CC BY
42
Плотникова К.Ю., Гудков В.Г., Виринская А.С.
РНПЦ эпидемиологии и микробиологии, Минск
Совершенствование антигенсвязывающей полимеразной цепной реакции для детекции вируса гепатита А
Полимеразная цепная реакция (ПЦР), основными стадиями которой является выделение из исследуемого материала, амплификация и последующая детекция диагностически значимых фрагментов генома различных биологических объектов, широко используется для обнаружения возбудителей вирусных инфекций, включая вирус гепатита А (ВГА). Этот метод, обладающий высокой чувствительностью и специфичностью при относительно небольшой продолжительности исследования, особенно актуален при выявлении трудно- и некультивируемых вирусов, к которым относится ВГА. Благодаря использованию ПЦР получены доказательства продолжительной циркуляции ВГА (РНК ВГА) в крови больных и рекон-валесцентов, она нашла широкое применение при выявлении случаев контаминации вирусом воды и продуктов питания, расшифровке вспышек инфекции, определении источников и путей инфицирования и др. [3, 6, 14]. Вместе с тем традиционная (классическая или так называемая прямая) ПЦР не способна различать полноценные (интакт-ные) и неполноценные (с поврежденной белковой структурой) вирусные частицы, поскольку направлена на обнаружение исключительно нуклеиновой кислоты без учета ее связи с вирусными белками. Это существенно ограничивает значимость результатов ПЦР при выявлении источников инфекции, путей и факторов ее распространения, оценке виру-лицидной активности дезинфектантов и в других исследованиях, при которых большое значение имеет определение факта жизнеспособности выявленного возбудителя заболевания.
Новый метод антигенсвязывающей ПЦР (АС-ПЦР), предложенный для выявления вирионов ВГА [10], позволял устранить этот недостаток традиционной ПЦР. Согласно приведенной методике на первой стадии исследования происходило иммунологическое связывание вируса сорбированными на стенках 1,5 мл поли-
пропиленовых микроцентрифужных пробирок специфическими антителами. Последующие стадии отмывки позволяли удалять потенциально содержащиеся в пробе ингибиторы реакции, а прогревание при 95 °С в течение 5 мин - выделить из образовавшего иммунокомплекса РНК возбудителя. Затем следовали стадии обратной транскрипции, амплификации и детекции ее продуктов. Таким образом, этот метод представлял собой комбинацию иммунологического и молеку-лярно-биологического исследования с сохранением преимуществ каждого из них. Более того, в отличие от них он позволял получать качественно иной результат исследования - с его помощью выявлялись только интакт-ные вирусные частицы с сохраненной структурой нуклеопротеида.
Метод АС-ПЦР успешно применялся для обнаружения ВГА в сточных водах [8], других объектах окружающей среды и моллюсках [7], препаратах фактора VIII [13].
Однако предложенная методика имела существенные недостатки. Во-первых, ее эффективность сильно зависела от свойств использующихся в качестве подложки для сорбции антител микропробирок, которые не стандартизуются по этому параметру [1], во-вторых, в связи с отсутствием специального оборудования первые этапы исследования не поддавались автоматизации и однотипные операции осуществлялись отдельно с каждой пробиркой.
Видимо, по этим и другим причинам наибольшее распространение получил вариант АС-ПЦР, включающий сорбцию специфических антител на магнитных частицах [2, 11, 15]. К преимуществам такого подхода можно отнести возможность концентрирования вируса уже на этапе его выделения, к недостаткам -необходимость наличия специального оборудования и материалов. Подобная методика использовалась при исследовании образцов грунтовых вод и продуктов питания [2, 15].
Несмотря на достоинства метода АС-ПЦР, позволяющего осуществлять детекцию интактных вирионов ВГА путем сочетанного выявления двух основных структур (маркеров) этого возбудителя: белка (антигена) и генома (фрагмент РНК) он пока не получил широкого применения. По-видимому, это обусловлено ограниченным объемом информации о результатах применения и возможностях этого метода, несовершенством методики исследования и отсутствием коммерческих диагностических наборов.
Цель исследования - совершенствование методики, изучение ее эффективности и разработка диагностического набора для выявления ВГА методом АС-ПЦР.
Материалы и методы
Вирус. В работе использовались штаммы HAV707 и HAV027А, а также два изолята из коллекции лаборатории эпидемиологии энтеровирусных инфекций РНПЦ эпидемиологии и микробиологии. Исходный вируссодержащий материал разводился до необходимых концентраций вируса в фосфатно-солевом твинсо-держащем буферном растворе или питательной среде DМЕМ в экспериментах с использованием культуры клеток.
Образцы сточных вод. Исследовался 21 образец сточных вод, отобранный из коллектора городской детской инфекционной клинической больницы г. Минска.
АС-ПЦР. При проведения АС-ПЦР сенсибилизация твердой фазы осуществлялась раствором иммуноглобулина класса в к ВГА, после чего для предотвращения неспецифической сорбции и сохранения свойств использовался раствор бычьего сывороточного альбумина и стабилизирующий раствор.
Выделение РНК проводилось с помощью термической денатурации или лизирующего раствора. Очищенная РНК использовалась в реакции обратной транскрипции и амплификации. В качестве целевых использовались фрагменты высоко консервативных участков гено-
ма ВГА из VP3-VP1 и 5-некодирующей областей. Праймеры были изготовлены ОДО «Праймтех» (г. Минск). При элект-рофоретической детекции результатов продукты амплификации анализировались в 2%-ном агарозном геле. В случае постановки ПЦР в режиме реального времени полученные в ходе реакции данные анализировались с помощью программы Rotor-Gene, версия 6.1.
Исследование термической денатурации ВГА. Исследуемые пробы разводились в 50 раз. Половина смеси отбиралась и оставлялась в качестве контроля, а вторая часть термостатировалась при 70 °С в течение 5 мин, после чего охлаждалась на льду в течение 5-7 мин.
Исследование влияния 70%-ного этанола. Суспензия ВГА добавлялась к 100 мкл 74,9%-ного этанола в объеме 7 мкл (конечная концентрация спирта -70%, при этом вирусная взвесь разводилась в 15,3 раза). Полученная смесь выдерживалась при температуре 20 °С в течение 5 мин, после чего действие этанола нейтрализовывалось путем разведения в 20 (при использовании культуры клеток) или 50 раз. В качестве контроля использовался образец, приготовленный следующим образом: 70%-ный этанол и суспензия ВГА, предварительно разведенная в 15,3 раза, смешивались со средой DMEM или буферным раствором в объемном соотношении 1:1:18 или 1:1:48 соответственно.
Определение инфекционного титра (концентрации) вируса проводилось методом интегрированной с культурой клеток ПЦР (ИКК-ПЦР) путем титрования образцов на культуре клеток почки эмбриона макаки резус FRhK-4 с десятикратным шагом разведения. Считалось, что образец не содержит инфекционный вирус, если после 7 суток культивирования достоверный рост содержания РНК ВГА отсутствовал.
Концентрация вируса в АС-ПЦР измерялась в относительных единицах AC-PCRU, представляющих собой конечное детектируемое в АС-ПЦР разведение вируссодержащей суспензии [9]. Для построения стандартной кривой использовались последовательные десятикратные парные разведения вирус-содержащей взвеси в фосфатно-соле-вом буферном растворе.
Определение антигена ВГА методом иммуноферментного анализа (ИФА). Детекция антигена ВГА методом ИФА проводилась с помощью тест-системы имму-ноферментной для выявления антигенов вируса гепатита А «ГЕПА-АГ» производ-
ства РНПЦ эпидемиологии и микробиологии согласно прилагаемой инструкции.
Результаты и обсуждение
Методика АС-ПЦР для детекции ин-тактных вирионов ВГА разрабатывалась с целью устранения недостатков существующих методик, обусловленных применением в качестве подложки для сорбции иммуноглобулинов не подлежащих стандартизации по уровню сорбцию микропробирок, сложностью автоматизации процесса из-за невозможности использования стандартного лабораторного оборудования [10] или необходимостью применения новых материалов и специального оборудования [2].
Поскольку первые стадии АС-ПЦР и ИФА по существу аналогичны, в качестве твердой фазы для сорбции анти-ВГА иммуноглобулинов испытывались разборные иммунологические планшеты со стандартизованной сорбционной способностью в отношении 1дв. С целью подбора оптимальной концентрации специфических антител раствор иммуноглобулина в к ВГА в концентрации 8,5 мг/мл вносился в лунки планшета в трех разведениях: 1:1000, 1:5000 и 1:10000. Исследование показало, что оптимальным являлось разведение 1:5000 (1,7 нг/мл).
Выделение РНК из находящегося в составе иммунного комплекса ВГА проводилось путем внесения в лунки планшета лизирующего раствора, содержащего гуанидин изотиоцианат. Затем содержащий РНК ВГА лизирующий раствор переносился в центрифужные пробирки, в которых проводилась преципитация изопропанолом и осаждение РНК путем центрифугирования при 14000 об/мин в течение 15 мин.
Таким образом, использование иммунологических планшетов позволило стандартизовать процесс сорбции иммуноглобулинов и автоматизировать этапы сорбции иммуноглобулинов, внесения лизирующего раствора, а также промежуточные циклы отмывки лунок с помощью стандартного оборудования и инструментов, предназначенных для ИФА.
Подбор праймеров для диагностической ПЦР осуществляется на основе нук-леотидной последовательности наиболее консервативных участков генома вируса. У ВГА ими являются 5'-НТО и VP3-VP1 области. Однако анализ публикаций, посвященных разработке методик обнаружения ВГА методом ПЦР3 показал, что с этой целью чаще всего используется VP3-VP1 регион [4, 5, 10, 16] и значительно реже -
5'-НТО [2]. Предварительно, для отработки методики нами были выбраны две пары праймеров, имеющих одинаковую 5'-последовательность: пара праймеров F и G длиной 24 и 25 нуклеотидных основания [5] и пара праймеров D и E длиной 39 нуклеотидных основания [4, 16], расположенных в VP3-VP1 области.
Постановка ПЦР с обеими парами праймеров показала, что эффективность реакции была выше при использовании пары F и G, однако в обоих случаях наблюдалось образование выраженных неспецифических сигналов, образованных димерами праймеров. С целью увеличения специфичности реакции подбирались оптимальные концентрации праймеров и хлорида магния, температура и режим амплификации. Однако добиться исчезновения прай-мер-димеров не удалось. В связи с этим было принято решение о замене обратного праймера. Используя программы Primer3 и Oligonucleotide Properties Calculator была подобрана последовательность праймера g. Использование сочетания праймеров F и g позволило не только существенно снизить образование димеров праймеров, но и повысить чувствительность реакции.
С целью определения оптимальных условий проведения ПЦР изучалось влияние на эффективность реакции температуры отжига праймеров, состава буферных растворов, концентрации хлорида магния и праймеров. Для отработки параметров использовалась кДНК лабораторного штамма HAV707.
Подбор оптимальной температуры отжига праймеров. Оптимальная температура отжига праймеров определялась в интервале температур 52-58 °С с шагом в 2 °С. Оптимальным значением оказалось 52 °С.
Подбор оптимального состава реакционной смеси. Исследовалось влияния на эффективность ПЦР буферных растворов следующего состава:
- 10 ммоль ТрисНа (рН8,8 при 25 °С), 50 ммоль KCl, 0,08% Nonidet P40, 1,5 ммоль MgCl2;
- 75 ммоль ТрисНа (рН8,8 при 25 °С), 20 ммоль (NH4)2SO4, 0,01 ммоль Твин 20, 2,0 ммоль MgCl2.
Результаты 2 показали, что синтез ПЦР-продукта происходит эффективнее при использовании буферного раствора с сульфатом аммония.
Поскольку ПЦР-буфер с сульфатом аммония требует более высоких концентраций хлорида магния по сравнению с буферным раствором, содержащим
Рисунок 1
Электрофореграмма продуктов амплификации при детекции десятикратных разведений суспензии ВГА методом АС-ПЦР: 1 - маркер, 2, 3 - 0,35 ТСЮ50, 4, 5 - 0,035 ТСЮ50, 6, 7 - 0,0035 ТСЮ50, 8, 9 - 0,00035 ТСЮ50
Рисунок 2
Электрофореграмма продуктов амплификации при изучении специфичности методики АС-ПЦР для выявления ВГА: М - маркер, 1-3 - ВГА (субгенотипов 1А, 1В, ША), 4 - аденовирус, 5 - саповирус, 6 - вирус ЕСНОб, 7 - вирус ЕСН030, 8 - норовирус 1-го генотипа, 9 - норовирус 2-го генотипа, 10 - вирус гепатита В, 11 - вирус гепатита С
хлорид калия, содержание ионов Мд2+ варьировалось от 2 ммоль до 4 ммоль с шагом 0,5 ммоль. В ходе эксперимента было установлено, что оптимальной концентрацией, при которой удалось достичь наилучшего сочетания специфичности и чувствительности реакции, является 3 ммоль.
Чувствительность и специфичность методики АС-ПЦР. Чувствительность реакции оценивалась при исследовании десятикратных разведений культуральной ВГА-содержащей взвеси с исходным титром 1035 ТСЮ50. Каждое разведение проходило все эта50пы исследования, начиная с выделения РНК. Последним детектируемым разведением оказалось 10-6, что соответствует 0,0035 ТСЮ50 (рис. 1).
Специфичность методики определялась путем исследования проб, заведомо содержавших три варианта ВГА различных генотипов, генетические маркеры аденовируса, энтеровирусов ЕСН06, ЕСН030, вируса гепатита В и сапповиру-са, норовирусов 1-го и 2-го типов, вируса гепатита С. Как видно из электрофоре-граммы продуктов амплификации (рис. 2), специфический ПЦР-продукт был получен только при исследовании всех ВГА-содержащих проб, что свидетельствует о высокой специфичности метода и его универсальности в отношении различных генотипов вируса.
Помимо чувствительности и специфичности изучались другие свойства и возможности использования этой реакции. Известно, что чувствительность традиционной ПЦР нередко существенно снижается при исследовании субстратов содержащих ингибиторы этой реакции.
Таким субстратом, в частности, являются сточные воды. При параллельном исследовании методами традиционной и АС-ПЦР 21 пробы сточных вод из коллектора инфекционной больницы г. Минска ВГА был обнаружен в 4 (19,0%) из них, в то время как методом ПЦР РНК ВГА не была выявлена ни в одной пробе. Это свидетельствует об эффективности АС-ПЦР в присутствии ингибиторов реакции, которые, по-видимому, удаляются в процессе отмывок после сорбции вирионов.
В последние годы электрофоретиче-ская детекция результатов ПЦР все больше вытесняется более информативной и технологически совершенной ПЦР в режиме реального времени. Это обусловило разработку аналогичной методики АС-ПЦР.
Было проведено сравнительное исследование различных типов флуоресцентных олигонуклеотидных проб для ПЦР в реальном времени (TaqMan, молекулярный бикон) и LUX-праймеров со шпилечной структурой и без нее, а также SYBR Green для детекции вируса гепатита А. Показано, что любой из них может быть использован для обнаружения РНК ВГА при условии соответствия требованиям к чувствительности и специфичности, однако применение LUX-праймеров (как и SYBR Green) требует дополнительного этапа подтверждения специфичности полученных результатов. Использование олигонуклеотидных проб (TaqMan, молекулярный бикон) позволяет снизить вероятность ложноположительных результатов исследования. Разработанная методика АС-ПЦР в режиме реального
времени позволила регистрировать количественное изменение содержания вируса в пробе.
Лежащий в основе АС-ПЦР принцип сочетанного выявления антигена и связанной с ним (упакованной в него) вирусной РНК указывает на возможность метода выявлять интактные вирусные частицы с сохраненным нуклеопротеидом. С целью подтверждения этого предположения было проведено параллельное исследование вируссодержащих образцов куль-туральной жидкости до и после воздействия теплового (70 °С в течение 5 мин) и химического (70%-ный этанол в течение 5 мин) факторов методами традиционной ПЦР ИКК ПЦР АС-ПЦР и ИФА. В результате было показано, что воздействие тепла не приводило к изменению содержания антигена и РНК в пробе, а обработка этанолом - концентрации РНК (определение антигена после обработки этанолом не проводилось в связи со снижением содержания антигена до недетектируемых в ИФА пределов после нейтрализации этанола разведением). Однако при этом наблюдалось значительное снижение измеряемых показателей как в реакции ИКК ПЦР так и в АС-ПЦР. Образец ВГА, прошедший тепловую обработку, вовсе не давал роста в культуре клеток, при этом у контрольного образца ВГА, не подвергнутого тепловому воздействию, и двух его десятикратных разведениях после 7 сут культивирования отмечался 87-139-кратный рост содержания РНК, свидетельствующий об интенсивной репродукции вируса. В экспериментах с этанолом рост содержания вирусной РНК регистрировался в культуре клеток,
Таблица il Результаты инактивации лабораторных штаммов и изолятов ВГА 70%-ным этанолом
Вирус Содержание вируса, log10 AC-PCRU
исходный после обработки эдижение
Штамм HAV707 5,1 ± 0,2* 4,7 ± 0,04 0,4 ± 0,25
Штамм HAV027 4,3 ± 0,06 0,8 ± 0,3 3,5 ± 0,37
BY_Minsk_2008_Jan_2*11 3,5 ± 0,02 2,5 ± 0,17 1 ± 0,22
BY_Brest_2008_Feb_7005 4,3 ± 0,03 3,0 ± 0,09 1,3 ± 0,12
* Доверительный интервал при уровне значимости 0,05.
Таблица ^ Результаты инактивации лабораторных штаммов и изолятов ВГА теплом (70 °С в течение 5 мин)
Вирус Содержание вируса, log10 AC-PCRU
исходный после обработки снижение
Штамм HAV707 5,2 ± 0,02* 2,7 ± 0, 4 2,5 ± 0,49
Штамм HAV027 4,3 ± 0,01 - 4,3 ± 0,02
BY_Minsk_2008_Jan_2*11 4,4 ± 0,02 0,02 ± 0,03 4,4 ± 0,05
BY_Brest_2008_Feb_7005 5,4 ± 0,04 0,1 ± 0,27 5,3 ± 0,35
* Доверительный интервал при уровне значимости 0,05.
инфицированной цельным и разведенным в 10 раз опытным образцом. Как и в эксперименте с нагреванием, последним разведением контрольного образца ВГА, которое давало репродукцию возбудителя, было 1:100.
Таким образом, при исследовании методом ИКК-ПЦР показано, что воздействие обоих указанных факторов на ВГА в использованных концентрациях приводило к снижению инфекцион-ности этого возбудителя: не менее чем на 2 1од10 при нагревании и до 1 1од10 при спиртовой обработке (дискретность измерения инфекционности не позволила более точно определить снижение указанного параметра).
При исследовании аналогичных опытных и контрольных образцов ВГА методом АС-ПЦР также как и методом ИКК-ПЦР наблюдалось падение концентрации вируса после нагревания (на 2,5 1од10) и обработки этанолом (на 0,5 1од10), что свидетельствует об их принципиальной сопоставимости. Вместе с тем, АС-ПЦР выгодно отличается от ИКК-ПЦР более высокой чувствительностью и производительностью при значительно меньших продолжительности исследования и затратах на него. Полученные результаты также указывают на явное преимущество АС-ПЦР перед методами, направленными на детекцию отдельных компонентов вирусной частицы.
Сохранение способности вируса обнаруживаться методом прямой ПЦР после обработки этанолом объясняется его денатурирующим воздействием на вирусный белок, в то время как мишенью метода является РНК, которая этанолом не повреждается. Термическое же воздействие вызывает конформационные изменения вирусного капсида, приводящие к высвобождению РНК и потере инфекционности [12]. При этом наличие в среде катионов магния позволяли антигену ВГА сохранять свои свойства до 87 °С. Вследствие этого, а также термостабильности РНК, методы ИФА и ОТ-ПЦР в отличие от АС-ПЦР оказались неспособными адекватно отражать изменение содержания интактных вирусных частиц в пробе.
С помощью АС-ПЦР изучалась также резистентность к воздействию этанола и тепла лабораторных штаммов HAV707, HAV027 и двух изолятов ВГА.
Как следует из табл. 1, результаты экспериментов показали, что 70%-ный этанол при экспозиции со штаммами и изолятами ВГА в течение 5 мин проявлял свою вирулицидную активность, снижая концентрацию вирионов в пробах.
Однако степень снижения концентрации вирионов и, следовательно, резистентности штаммов и изолятов к воздействию 70%-ного этанола оказалась неодинаковой. Штамм HAV707 оказался гораздо более устойчивым к воздействию этилового
спирта, чем штамм HAV027. Различие значений концентрации интактных вирусных частиц штаммов HAV707 и HAV027 после обработки этанолом составляло 3,1 lg (p > 0,05). Значения постэкспозиционного снижения концентрации вири-онов изолятов BY_Minsk_2008_Jan_2*11 и BY_Brest_2008_Feb_7005 составили соответственно 1 и 1,3 lg и существенно не различались.
Результаты изучения устойчивости вирусов к воздействию тепла (70 °С в течение 5 мин) представлены в табл. 2.
Из табл. 2 следует, что обработка образцов в течение 5 мин при 70 °С привела к практически полной инактивации вири-онов штамма HAV027 и изолятов ВГА в пробе, в то время как содержание вирусных частиц штамма HAV707 в пробе лишь снизилось на 2,5 lg.
Таким образом, разработана методика АС-ПЦр для детекции вирионов ВГА с учетом результатов реакции методом электрофореза в агарозном геле и в режиме реального времени. Методика позволяет выявлять вирионы ВГА, имеющие в своем составе нуклеопроте-идный комплекс, в том числе в средах с высоким содержанием ингибиторов ПЦР. Стандартизация и автоматизация иммунологического этапа реакции с помощью оборудования для ИФА обеспечивает более высокую эффективность этой методики.
Методика АС-ПЦР реализована в разработанных в РНПЦ эпидемиологии и микробиологии диагностических препаратах: «Набор для обнаружения вируса гепатита А методом антигенсвязыва-ющей полимеразной цепной реакции (АС-ПЦР ВГА)» и «Набор контрольных образцов РНК вируса гепатита А (НКО РНК ВГА)».
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Плотникова К.Ю., Виринская А.С., Гудков В.Г. // Современные проблемы инфекционной патологии человека (эпидемиология, клиника, вирусология, микробиология и иммунология). Материалы НИИ эпидемиологии и микробиологии по итогам выполнения ГНТП «Инфекции и медицинские биотехнологии» 2001-2005. - Минск, 2005. - С. 255-260.
2. Abd El Galll K.H., El Sokkary M.A., Kheira SM et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - Vol. 70, N 7. -P. 4371-4374.
3. Amon J.J., Devasia R., Xia G. et al. // J. Infect. Dis. -2005. - Vol. 192, N 8. - P. 1323-1330.
4. ArnalC., Feire-Aubineau V., Mignotte B. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - Vol. 65, N1. - P. 322326.
5. Cromeans IL., Nainan O.V., Margolis H.S. // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - Vol. 63, N 6. - P. 24602463.
6. De Paula V.S., Diniz-Mendes L., Villar L.M.
et al. // Water Res. - 2007. - Vol. 41, N 6. -P. 1169-1176.
7. Deng M. Y, Day S. P., Cliver D. O. // Appl. Environ. Microbiol. - 1994. - Vol. 60, N 6. - P. 1927-1933.
8. Graff J., Ticehurst J, Flehmig B. // Appl. Environ. Microbiol. - 1993. - Vol. 59, N 10. - P. 3165-3170.
9. Guevremonta E, Brassardb J., Houdeb A. et al. // Journal of Virological Methods. - 2006. - Vol. 134, N 1-2. - P. 130-135.
10. Jansen R.W., Siegt G, Lemon S.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1990. - Vol. 87. - P. 2867-2871.
11. Jothikumar N, Cliver D.O., Mariam TW. // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol. 64, N 2. - P. 504-508.
12. MelnbkJ.L. // Vaccine. - 1992. - Vol. 10, N 1. - P. 24-26.
13. Normann A.,, Graff J., Flehmig B. // Vox Sang. -1994. - Vol. 67, N l. - P. 57-60.
14. Normann A., Jung C, Vallbracht A. et al. // J. Med. Virol. -2004. - Vol. 72, N 1. - P. 10-16.
15. Shan X.C., Wolffs P., Griffiths M. W. // Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - Vol. 71, N 9. - P. 5624-5626.
16. Traore O, Arnal C, Mignotte B. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol. 64, N 8. - P. 3118-3122.
Поступила 26.07.2011 г.
Резюме
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩЕЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА А Плотникова К.Ю., Гудков В.Г., Виринская А.С.
РНПЦ эпидемиологии и микробиологии, Минск Разработана методика антигенсвязывающей ПЦР (АС-ПЦР) для детекции вируса гепатита А (ВГА) с учетом результатов реакции методом электрофореза в агарозном геле и в режиме реального времени, изучена ее эффективность. Методика позволяет выявлять вирионы ВГА, имеющие в своем составе нуклеопротеидный комплекс, в том числе в средах с высоким содержанием ингибиторов ПЦР. Стандартизация и автоматизация иммунологического этапа реакции с помощью оборудования для ИФА обеспечивает более высокую эффективность этой методики. Методика АС-ПЦР реализована в разработанных в РНПЦ эпидемиологии и микробиологии диагностиче-ских препаратах: «Набор для обнаружения вируса гепатита А методом антигенсвязывающей полимеразной цепной реакции (АС-ПЦР ВГА)» и «Набор контрольных образцов РНК вируса гепатита А (НКО РНК ВГА)».
Ключевые слова: • вирус гепатита А, ВГА, ПЦР АС-ПЦР.
Summary
IMPROVEMENT OF ANTIGEN-BINDING POLYMERASE CHAIN
REACTION IN DETECTION
OF HEPATITIS A VIRUS
Plotnikova KY, Gudkov VG., Virinskaya A.S.
Republican Scientific Practical Centre
of Epidemiology and Microbiology, Minsk
The technique of the antigen-capture PCR (AC-PCR) method for
the detection of hepatitis A virus (HAV) with detection results by
agarose gel electrophoresis and real-time PCR was developed
and its effectiveness was studied.
The technique allows to detect HAV virions that contain
nucleoprotein complex, including samples with a high content
of PCR inhibitors. Standardization and automatization of the
immunological stage of reaction by applying the equipment for
ELISA provides a higher efficiency of this technique.
AC-PCR technique is implemented in diagnostic preparations
developed RSPC Epidemiology and Microbiology:
«Kit for the detection of hepatitis A virus by antigen-capture
polymerase chain reaction» and «Hepatitis A virus RNA control
samples kit».
• Keywords:
hepatitis A virus, HAV PCR, AC-PCR.
Лебедько А.В., Дармоян Н.А., Воробей Н.А., Милюк Н.С., Жуковская С.В.
Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск Юродской клинический родильный дом № 2, Минск 6-я городская клиническая больница, Минск
Профилактика кровотечений при оперативном родоразрешении беременных после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО)
Одним из наиболее важных и актуальных аспектов планирования семьи является лечение бесплодия, дающее возможность иметь желанных детей. Репродуктивная проблема становится актуальной для все большего числа стран. Бесплодные браки, доля которых составляет 10-15% от всех заключенных браков, - проблема медико-социальная.
Демографическая ситуация во многих странах мира ставит проблему бесплодного брака в ряд наиболее важных в современной медицине. В мировой литературе считается, что при частоте бесплодных браков более 15% проблема бесплодия приобретает государственное значение. В Республике Беларусь по статистическим данным 2010-2011 гг. зафиксировано до 18% бесплодных супружеских пар.
В последние годы наблюдается тенденция к увеличению частоты бесплодных браков. Причины, приводящие к этому, многообразны. Наряду с наличием генетической детерминированности
ряда эндокринных нарушений, ведущих к возникновению бесплодия, все большую роль играют социальные факторы и особенности репродуктивного поведения. Определенную роль играет и соматическая патология женщин, прежде всего нарушения сердечно-сосудистой системы функционального плана, ограничивающие подходы в лечении бесплодия, проведение хирургической коррекции и наркозного пособия и т.д.
Ухудшение экологической обстановки, стрессы, технологизация быта и другие факторы неблагоприятно влияют на репродуктивное здоровье, но в то же время именно развитие высоких технологий позволяет внедрять в практику новые методы восстановления функции деторождения. Основным научным достижением, позволившим решить проблему лечения бесплодия, стала разработка и внедрение в клиническую практику методов ЭКО.
Пациенток с наступившей маточной беременностью ведут в соответствии с принципами современного акушерс-
тва как женщин группы риска. При наблюдении за женщинами, прошедшими значительную гормональную нагрузку в программе ЭКО, обращают на себя внимание разнообразные субъективные жалобы и объективная симптоматика нарушений сердечно-сосудистой системы, особенно выраженная при наступившей маточной беременности малых сроков.
Эффективность ЭКО снижается у пациенток с длительным бесплодием, нередко сочетающимся с различными гинекологическими и экстрагенитальны-ми заболеваниями, в том числе заболеваниями сердечно-сосудистой системы. Наступление беременности высокого риска после ЭКО объясняет использование оперативного метода родоразрешения с целью избежать родового травматизма. Частота кесарева сечения после лечения бесплодия методом ЭКО значительно выше, чем в популяции, и колеблется от 41 до 86% [1]. Абдоминальное родоразреше-ние на фоне отягощенного акушерского
