов роста (Macfarlane D.E., Elian-Jones Т.Е., 1980). Второй путь - связывают с поиском нового сырья, богатого белками для приготовления питательных основ, среди которых особое место отводится белковым гидролизатам (Трошкова Г.П. и др., 2006). В последнее время проводят исследования, связанные с возможностью использования белковых гидролизатов из нетрадиционного сырья: отходы мясной, молочной, рыбной и птицеперерабатывающей промышленности (Трошкова Г.П. и др., 2006). Третий путь - это разработка путей и методов повышения качества сырья, используемого для приготовления микробиологических питательных сред, направленных на увеличение в нём биологически активных компонентов. Сообщения о реальных результатах в этом направлении единичные (Панова Н.В., 2006).
Материалы и методы. Для усовершенствования питательной среды для крупномасштабных производств противоящурных и противоантирабических вакцин для сельскохозяйственных животных необходимо использование технологического оборудования. Для приготовления питательной среды для культивирования клеток и вируса в крупных объёмах (1400 - 3000 л) используются смесители из нержавеющей стали вместимостью 1500 л фирмы «SPEICHIM» («Спейшим»), смеситель «Ruland», «Abacus» вместимостью 3000 л, весы электронные Sartorius EA16001S для взвешивания химических реактивов, фильтр воздушный гидрофобный марки PFS020R02AN06 фирмы «ЗМ» используется для подачи стерильного воздуха в смеситель, чаны передвижные из нержавеющей стали объемом 60 л, 100 л, 120 л, фирмы «SPEICHIM» («Спейшим») используются для приготовления концентрированных растворов для изготовления питательной среды в большом объёме, комплект фильтров для фильтрации концентратов растворов: фильтрующая кассета для глубинного фильтра СОНС 1,1 - 0,2 мкм, фильтро-элемент для патронного фильтра «Polysep» («Полисеп») 1/0,5 мкм, фильтроэлемент для патронного фильтра «Пигароге» («Дюрапор») 0,22 мкм, комплект фильтров для фильтрации питательной среды: фильтр для глубинной фильтрации «Millistak» («Миллистак») фирмы «Millipor» («Миллипор») с диаметром пор 5,0-0,2 мкм, фильтры патронные фирмы «Millipor» («Миллипор») для стерилизующей фильтрации питательной среды с диаметром пор 0,5 мкм и 0,22 мкм высотой 0,75 м (30 дюймов), магнитная мешалка «Biosan» («Биосан») MMS-3000 используется для размешивания приготовленных растворов, программатор RACE 3418 для стерилизации смесителей, установка «Super Q» по получению суперочищенной воды на которой готовят питательные среды.
Для крупномасштабного производства противовирусных вакцин в рецептуру питательных сред входят еде дующие ингредиенты: антибиотики - нистатин, канамицин, бензилпеницилин натриевая субстанция; натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый 7-водный, натрий фосфорнокислый 2-зам. 12 водный, калий фосфорнокислый, декстроза, гидролизат лактальбумина, ФМГ, аминокислоты - глютамин, аргинин НС1, тирозин, триптофан, кальций хлористый 6-водный, витамины -холино-хлорид, Д-кальций пантотенат для клеточных культур SIP5155, никотинамид СЕЕЕ CUETURE TESTED SIN 0636, пиридоксаль гидрохлорид SIP 9130, рибофлавин SIR 4500, фолиевая кислота SIF7876, мио-инозит СЕЕЕ CUETURE TECTED SII7508, натрий двууглекислый, сыворотка КРС.
Современное производство вакцин во многом зависит от уровня используемой технологии. Технология должна быть биологически безопасной и экономически выгодной. При получении биомассы, важное значение имеет используемая питательная среда для реакторного (глубинного) культивирования, её рецептура (конструкция среды), которая обеспечивает высокий выход того или иного антигена [1, 2, 4].
Результаты исследований и их обсуяедение. Совершенствование технологии производства средств профилактики инфекционных болезней животных и внедрение в ветеринарную практику эффективных биологических препаратов, зависит от качества и составляющих питательной среды, которые входят в её состав, остаётся одной из главных задач [3, 4]. Провели мониторинг об особенностях состава и применения наиболее широко используемых синтетических питательных сред (таблица 1).
127
Таблица 1 - Наиболее широко используемые питательные среды
Питательные среды
Особенности состава и применение
Среда 199
Широко используемая многокомпонентная среда, оригинально предназначалась и использовалась для производства полиовируса. Рекомендуется для применения в диагностике ви-русных инфекций._________________________
Обычно используемая среда с минимальным
Основная среда Игла, ВМЕ
набором аминокислот
и витаминов. Ориги-
Основная среда Игла для культивирования диплоидных клеток, ВМЕ - диплоид
Минимальная среда Игла МЕМ
Минимальная среда Игла для суспензионных культур, MEMS
Среда Игла в модификации Дюльбеко, ДМЕМ
Среда Хэма, Р-10, F-12
Среда Мак-Коя, McKoy 5 а (RPM-1629)
Среда Фишера
Среда Лейбовица Е-15
Среда NCTC 109
Среда МВ 752/1
нально предназначалась для культивирования клеток Hela, КВ и т.п.
По сравнению с ВМЕ MgSO4 заменён на MgCE2 удалён i-инозитол.
По сравнению с ВМЕ в 5 раз увеличено содержание аргинина, в 4 раза - гистидина, двукратный набор остальных аминокислот, кроме глютамина, удалён биотин. Используется для культивирования большинства перевиваемых линий клеток с повышенными требованиями к составу питательной среды. Позволяет поддерживать культуры длительное время без под-кормки.____________________________________
По сравнению с МЕМ удалён СаСЕ, повышено содержание NaH 2РО 4, зачастую дополняется карбоксиметилце ллюлозой.__________________
По сравнению с ВМЕ в два раза увеличен глютамин, добавлен глицин и серин: витамины и аминокислоты увеличены примерно в 4 раза. Присутствует минимальное количество Ее (NO3 )з Оригинально использовалась для выращивания вируса полиомы в первичных культу-рах клеток эмбрионов мыши._________________
Имеет сбалансированный оптимизированный состав, поддерживающий при добавлении белковых фракций сыворотки клональный рост диплоидных клеток китайского хомячка. При добавлении сыворотки представляет собой одну из самых питательных сред, пригодную для вы-ращивания большинства клеточных линий.
Среда используется для культивирования лейкоцитов, материала биопсий и наиболее требовательных первичных и перевиваемых культур. Требует добавления 10-30 % эмбриональной телячьей сыворотки.
Поддерживает рост ряда линий мышечных лейкемических клеток.
В буферной системе отсутствует бикарбонат натрия, что позволяет выращивать клетки в условиях контакта с открытой атмосферой. Глюкоза заменена галактозой._______________
Оригинально создана как химически определенная среда для выращивания клеток Z-929. При добавлении сыворотки хорошо поддерживает рост клеточных линий. Среда СТС 135 идентична ей по составу, но содержит 1-цистин. Предназначалась для культивирования клеток Z-929. Широко используется для обычного культивирования быстрорастущих клеток.
128
При крупномасштабном производстве препаратов ветеринарного назначения, необходимо разработать производственный резерв питательных сред для ускоренного выпуска препаратов в больших количествах для купирования эпизоотических вспышек тех или других болезней сельскохозяйственных животных. В связи с этим нами были проведены исследования по основным условиям хранения стабильности питательных сред и их компонентов. Нами были перепроверены данные приведенные в научной литературе, которые в наших исследованиях подтвердились (таблица 2) [6, 8, 11].
Таблица 2 - Стабильность питательных сред при хранении
Питательная среда и ее компоненты
Температура хранения, °C
Длительность сохранения основных свойств
Жидкие синтетические среды без глютамина и без сыворотки
Жидкие синтетические среды с глютамином и с сывороткой
Жидкие синтетические питательные среды с глютамином и сывороткой
6 месяцев
2 месяца
месяца
Сыворотки нелиофилизированные
20
Более 6 месяцев
4
4
4
Сыворотки лиофилизированные
Более года
4
Сбалансированные солевые растворы
- 20-22
Около года
Гидролизат лактальбумина
3 месяца
50- и 100-кратный концентрат (без глютамина)
Более 6 месяцев
4
4
100-кратный концентрат глютамина
-20
Более 6 месяцев
100-кратный концентрат витаминов
-20
Более 6 месяцев
Раствор антибиотиков
-20
6 месяцев
Сухие синтетические питательные среды
Не менее года в отсутствии контакта с открытой атмо-сферой
Питательная среда должна иметь следующие физико - химические показатели:
1. Величина
рН=7,0±0,2 (без сыворотки);
рН=7,2±0,2 (с сывороткой);
2. Осмомоляльность или показатель криоскопии:
3. Буферная ёмкость
от -0,62 до 0,70 °C
3,5±0,5 мг экв. НС1/л
Стерильность
среды
контролируют
по
ГОСТ
28085-89
(СТ СЭВ 6280-88). Среду фасуют в 5 л бутыли, укупоривают резиновыми пробками, фольгой и бумагой «Крафт». Хранят при 20 °C в течение 12 месяцев [7, 9, 10].
4
129
На рисунке 1 показан технологический процесс по изготовлению резерва питательных сред для крупномасштабного производства препаратов ветеринарного применения.
Рисунок 1 - Технологическая схема получения питательных сред
Физ -хям: кокгрсль
Погп’чение ЗДП с vctmoehi Super Q
Физ - ХИМ коятродь
ПрнгоюьлЕякЕ юяментратоя (р.ра амйиоккаюг. кйтамннси!. солевого р-ра Хенкеа. гнцролн-затзв
Фнэ -хтс
ХоИТрОЯЬ
Разведение кокиеитратов к ввеаеше актнбкотаоЁ {ПЗДуЧЕЛне готовой ЖИДКОЙ среди]
МСНИЖ ОС'ОруЗйВй.НЛЯ
Физ -Х!Г.[ ьонтродь
Стернлнзукззпая ■фктырацзи и фасовка среды
Баетернологнческин коатрсдь
Передач? или хр? некие среды
Заключение. В статье показан анализ технологии конструирования питательных сред для глубинного культивирования ящурных и антирабических производственных штаммов для получения антигенов для выпуска вакцин против данных болезней. Проведён мониторинг наиболее широко используемых питательных сред, проведены исследования питательных сред при хранении, показаны физико-химические показатели, которые должна иметь питательная среда.
Список источников
1.
2.
3.
4.
5.
Аткинсон Б. Биохимические реакторы. М.: Пищ. пром-ть, 1979. 280 с.
Артюхин В.И., Шепелин А.П., Киселева Н.В. Белковые гидролизаты в производстве питательных сред: Производство и применение микробиологических сред. Обзорн. информ. М.: 1990. Вып. 9-10.
Бирюков В.В., Кантере М.В. Оптимизация периодических процессов культивирования микроорганизмов. М.: Наука, 1985. 292 с.
Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. М.: КолосС. Химия, 2004. 295 с.
Применение пеногасителей при глубинном культивировании бруцелл / Р.Ю. Насибуллин // Ветеринарный врач. - 2023. - №4. - С. - 33-37.
130
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Пригода A.С., Муратов В. С. Современное состояние и перспективы получения и использования питательных сред. Производство и применение продуктов микробиологических производств. Обзорн. информ. М.: 1989. Вып.8.
Раскин Б.М., Исаева З.А. Применение метода оценки качества питательных сред по показателям процессов культивирования микроорганизмов: сб. науч. тр. «Процессы культивирования патогенных микроорганизмов». М: 1981.
Самуйленко А.Я., Рубан Е.А. Основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов. М.: Изд. Академии наук РФ, 2000. Т. 1,2.
Смирнова Г.А., Раскин Б.М., Мельникова В.А. и др. Изучение пептидного и аминокислотного состава различных белковых основ питательных сред //Микробиология, 1985. № 12.
Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2010.
Teixeira А. et al. Modelling and optimization of a recombinant BHK-21 cultivation process using hybrid grey-box systems. 2005. Vol. 118.
12. https://patents .google .com/patent/RU23 005 62C2/ru
13. https://patents.google.com/patent/RU2553552Cl/ru?q=(BHK%2£21-13)&oq=BHK%2£21-13
14. https ://vetbio .ru/catalog/pigs/vakcine/aueski-vaccine-bak/
15. https://shop.arriah.ru/catalog/vaktsiny/vaktsiny-protiv-bolezney-sviney/vaktsina-protiv-bolezni-aueski-iz-markirovannogo-shtamma-i-reproduktivno-respiratomogo-sindroma-svi/
16. https://www.vettorg.net/pharmacy/95/1054/
17. https://findpatent.ru/patent/277/2779551 .html
18. http://биo-вeт.pф/catalog/detail.php?EEEMENT_ID=707
19. https://www.boehringer-ingelheim.ru/вeтepинapнoe-пoдpaздeлeниe/cвинoвoдcтвo/ингeльвaк-ayecки-mlv
20. https://www.vidal.ru/veterinar/verres-bage—30889
21. https://biocombinat.ru/catalog/10/5454/
References
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Atkinson B. Biochemical reactors. M.: Food industry, 1979. 280 p.
Artyukhin V.I., Shepelin A.P., Kiseleva N.V. Protein hydrolysates in the production of culture media: Production and use of microbiological media. Overview information M.: 1990. Issue. 9-10.
Biryukov V.V., Cantere M.V. Optimization of periodic processes for cultivating microorganisms. M.: Nauka, 1985. 292 p.
Biryukov V.V. Fundamentals of industrial biotechnology. M.: KolosS. Chemistry, 2004. 295 p.
The use of defoamers in submerged cultivation of brucella / R. Yu. Nasibullin // The veterinarian. - 2023.
-No4.-P. 33-37.
Prigoda A.S., Muratov V.S. Current state and prospects for obtaining and using nutrient media. Production and use of microbiological products. Overview information M.: 1989. Issue. 8.
Raskin B.M., Isaeva Z.A. Application of a method for assessing the quality of nutrient media based on indicators of microorganism cultivation processes: collection of articles, scientific tr. "Processes of cultivation of pathogenic microorganisms." M: 1981.
Samuilenko A.Ya., Ruban E.A. Fundamentals of technology for the production of veterinary biological preparations. M.: Publishing house. Academy of Sciences of the Russian Federation, 2000. T. 1,2.
Smirnova G.A., Raskin B.M., Melnikova V.A. and others. Study of the peptide and amino acid composition of various protein bases of nutrient media // Microbiology, 1985. No. 12.
Freshni R.Ya. Animal cell culture. Practical guide. M.: BINOM. Knowledge Eaboratory, 2010.
Teixeira A. et al. Modeling and optimization of a recombinant BHK-21 cultivation process using hybrid gray-box systems. 2005. Vol. 118.
12. https://patents .google .com/patent/RU23 005 62C2/ru
13. https://patents.google.com/patent/RU2553552Cl/ru?q=(BHK%2f21-13)&oq=BHK%2£21-13
14. https ://vetbio .ru/catalog/pigs/vakcine/aueski-vaccine-bak/
15. https://shop.arriah.ru/catalog/vaktsiny/vaktsiny-protiv-bolezney-sviney/vaktsina-protiv-bolezni-aueski-iz-markirovannogo-shtamma-i-reproduktivno-respiratomogo-sindroma-svi/
16. https://www.vettorg.net/pharmacy/95/1054/
17. https://findpatent.ru/patent/277/2779551 .html
18. http://биo-вeт.pф/catalog/detail.php?ELEMENT_ID=707
131
19. https://www.boehringer-ingelheim.ru/вeтepинapнoe-пoдpaздeлeниe/cвинoвoдcтвo/ингeльвaк-ayecки-mlv
20. https://www.vidal.ru/veterinar/verres-bage—30889
21. https://biocombinat.ru/catalog/10/5454/
Bee авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication. The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / accepted for publication 10.02.2025;
© Бирюкова Ю. М., Мельник Р. Н., Мельник Н. В., Стариков В. А., Мингалеев Д. Н., Панкова Е. В. 2025
