CC BY
200
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА ГЕПАТИТА А (аналитический обзор)
В аналитическом обзоре приведены обобщенные литературные данные о строении вируса гепатита А, структурной организации его генома; функциональном значении протеинов, кодированных различными регионами вирусной РНК. Особое внимание уделено изменчивости вируса гепатита А в пространстве и времени, а также распространенности его генотипов в мире и России. Описаны наиболее широко применяемые молекулярно-генетические методы диагностики гепатита А. Приведены фундаментальные методологические преимущества использования молекулярно-генетических методов исследования по сравнению с диагностикой инфекции, основанной на выявлении иммуноглобулинов классов М и й. Описана значимость качественного и количественного обнаружения РНК в различных субстратах и объектах внешней среды, генотипирования, определения и анализа последовательности отдельных участков генома вируса гепатита А для решения вопросов диагностики и эпидемиологического надзора за этой инфекцией.
Аналитический обзор предназначен для специалистов Роспотребнадзора, врачей клинической лабораторной диагностики, эпидемиологов, вирусологов, инфекционистов, слушателей курсов усовершенствования врачей, студентов.
Ключевые слова: гепатит А, ПЦР, генотипирование.
А.А. Залесских, Т.Н. Быстрова,
ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной»
Быстрова Татьяна Николаевна -e-mail: [email protected]
This review presents digested literature data about structure of hepatitis A virus (HAV), its genome organization, and functions of the proteins encoded in different parts of the genomic RNA. Authors focus on variability of the virus in time and space and distribution of HAV genotypes in the world and Russian Federation. The article shows fundamental advantages of molecular diagnostic methods and compares them to classic immunoassays based on detection of antibodies of various classes. Authors emphasize importance of detection of viral RNA in various substrates and limited genome sequencing is diagnostics and epidemiology. This review is advised for epidemiology, infectious disease and clinical diagnostic laboratory specialists, virologists, medical school students.
Key words: hepatitis A, PCR, genotyping.
1. ВВЕДЕНИЕ
Вирусный гепатит А (ГА) - антропонозное инфекционное заболевание с фекально-оральным механизмом передачи с первичным поражением печени и синдромом интоксикации. В большинстве случаев протекает без ярко выраженных симптомов и желтухи, хотя не исключены и тяжелые формы заболевания, особенно при наличии другой патологии печени.
Гепатит А до настоящего времени относится к массовым заболеваниям человека как в мире, так и в нашей стране. Для этой инфекции характерно неравномерное распределение заболеваемости ГА как на территории России, так и в мире.
Несмотря на выраженную тенденцию к снижению официально регистрируемой заболеваемости гепатита А в России до настоящего времени эта инфекция остается актуальной для большинства территорий страны. В течение последнего десятилетия произошли существенные
изменения эпидемического процесса гепатита А, выразившиеся в первую очередь в значительном снижении его интенсивности, преобладании вспышечной заболеваемости, изменении возрастной структуры заболеваемости. Последний подъем заболеваемости ГА в России имел место в 2001 г., когда показатель составил 79,40/0000. Все последующие годы интенсивность эпидемического процесса поступательно снижалась и в 2011 г. достигла самого низкого за все годы наблюдения (с 1955 г.) уровня при показателе заболеваемости всего 4,290/0000. Тем не менее этот показатель можно считать лишь условно низким. Например, в США территории с низким показателем заболеваемости ГА 10 и более на 100 000 населения считаются эпидемическим неблагополучными. В этих районах проводятся специальные целенаправленные профилактические и противоэпидемические мероприятия [1].
Как и в предыдущие годы, ГА характеризуется повсеместным, но неравномерным распространением. Поэтому
общероссийские показатели не отражают особенности эпидемического процесса инфекции в отдельных регионах, среди которых остаются территории с высокой заболеваемостью. По опубликованным данным в 2010 г. на 24 территориях РФ уровень заболеваемости ГА составил 5-9,90/0000, на четырех - 10-19,90/оооо, а в Чеченской Республике и Республике Тыва - 49,20/0000 и 13,70/0000 соответственно. До сих пор малоизученным остается вопрос о причинах столь контрастного распределения гепатита А [2].
До настоящего времени сохраняется вспышечная заболеваемость, причем водный путь передачи является ведущим, обуславливая до 62,6% случаев ГА. Так, в 2010 году зарегистрировано 36 вспышек с числом пострадавших 1283 человека, обусловленных действием преимущественно водного и пищевого путей передачи [1].
Таким образом, относительно высокий по сравнению с регионами с низкой эндемичностью эпидемического процесса уровень заболеваемости, повсеместное распространение, значительная пораженность работоспособного населения - как результат «повзросления», увеличение доли среднетяжелых и тяжелых форм инфекции, многочисленные за последние годы вспышки (особенно водного характера) свидетельствуют о высокой эпидемиологической и социально-экономической значимости гепатита А для нашей страны. Гепатит А по праву относят к социально обусловленным инфекциям, на эпидемический процесс которого влияют неблагоприятные экологические факторы, техногенное загрязнение атмосферного воздуха, источников водоснабжения и изношенность инфраструктуры.
Как и при других инфекциях с полиморфной клиникой, решение эпидемиологических аспектов проблемы гепатита А во многом определяется возможностями используемых методических подходов. До настоящего времени для детекции специфических маркеров гепатита А в эпидемиологическом надзоре широко применяют метод иммуно-ферментного анализа (ИФА). Разработка молекулярно-генетических методов, включая полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и секвени-рование, открывает новые перспективы в изучении эпидемического процесса и организации надзора и контроля за этой инфекцией [2].
2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА ГЕПАТИТА А
Вирус гепатита А (ВГА) относится к роду Hepatovirus в составе семейства Picornaviridae. Первоначально ВГА относили к роду Enterovirus, но он был выделен в отдельный род. В отличие от других представителей семейства, данный вирус более устойчив во внешней среде, а также медленно размножается в клеточных культурах, требуя больше времени и штаммов вируса, адаптированных к
росту in vitro. Вирус гепатита А при трансляции своего генома использует клеточный фактор инициации трансляции eIF4G, поэтому не инактивирует синтез собственных белков клетки в процессе своего цикла, что приводит к отсутствию цитопатического эффекта и еще больше осложняет культивирование [3].
Гепатит А характеризуется первичным поражением печени, что можно объяснить патогенезом заболевания. ВГА проникает в кровь через эпителий желудочно-кишечного тракта, активно размножается в гепатоцитах, откуда переносится с током желчи в просвет кишки и попадает во внешнюю среду, в дальнейшем реализуя фекально-оральный механизм передачи. Функция печени страдает как от прямого воздействия вируса, так и от возникающего иммунного ответа на инфекцию. Виремия и выделение вируса с фекалиями во внешнюю среду начинаются в конце инкубационного периода до появления симптомов и до повышения уровня печеночных трансаминаз. Было показано на лабораторных животных, что ВГА в наибольшем количестве определяется в фекалиях и сыворотке крови. Однако он может определяться и в слюне, хотя в 100 раз меньшей концентрации. РНК отрицательной цепи генома определялась не только в печени, но и во многих тканях, включая слюнные железы, миндалины, мезенте-риальные лимфоузлы. Этот маркер присутствует в клетках только в момент репликации вируса и отсутствует в вири-онах, поэтому является специфическим признаком репликации, а не просто наличия вируса в субстрате. Ее наличие может указывать на внепеченочные локализации репликации вируса гепатита А [4].
Для внедрения в клетку ВГА взаимодействует со специфическим рецептором HAVcr1 (также известным, как TIM1), впервые открытым на поверхности клеток почек африканских зеленых обезьян (AGMK), используемых для культивирования. Был также обнаружен близкородственный (79% гомологии последовательности гена) рецептор на поверхности клеток различных тканей человека, хотя максимальный уровень его экспрессии отмечен в клетках почек и яичек, а не в гепатоцитах, что подтверждает возможность внепеченочной репликации. Отсутствие такого рецептора или наличие негомологичной молекулы делает невозможным заражение такой клетки как адаптированным к культуре клеток, так и диким типом вируса гепатита А. Блокирование этого рецептора моноклональ-ными антителами также предотвращает возможность инфицирования клеток вирусом, а внедрение рекомби-нантного гена рецептора в клетки, нечувствительные к ВГА инфекции, наоборот, вызывало ограниченное размножение ВГА в них. Рецептор представляет собой гликопротеин, интегрированный во внешнюю мембрану клеток, с муци-ноподобным и иммуноглобулиноподобным доменами,
где последний играет роль лиганда вируса [5]. Известно, что данный рецептор несет костимулирующую функцию для активации иммунных Т-киллеров и известен в патогенезе бронхиальной астмы и аллергии. Взаимодействие вируса с рецептором было воспроизведено с помощью искусственных растворимых фракций этого рецептора. Показано, что оптимальное взаимодействие лиганда и рецептора происходит при t 37°С, в присутствии ионов кальция и при рН в диапазоне 5-8 с оптимумом около 7, что соответствует внутренним условиям организма, а широкий спектр рН необходим для сохранения адгезии вируса к клеткам в разных отделах желудочно-кишечного тракта [6].
Длительность выделения вируса во внешнюю среду варьирует и сильно зависит от чувствительности метода выявления возбудителя. При сравнении сроков экскреции вируса методами ИФА, ПЦР с детекцией в геле, окрашенном бромидом этидия, и ПЦР с гибридизационной детекцией в фекалиях 18 больных гепатитом А наблюдалась прямая связь между длительностью выделения и чувствительностью. Последовательные образцы стула были положительны на антиген ВГА в течение 24 дней после пика аминотрансфераз. ПЦР с детекцией путем окраски этидия бромидом детектировала РНК в течение 34 дней, а ПЦР с гибридизационной детекцией с ДНК зондом - в течение 54 дней. Стоит отметить, что после заражения лабораторных тамаринов всеми тремя типами образцов стула, только тамарины, получившие положительные в ИФА (и соответственно в обоих типах ПЦР) образцы имели развившуюся ВГА-инфекцию. Животные, получившие для заражения пробы, положительные только в ПЦР, или же положительные только в ПЦР с гибридизационной детекцией, не имели признаков сероконверсии или поражения печени. Такие данные совпадают с эмпирической оценкой снижения эпидемиологической опасности больных гепатитом А после развития желтухи. Это может быть следствием наличия большой части поврежденного вируса в фекалиях (деградированные вирионы, комплекс вируса с иммуноглобулинами и т. п.) на поздних стадиях инфекции или отличием течения инфекции у животных, что повлияло на результаты эксперимента. Подобные данные получены и М.И. Попковой (2006), где к моменту выписки больных ГА из стационара РНК вируса определялась в 90,6±5,2% и 56,3±8,8% в фекалиях и сыворотке крови соответственно. Таким образом, наличие РНК в пробе фекалий может не означать безусловной инфекционной опасности материала [7,2].
Позитивные тесты при отсутствии инфекционного потенциала выявляются и при исследовании действия активного хлора (хлорсодержащие реагенты широко применяются в практике) на вирус, антигенная активность в
ИФА со временем экспозиции/увеличением концентрации падала медленнее, чем детекция РНК, что указывает на то, что капсидный белок более устойчив к дезинфек-тантам, чем другие части вируса. Опыты на культуре клеток показали, что 30 минутная экспозиция хлора в концентрации 10 до 20 мг/л полностью инактивировала у ВГА способность заражать клетки. Детекция 5'-нетранслируе-мого (5'-НТР) региона генома (в первую очередь на участке с 1 по 675 н.п.) методом ПЦР также становилась отрицательной при такой экспозиции. При этих условиях тесты на антиген (ИФА) и некоторые регионы генома в пределах открытой рамки считывания (ПЦР) оставались положительными. Такие данные необходимо учитывать при выборе методов оценки эффективности дезинфекции и оценки биологической опасности объектов внешней среды [8].
2.1. Строение вириона
Вирус гепатита А был обнаружен группой ученых Feinstone с соавторами) в 1973 г. методом иммунной электронной микроскопии в экстрактах фекалий больных гепатитом, обработанных с сывороткой крови переболевших людей. Этому предшествовали поиски инфекционного агента путем попыток заражения добровольцев различными биологическими субстратами [9].
ВГА является маленьким безоболочечным вирусом, при иммуно-электронном микроскопировании которого были обнаружены частицы двух типов ж «пустые» (без РНК) и «полные» диаметром 27-32 нм, не имеющие оболочки с признаками икосаэдрической симметрии.
РИС. 1.
Схема капсида ВГА.
Капсид расположен непосредственно вокруг РНК и состоит из 12 пентамеров, каждый пентамер в свою очередь собирается из 5 копий белков VP1, VP2 и VP3. VP4 находится на стороне, обращенной к РНК. Белок VPg присоединен к 5'-области молекулы РНК.
2.2. Организация генома
Геном вируса гепатита А состоит из одноцепочечной линейной молекулы РНК, выполняющей матричную функцию (плюс-цепь). Длина генома составляет около 7500 нуклеотидов. Имеется только одна рамка считывания, соответственно разделяющая геном на три области -
5'-НТР (нетранслируемая область), рамка считывания и короткая 3'-НТР, заканчивающаяся полиадениловым трактом. В генетическом коде отмечается более частое использование редких кодонов, чем у других энтеровиру-сов (22 редких кодона против 8 у полиовируса и 2 у вируса ящура), что влияет на скорость синтеза вирусного полипептида. Предполагается, что это является одной из причин медленного роста вируса в культуре, а также повышенной стабильности капсида во внешней среде [3]. Возможно, что при репликации в гепатоцитах подобные кодоны позволяют уменьшить конкуренцию за тРНК клетки, т. к. при ВГА инфекции клеточный биосинтез белка не подавляется.
5'-НТР регион является самым консервативным участком генома со своей сложной вторичной структурой. Начальные 94 нуклеотида формируют вторичную структуру РНК в виде узлов, напоминающих лист клевера. Этот участок связан с вирусным белком VPg и является критичным для репликации РНК. Дальше до позиции 138 простирается богатый пиримидиновыми основаниями участок с высокой стойкостью к РНКазам. С нуклеотидной позиции 153 и до стартового кодона находится IRES - внутренний сайт посадки рибосом. Этот домен необходим для кап-независимой инициации трансляции. 5'-НТР является регионом выбора из-за своей консервативности при создании коммерческих ПЦР тест-систем выявляющих ВГА.
2.3. Функции белков и морфогенез вириона
Как и у остальных пикорнавирусов, единственная открытая рамка считывания генома кодирует структурные и неструктурные белки, синтезируемые в виде одного
полипептида с последующим разрезанием на отдельные структурные и неструктурные белки вирусной протеина-зой. В отличие от других родов семейства у ВГА имеется только одна цистеиновая протеиназа [10].
Схема на рисунке 2 и таблица 1 изображает последовательное превращение полипротеина в конечные белки и соответствие белков регионам генома.
ТАБЛИЦА 1.
Характеристика белков ВГА
Участок генома Нуклеотидные Аминокислотные позиции позиции Описание
Р1 735-3029 1-765 Капсидные белки
1А 735-803 1-23 VP4
1В 804-1469 24-245 VP2
1С 1470-2207 246-491 VP3
1D 2208-3029 492-765 VP1
Р2 3030-5000 766-1422 Неструктурные белки
2А 3030-3242 766-836 Встроен в капсид, морфогенез
2В 3243-3995 837-1087 Репликация РНК
2С 3996-5000 1088-1422
РЗ 5001-5222 1423-1496 Неструктурные белки
ЗА 5001-5222 1423-1496 Pre-VPg
ЗВ 5223-5291 1497-1519 VPg
ЗС 5292-5948 1520-1738 Протеаза
3D 5949-7415 1739-2227 РНК-полимераза
Структурные белки
Изучение точных сайтов разрезания исходного полипротеина ВГА осложнено тем, что в своем цикле развития вирус не угнетает синтез белка клетки, что не приводит к исчезновению клеточных ферментов, которые могут влиять на сборку вириона. В отличие от других пикорнавирусов,
РИС. 2.
Организация генома и белки ВГА.
созревание ВГА зависит от своей единственной протеина-зы 3С, которая проводит расщепление первичного единого полипептида на отдельные белки. Первичным сайтом для нее является точка соединения белков 2А-2В [11]. Получившийся фрагмент всех структурных регионов Р1 с присоединенным 2А затем этой же протеиназой разделяется на VP0 (содержит VP4-VP2), VP3 и VP1-2A [10].
Незрелый капсид образуется из четырех структурных белков VP1-4 с фрагментом неструктурной области 2А. VP2 и VP4 встраиваются в капсид в виде общего белка-предшественника VP0, но в зрелом вирионе VP4 на поверхности уже не представлен, так как в отличие от других пикорнавирусов он на две трети короче своих гомологов и участвует только в процессе созревания вириона. У рекомбинатных вирусов с отсутствующим VP4 агрегация пентамеров вириона в целый капсид не наблюдалась. В зрелом капсиде этот белок может быть найден только на внутренней стороне, обращенной к РНК [12]. VP4 необходим для освобождения РНК после проникновения вириона в клетку.
Участок 2А, в отличие от других пикорнавирусов, не является протеиназой и не участвует в созревании вирусного полипептида, а предположительно остается прикрепленным к белку VP1 или отрезается позже по ходу созревания капсида неизвестной клеточной протеазой, но не вирусной протеиназой 3С [13,14]. Предполагается, что он необходим для морфогенеза капсида у ВГА. Как и VP4, он участвует в созревании вириона, но на более ранней стадии создания отдельных пентамеров [12]. Для изучения роли 2А группа авторов вносила делеции аминокислот участка 2А в плазмидах с последующим встраиванием в полный геном вируса, с дальнейшей экспрессией полученных мутантов в клетках. Далее активность роста вируса изучалась на культуре методом иммунофлюоресценции [15]. Полученный в культуре мутантный вирус вводился обезьянам. Показано, что делеция даже 10-15 аминокислот в центре участка приводит лишь к слегка сниженному уровню репликации вируса в культуре клеток, а также к меньшему выделению вируса с фекалиями у зараженных обезьян, хотя и успешное инфицирование, и сероконвер-сия имели место. Делетированные по соединению 2А-2В варианты при иммуноблоте синтезированного белка показывали отсутствие протеолиза предшественника VP1 на зрелые белки вириона и отсутствие прогрессии вируса в культуре.
Позже были произведены уточненные эксперименты с 11 вариантами делетированных в разных точках гена 2А мутантов. Конструкции включали полностью делетиро-ванный 2А, а также варианты с делецией отдельных частей от Оконца к С-концу участка [10]. Первые 40% Оконца участка 2А были критическими для репликации,
пентамеры капсида не образовывались, в отличие от слегка сниженной прогрессии вируса у делетированных по 60% последовательности С-конца 2А, но без затрагивания соединения 2А-2В. Полностью делетированный по 2А вирус также оказался нежизнеспособен. Таким образом, вконец 2А содержит домен, который, наиболее вероятно, участвует в правильном фолдинге предшественника капсида.
Экспериментально было выяснено, что помимо внесения делеций в различные участки структурного участка Р1 генома ВГА капсид способен вместить дополнительные 600 пар нуклеотидов генома. Такие дополнительные экзогенные последовательности удалось разместить в местах генома, некритичных для сборки ферментов вируса и капсида. Вставки находились в месте соединения 2А-2В, где происходит расщепление полипротеина после его синтеза, и в 5'-НТР, вне пределов полипротеина, сайта рибосом и стартового кодона [16,17]. Такие искусственные вставки могут быть использованы для создания искусственных вакцинных штаммов или изучения вируса.
Неструктурные белки
2В и 2С участвуют в репликазном комплексе, 2В в роли якоря комплекса на мембране, а 2С обладает хеликазной активностью.
3А и 3В являются соответственно предшественником и собственно белком VPg, который присоединяется к 5'-концу вирусной РНК.
3С - цистеиновая протеиназа для разрезания полипротеина после его синтеза для дальнейшей сборки вириона. Изучение ее активности проводили на бесклеточно био-синтезированном полипептиде с вирусной модифицированной РНК и рекомбинантной очищенной протеиназой 3С. Было установлено, что первое разделение белков происходит к точке соединения 2А-2В под действием вирусной протеиназы 3С в аминокислотной позиции 273-274 ^1и^ег) белка VP1. Причем замена аминокислоты на валин перед серином, которая наблюдается у некоторых аттенуированных штаммов, приводит к снижению про-цессинга полипептида в этом месте [18]. Помимо этого первичного сайта протеиназа 3С также разрезает полипептид во всем регионе Р2, давая начало всем его индивидуальным белкам, а также 3С-3D [19].
3D - РНК-зависимая РНК полимераза для репликации генома вируса на матрице РНК.
3'-НТР так же, как и 5'-НТР, имеет вторичную и третичную структуры с точно неизвестными функциями. Предположительно, он необходимы для узнавания репликазным комплексом матричной РНК. Этот регион заканчивается полиадениловым трактом, как и все эука-риотические мРНК.
3. ИЗМЕНЧИВОСТЬ ВИРУСА
И РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ГЕНОТИПОВ
Вирус гепатита А имеет только один серотип, обладая относительно низкой антигенной изменчивостью. Это достигается за счет низкой частоты смысловых замен нуклеотидов, в результате которой антигенные детерминанты, расположенные в регионах VP1 и VP3, остаются неизменными, несмотря на относительно высокую вариабельность генома этих в участках. Вероятно, низкая частота смысловых мутаций является эволюционной адаптацией, так как замены аминокислот приводят к изменению фолдинга капсидных белков и снижению жизнеспособности таких вариантов ВГА. Участки связывания антител могут находиться внутри или рядом с доменами связывания клеточных рецепторов, изменение конформации которых критично для взаимодействия вируса с клеткой. Таким образом, малая аминокислотная изменчивость может обусловливать наличие только одного серотипа. Также вокруг иммунодоминантных участков часто встречаются уже упомянутые редкие кодоны, замедляющие синтез белка и способствующие правильному фолдингу вирусных поверхностных протеинов, приводя к их неправильной функции. Мутация внутри таких кодонов может изменять фолдинг без замены аминокислоты, приводя к такому же отрицательному отбору этих вариантов [20, 21].
Несмотря на это, на культурах клеток удавалось получать антигенные варианты вируса с отсутствием нейтрализации тем или иным анти-ВГА моноклональным антителом, с описанием мутаций в домене, ответственном за этот уход от нейтрализации, а также были выявлены изо-ляты вируса с мутациями вблизи, или внутри этих доменов. Для штамма НМ-175 такие изоляты имели две замены аминокислот в регионе VP3 и три в VP1. А для штамма HAS-15 по три замены в VP1 и VP3. Избегающий нейтрализации штамм иги-3 имеет делецию в три аминокислоты в VP1. Причем замены в обоих штаммах находились в близких или идентичных позициях. Также эти позиции накладываются на уже известные иммуногенные сайты нейтрализации других пикорнавирусов. Такие данные теоретически не исключают возможности появления новых антигенных вариантов вируса гепатита А, особенно под давлением вакцинного иммунитета [21].
Генетическая гетерогенность вируса была выявлена и стала изучаться с середины 80-х годов с помощью различных молекулярных методов, которые постоянно совершенствуются [22, 23]. Несмотря на низкую аминокислотную изменчивость, вирус гепатита А, как и другие РНК-содержащие вирусы, имеет в своем арсенале целый ряд факторов, способствующих накоплению мутаций в геноме. Вирусная РНК-зависимая РНК полимераза не имеет 3'-5' экзонуклеазной активности и не может удалять
неправильно встроенные нуклеотиды, а механизмы репарации клеточной ДНК не работают на РНК. Это приводит к накоплению отличий с каждой репликацией РНК генома вируса, что в свою очередь превращает популяцию вируса в совокупность динамически отличающихся друг от друга квазивидов. Очевидно, что большинство возникающих мутаций подвергается отрицательному отбору, что и приводит к конвергенции последовательностей и меньшим, чему у других РНК-содержащих вирусов, отличиям изо-лятов. В результате при любом секвенировании генома или его участка получается консенсусная последовательность всех попавших в пробу геномов. Доказательством существования квазивидов может являться проведенный анализ молекулярных клонов поверхностных участков капсида VP1 иVP3, полученных после пассажа вируса на культуре клеток, а также из отобранных у больных проб [24]. Последовательности РНК этих клонов содержали мутации, которые были расположены вблизи и внутри редких кодонов. Большинство этих мутаций приводили к замене аминокислот в белке VP3. В то же время мутации, расположенные в регионе, кодирующем белок VP1, чаще были несмысловыми. Это указывает на то, что возникающие мутации поддерживают баланс между эффективностью репликации и правильным фолдингом поверхностных белков вируса.
Первый описанный штамм дикого типа, принадлежащий субтипу IB (НМ-175), геном которого был расшифрован, выделен в 1985 г. в Австралии, успешно культивирован на клетках мармозет и позже принят за референсный штамм при описании аминокислотных и нуклеотидных мутаций. В последующем был проведен анализ вариабельности различных регионов генома ВГА. Эти исследования легли в основу филогенетического сравнения штаммов вируса, выделенных в разных частях мира [25]. При получении данных широко использовалась информация по другим членам семейства Picornaviridae из-за сходства организации генома.
Так, используя, данные о вариабельности участков генома ВГА на С-конце VP3, N-конце VP1 и на стыке VP1 и 2A у 152 изолятов вируса, полученных по всему миру, R. Jansen и В. Robertson (1992) определили наличие 7 генотипов вируса гепатита А [26]. Последовательности, имеющие сходство менее 85%, считаются относящимися к различным генотипам. Генотипы I, II, III, VII были изолированы от больных людей (генотип III также и у обезьян), а IV, V и VI - от обезьян с проявлениями гепатита. Генотипы I и III были разделены на 2 субтипа на основании наличия 7,5% и более различий их последовательностей.
Позже для более глубокого изучения генетического разнообразия ВГА были проведены аналогичные молекулярные исследования, но уже на основе более длинного
участка - целого гена VP1 (900 п.н.), который включает в себя и использованные ранее участки для типирования и вносит дополнительную информацию о поверхностном структурном белке, где находятся и антигенные детерминанты вируса [27]. Межвидовый филогенетический анализ этого региона также подтверждает классификацию родов в семействе Picornaviridae. При анализе 86 изоля-тов со всего мира удалось получить 5 больших родственных групп вместо семи [22,27]. При этом различия между генотипами II и VII оказались не так значительны и их принято считать субтипами одного генотипа: IIA и IIB. Также при исследовании множественных участков структурных белков были выявлены филогенетические признаки рекомбинации между разными генотипами вируса гепатита А [20].
Дальнейшие исследования не выявили взаимосвязи между разными генотипами и тяжестью течения инфекции или другими признаками. Однако, наблюдался более высокий уровень виремии при инфекции IA, чем при других генотипах. Это явление в сумме с более широким распространением IA в мире может свидетельствовать о более эффективной репликации IA субтипа, более высокой концентрации экскретируемого ВГА во внешнюю среду, что приводит к заражению при употреблении меньшего количества инфицированной воды или продуктов. Это положение может подтверждаться и выявлением вспышки не водного характера субтипа IIIA среди инъекционных наркоманов в Санкт-Петербурге. При такой передаче вируса влияние внешней среды на вирус минимально, а заражающая доза велика [28]. Однако, нельзя исключить вероятной более эффективной работы прай-меров количественного теста в случае определения титра вируса IA субтипа [20]. Отмечена бОльшая вариабельность отдельных участков генома IIIA по сравнению с IA, что отдельные авторы тоже связывают с путем передачи IIIA: вспышки среди инъекционных наркоманов, преимущественная циркуляция в тропических странах. Это может объясняться меньшим влиянием внешней среды и, соответственно, с меньшим требованием к устойчивости вируса в ней [29].
В подавляющем большинстве случаев и географически универсально в мире представлен генотип I (80% случаев в мире), а среди его субтипов IA встречается гораздо чаще. Последний был выявлен во многих странах различных континентов: США, Японии, Европе, территории бывшего СССР, в Южной Америке. IB генотип распространен в северной Африке, Бразилии, странах Ссредиземноморья, в Германии [29-33].
Генотип III может поражать как людей, так и некоторые виды приматов, в связи с чем он сначала был отнесен к непатогенному для человека генотипу ВГА. Однако, позд-
нее родственные варианты субтипа IIIA были выявлены в Швеции и других странах Северной Европы во время вспышек ГА у инъекционных наркоманов [29]. Позже стало известно, что IIIA широко распространен и даже доминирует в странах Азии - Индии, Малазии, Шри-Ланке, азиатских республиках бывшего СССР. Коциркуляция IIIA также отмечена и в странах Европы, США, Европейской части РФ как в виде отдельных вспышек, так и в спорадических случаях [20]. Выявлено увеличение доли IIIA за счет уменьшения доминирования IA с течением времени [34]. Согласно литературным данным, изоляты субтипа IIIB встречаются единичных случаях [26].
Генотип II был впервые обнаружен в западной Африке. Литературные данные, касающиеся изолятов генотипа II, слишком малочисленны, чтобы говорить о закономерностях его распространения за пределами западной Африки. IIA субтип встречается и во Франции, куда он был завезен из Африки. Однако в последнее время IIA во Франции встречается и у пациентов без путешествий в анамнезе. Это подтверждается наличием двух (африканского и местного) кластеров среди французских образцов с генотипом IIA, что может свидетельствовать о наличии внутри страны неустановленного источника инфекции, вызванной этим субтипом вируса. Отмечается также, что N-конец белка VP1 среди образцов данного субтипа содержит больше нуклеотидных замен, чем регион VP1-2A. Субтип IIB выявлен только в образцах из Сьерра-Леоне [20, 26].
Помимо определения общих характерных субтипов для развитых стран наблюдается филогенетическая кластеризация с большой степенью гомогенности, характерной для того или иного региона, с возможностью определять эндемичные и завозные штаммы [35]. В европейских странах с низкой эндемичностью и с большим процентом мигрантов при исследовании образцов по географическому признаку у мигрантов доминируют завозные варианты, характерные для стран их проживания. Так, помимо эндемичных штаммов в Испании, Италии присутствуют штаммы из Египта, Туниса, Марокко, в Германии - из Турции [30, 33, 36].
В России в связи с большой протяженностью территории в циркуляции могут обнаруживаться как эндемичные субтипы IA и IIIA, так и завозные. IA доминирует в России, составляя поА.Д. данным Неверова с соавт. (2007) 71% всех изолятов по стране, и характерен для европейской части страны, где циркулирующие изоляты при филогенетическом анализе кластеризуются с европейскими, а IIIA доминирует среди населения Якутии, Тувы, как и в сопредельных азиатских республиках бывшего СССР и других близких к ним странах. Филогенетически все якутские изоляты IIIA принадлежат к 3 подгруппам - двум группам изолятов из Юго-Восточной Азии и одной индийской.
Тщательное наблюдение за циркулирующими штаммами в Санкт-Петербурге в течение длительного срока показало, что помимо типичных IA вариантов в период эпидемического подъема заболеваемости гепатитом А в регионе может быть выявлен и субтип IIIA, причем при филогенетическом анализе изоляты группируются как новые завозные варианты из Европы и Индии, так и старые, замеченные в циркуляции в прежние годы. Единично выявляется и вариант IB египетского кластера, что, вероятно, связано с большим туристическим потоком в эту страну [28, 37-42].
При длительном одновременном наблюдении за циркулирующим как во внешней среде (речная вода, сточные воды), так и у больных гепатитом А вирусом наблюдается малая дискордантность по последовательностям между ними, хотя 100% идентичность выявляется редко [31, 43]. При определении последовательности генома у больных лиц с общим выявленным источником инфекции, как правило, отличий не наблюдается. В связи с этим можно считать, что отсутствие полной идентичности является признаком одновременной циркуляции нескольких штаммов ВГА в одном регионе. Необходимо учитывать, что во время исследования проб из водных объектов, при наличии в воде нескольких штаммов определяться будет консенсус-последовательность из всех вариантов геномов, с учетом их концентраций. В результате изменчивость последовательностей генома, выявленных в таких пробах, будет меньше [30]. При расследовании вспышек могут определяться также один или несколько генетических вариантов [35, 38]. В работе R.M. Pinto с соавт. (2007) выявлена зависимость между заболеваемостью на территории и количеством негенотипи-руемых проб из водных объектов. При низком уровне заболеваемости в водных пробах больших водоемов низкая концентрация (<105 копий/мл) РНК ВГА будет приводить к большому числу негенотипируемых образцов [30].
ТАБЛИЦА 2.
Географическое распространение генотипов ВГА
Субтип Место выявления Публикации
IA Страны Южной и Северной Америки, Африка, Европа, страны Средней Азии, Ближнего Востока, Япония, территории бывшего СССР, доминирует в Европейской части России [26,30,31,32,33,29,38]
IB Африка, Бразилия, страны Средиземноморья, Германия [26,30,31,32,33,29]
IIA Франция, Западная Африка [26,20]
IIB Сьерра-Леоне [26,20]
IIIA Северная Европа, США, Индия, Шри-Ланка, Малайзия, Япония, республики бывшего СССР, азиатские регионы России, доминирует в Якутии, Туве [26,20,34,39,40,41,42]
IIIB Европа, Япония [26]
4. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВГА, ВЛИЯЮЩИЕ НА РАЗВИТИЕ ИНФЕКЦИИ
При анализе ряда случаев фульминантного гепатита А группой ученых под руководством Z. Hussain (2011) отме-
чена более высокая средняя вирусная нагрузка среди таких больных по сравнению с менее тяжелыми формами. При генотипировании проб от больных в Нью Дели (Индия) авторами выявлено преобладание субтипа IIIA [44]. Как выше уже было отмечено, другие авторы отмечают несколько больший уровень вирусной нагрузки и экскреции вируса в случае заражения генотипом IA, чем при других генотипах. Несмотря на то, что более высокая виремия предполагает более тяжелое поражение гепато-цитов, связь между тяжестью течения инфекции и разными субгенотипами вируса не выявлена, хотя больший уровень репликации и распространения может указывать на то, что именно субтип IA обладает наибольшей способностью генома к репликации [20]. Очевидно, существуют более точные генетические детерминанты, чем субтип, которые определяют вирулентность ВГА.
Одним из направлений поиска таких детерминант может быть анализ вариабельности наиболее консервативной части генома - 5'-НТР. Изменения там редки по причине того, что мутации часто приводят к изменению вторичной структуры и снижению репликации РНК. Подобные исследования проводились в Японии, где сравнивалось количество замен нуклеотидов в 5'-НТР и способность вызывать фульминантную или тяжелую форму гепатита у выборки спорадических больных ГА. Вариабельность между полученными последовательностями и референсным штаммом НМ-175 в 5'-НТР наблюдалась в разной степени на всем протяжении региона [45]. Отмечено, что в случае фульминатного гепатита среднее количество нуклеотидных замен в 5'-НТР было ниже, чем в случае тяжелой формы, и существенно ниже, чем среди средних и легких форм. В среднем выявлено 1,8 нуклеотидных замен между позициями 200 и 500 региона 5'-НТР при фульминатной, 2,8 - при тяжелой форме и 5,4 - при средней и легкой формах гепатита А. Меньшая вариабельность в центральном участке 5'-НТР отражает достигнутую оптимальную для высоковирулентных штаммов конфигурацию молекулы РНК в домене IRES, необходимую для трансляции [46]. Однако подобная эффективность, скорее всего, достигается кумулятивно, а не с помощью определенных точечных мутаций, так как не удалось выделить общие для всех анализированных тяжелых форм конкретные нуклеотидные позиции [47]. Однако, уровень репликации ВГА не может бесконечно увеличиваться в процессе естественного отбора мутаций в 5'-НТР. С помощью модельного химерного вируса ВГА, содержащего экзогенный домен IRES, не было выявлено резкого усиления репликации химеры в культуре клеток. Экзогенный домен IRES, заменяющий собой аналогичную область генома ВГА, принадлежал вирусу энцефаломио-кардита ECMV и известен своим высоким уровнем
кап-независимой трансляции in vitro, поэтому он широко применяется в вирусологических экспериментах. Отсутствие характерного эффекта может объясняться тем, что в регуляции трансляции участвует не только домен IRES и 5'-НТР в целом, но и неструктурные вирусные белки. Это может указывать на то, что эволюционно репликация ВГА находится в определенном балансе между максимальной эффективностью размножения и отсутствием массивного цитолиза гепатоцитов. Функционирование печени необходимо для экскреции ВГА с желчью в просвет ЖКТ и во внешнюю среду при фекально-оральном механизме передачи [48].
5'-НТР не является единственным участком генома, который связывают с изменением вирулентности. Аттенуирующие мутации встречаются с разной частотой на протяжении всего генома. Многочисленные исследования показывают, что в процессе пассажей дикого типа ВГА у него накапливаются мутации, которые адаптируют его к культивированию [9, 49, 50]. Одновременно с этим снижается способность вызывать полноценную инфекцию у людей или обезьян в зависимости от изначального штамма. Это указывает на то, что и адаптация к культуре, и вирулентность имеют одну или несколько общих генетических детерминант.
В свою очередь, существуют экспериментальные данные, показывающие роль мутаций в структурном гене 2С при адаптации к культуре клеток [49]. В дальнейших опытах авторы анализировали культуральную активность химер по гену 2С между штаммами HAV/7 и AGM-27. Первый являлся культуральным штаммом, аттенуирован-ным к тамаринам, а второй - диким вирусом, выделенным у больных ГА обезьян этого вида, не адаптированным к росту в культуре клеток. В ходе этих исследований был выявлено, что именно вставка гена 2С определяла фенотип штамма-химеры. HAV/7 со вставкой гена 2С от вируса дикого типа терял свойства культурального штамма, а AGM-27 со вставкой гена 2С от культурального штамма приобретал такие свойства. Для изучения вирулентности химер этими штаммами инфицировали подопытных тамаринов. При заражении аттенуированным штаммом HAV/7 синдром гепатита не определялся, хотя отмечалось появление анти-ВГА антител. В опыте заражения штаммом HAV/7 с геном 2С от вируса дикого типа наблюдалась клинически выраженная инфекция с сероконверсией, детекцией РНК методом ПЦР, повышением аминотранс-фераз в крови, гистологическими изменениями в печени. При более детальном рассмотрении мутаций в различных точках гена 2С тем же методом химерных вирусов было выявлено их кумулятивное влияние на способность к культивированию вируса. Картирование аминокислотных замен показало, что они обнаруживаются в начале и конце
гена 2С с относительно консервативной серединой [50]. Дальнейшее развитие этих экспериментов привело к созданию 14 химерных вариантов, но уже не между различными изолятами вируса, выделенного у зараженных тамаринов, а между двумя типами одного штамма: вышеописанного штамма адаптированного к культуре клеток -HAV/7, и его прямого предка, вируса дикого типа -НМ-175. Разница фенотипов данных вариантов обеспечивается всего 22 аминокислотными заменами, выявленными при секвенировании геномов. Именно эти замены вызывают аттенуирование штамма у тамаринов и увеличение эффективности культивирования. Замены расположены на протяжении всего генома, поэтому для выявления значения отдельных мутаций все 14 химер содержали в своих геномах различные комбинации из вставок генов аттенуированного и дикого типов ВГА. Штаммы исследовались на тамаринах на способность вызывать полноценную инфекцию, с измерением пиков АлАТ и длительности повышенной концентрации в крови, титра вируса в фекалиях, длительности выделения вирусов животными в днях, измерения количества дней до сероконверсии анти-HAV. Результаты подтвердили полученные ранее R. Purcell, S. Emerson (1998) данные о влиянии гена 2С на фенотип вируса, и в дополнение к замене гена 2С свой вклад вносила и вставка участка VP1-2A. Остальные аминокислотные замены не имели влияния на фенотип. Отдельное изменение одного из этих регионов приводило изменению аттенуированности штамма, но далеко не в той степени, когда они были заменены одновременно. Также только одновременное наличие двух регионов дикого типа, встроенных в геном аттенуированного штамма ВГА, вызывало серьезные гистопатологические изменения в печени и сопровождалось максимальными уровнями амино-трансфераз. Наличие хотя бы одного из двух регионов вируса дикого типа существенно уменьшало время со дня введения инфекции до сероконверсии. Обнаружено, что изменения в VP1-2A в отдельности влияли больше на атте-нуирование, а 2С - на способность к росту в культуре, несмотря на эффект суммирования. Выявлено, что аминокислотная замена в гене 2В (позиция 3998), не несущая в отдельности изменений фенотипа, в сумме с измененным 2С давала сильный суммарный эффект роста в культуре клеток [51].
Такое разнообразие комбинаций свойств на культуре клеток и в биологических пробах подразумевает разные условия влияния продуктов этих генов - 2С и VP1-2A на жизнеспособность вируса in vitro и in vivo. Это косвенно может подтверждаться и тем фактом, что после заражения тамаринов аттенуированными химерами в половине случаев замены в 2С ревертировали к дикому типу. Возможно, что некоторые мутации гена 2С, возникающие
при пассаже ВГА на культуре клеток, являются предметом отрицательного естественного отбора в условиях заражения организма. Это приводит к генетической нестабильности региона 2С и даже один пассаж in vivo такого аттену-ированного штамма может частично вернуть свойства дикого типа. Можно предположить, что при длительной циркуляции в человеческой популяции вирулентность ВГА не является постоянной.
Поскольку в инфекционном процессе патоген взаимодействует с организмом хозяина, а поражение печени происходит не только вследствие репликации вируса, но и иммунного ответа на нее, то нельзя связывать особенности проявления и тяжесть инфекции исключительно с патогеном, исключив особенности самого организма. Тяжесть протекающей ГА инфекции не всегда связана исключительно с уровнем виремии. Также помимо известных сопутствующих факторов, как уже имеющаяся печеночная патология, ВИЧ-инфекция, алкоголизм, аутоиммунные заболевания, существуют и более скрытые наследственные предрасположенности. Примером такого влияния на тяжесть заболевания может быть полиморфизм рецептора HAVcrl (TIM1) в популяции людей. Этот рецептор используется вирусом для прикрепления к клеточной стенке и дальнейшего проникновения внутрь клетки. Хотя связывание происходит с иммуноглобулиновым доменом этого гликопротеина, муциновый домен имеет важную функцию в позиционировании этого рецептора на поверхности клетки [5]. Растворимые фракции этого рецептора эффективно нейтрализуют заражение культуры клеток вирусом гепатита А, но только если муциновый домен рецептора имеет достаточную длину [52].
В популяции людей существует полиморфизм в виде более короткого и более часто встречающегося муцинопо-добного домена этого рецептора, и более длинного редко встречающегося рецептора, со вставкой из 6 аминокислот в аминокислотной позиции № 157 в муциновом домене. Исследование больных тяжелыми формами ГА инфекции показали увеличенную частоту встречаемости аллеля с аминокислотной вставкой в рецептор HAVcrl по сравнению с контрольной группой. Это указывает на то, что вставка увеличивает длину рецептора, приводя к более тяжелой форме гепатита А, и одновременно является предметом естественного отбора, в связи с чем и встречается в гомозиготном состоянии популяции реже.
Таким образом, к настоящему времени получены обширные сведения о строении и жизнедеятельности ВГА и его генетическом разнообразии, разработаны и используются различные методы его детекции и характеристики. Установлена роль изменчивости как отдельных генов (2С и VP1-2A), так и генома в целом в развитии инфекции. Однако полученные знания не позволяют выявить связь
между отдельными нуклеотидными или аминокислотными заменами и их функциональным значением, а также влиянием на свойства возбудителя инфекции.
5. ХАРАКТЕРИСТИКА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А
Как правило, основой для всех молекулярно-генетиче-ских методов исследования ВГА является полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией. В зависимости от целей и уровня оснащенности лаборатории используются различные методики учета результатов ПЦР [53]:
- ПЦР с видоспецифическими праймерами. Этот вид ПЦР с различными методами детекции (электрофорез, flash детекция, real-time) обычно используется для качественного и количественного определения наличия РНК ВГА в различных субстратах (кровь, фекалии, биоптаты, слюна) и объектах внешней среды (пробы сточной и водопроводной воды, водоемов, смывы с различных поверхностей). В качестве мишени выбираются наиболее консервативный регион генома вируса: 5'-НТР;
- ПЦР с типоспецифическими праймерами. Для данной методики для амплификации выбирается один или несколько наиболее вариабельных участков генома вируса (VP1-2A, 2C), при этом в смеси реакции присутствует три праймера, отжигающихся на разных участках выбранного региона в зависимости от генотипа. Таким образом, на геле при электрофорезе можно получить продукты различной длины;
- антигензависимая ПЦР. При данной методике вначале проводится захват сорбированными на твердой фазе антителами вирусных частиц, а после отмывки несвязав-шихся реагентов проводится ПЦР. Это позволяет увеличить концентрацию вируса при одновременной очистке от неспецифических мишеней;
- анализ полиморфизма рестрикции ПЦР-продуктов (RFLP). После амплификации ПЦР-продукт подвергается действию определенных ферментов рестрикции, которые распознают уникальные комбинации нуклеотидов (сайты). Отличия в нуклеотидных последовательностях разных генотипов создают или разрушают сайты ректрик-таз. В результате действия этих ферментов получаются отрезки ДНК разной длины на электрофорезе;
- анализ конформационного полиморфизма одноцепо-чечной ДНК (SSCP). Фрагменты изучаемого гена длиной несколько сотен нуклеотидов амплифицируют с помощью ПЦР, денатурируют и подвергают электрофорезу. Анализ электрофореграмм позволяет выявить мутации, поскольку они меняют электрофоретическую подвижность фрагментов в геле при электрофорезе;
- гибридизация с типоспецифическими олигонуклео-тидными зондами. При наличии меченых (радио- или
флуоресцентной метой) зондов и переносе кДНК с геля на фильтр можно выявить наличие на нем ДНК нужного размера и взаимодействующей со специфичным комплементарным зондом с меткой. Анализ обладает большей специфичностью, поскольку помимо размера молекулы ДНК оценивается ее способность связывать зонд;
- секвенирование участков генома. Определение последовательности нуклеотидов в геноме дает исчерпывающую информацию об изменчивости патогенов вообще, не только вирусов в общем, и ВГА в частности. Применяются несколько различных методов секвенирования как полных геномов, так и их отдельных частей, представляющих интерес. Полученные уникальные последовательности и сопутствующая информация депонируется и хранится в Genbank. Анализ и сравнение полученных с референсны-ми последовательностями проводится с помощью различных специализированных программ с построением филограмм.
6. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМ НАДЗОРЕ ЗА ГЕПАТИТОМ А
Решение различных аспектов проблемы ГА инфекции, в том числе для целей эпидемиологического надзора, во многом определяется возможностями использования методических подходов. До настоящего времени золотым стандартом диагностики гепатита А является определение антител к ВГА класса M методом ИФА. Использование молекулярно-генетических методов на основе ОТ-ПЦР открывает новые перспективы в изучении эпидемического процесса ГА.
В результате работы Попковой М.И. (2006) было установлено, что метод ОТ-ПЦР более информативен по сравнению с ИФА. Аналитическая чувствительность ОТ-ПЦР превосходит ИФА в 10 000 раз. Диагностическая чувствительность наряду с высокой специфичностью превосходит параметры используемый в практике ИФА в 7,8 раз, что обосновывает пригодность метода к использованию в эпидемиологических исследованиях [2].
Расширены представления о сроках эпидемической опасности больных манифестной формой ГА. Установлено, что РНК ВГА определяется в фекалиях в 93,3% случаев спустя 25 дней с момента госпитализации методом ОТ-ПЦР с электрофорезной детекцией, а при использовании более совершенного real-time метода до 54 дней. Удлинение срока эпидемической опасности в рамках фекально-орального механизма передачи требует пересмотра временных параметров изоляции и допуска в коллективы декретированных контингентов населения [2,7].
Использование ОТ-ПЦР при расследовании вспышеч-ной и групповой заболеваемости ГА в очагах, сформировавшихся в детских коллективах, повышает результативность работы по выявлению источников инфекции и
оценке интенсивности эпидемического процесса в них, так как позволяет выявлять РНК ВГА в отрицательных в ИФА случаях. Это определяет тактику проводимых противоэпидемических мероприятий в очагах ГА.
Использование технологий на основе ОТ-ПЦР приобретает особое значение при определении ВГА в объектах внешней среды, в том числе в воде. При этом применение метода ОТ-ПЦР по сравнению с тестом на антиген ВГА методом ИФА позволил повысить определяемость вируса в воде более чем в 23 раза, что позволило выявлять ВГА не только в годы с высоким уровнем заболеваемости, но и в условиях межэпидемического периода. Установлена связь между обнаружением РНК ВГА в водных объектах и развитием эпидемического процесса ГА в условиях спорадической и вспышечной заболеваемости. Определены условия, влияющие на интенсивность циркуляции ВГА в водных объектах. Частота обнаружения ВГА увеличивалась в годы периодических подъемов, ежегодно в весенние месяцы, а в зимнее время - в след за годом с высоким уровнем заболеваемости ГА и в случае оттепелей с таянием снега [54, 55, 56].
Во время вспышки в Н. Новгороде (2005 г.) только с помощью метода ОТ-ПЦР РНК была обнаружена в 2 пробах водопроводной воды из распределительной сети микрорайона с максимальным уровнем заболеваемости, что позволило подтвердить роль водного пути передачи в данной эпидемической ситуации. Это обосновывает необходимость применения ОТ-ПЦР при изучении вопросов экологии возбудителя, а также его использование как методической основы детекции при мониторинге водных объектов за контаминацией ВГА и при расшифровке вспышек ГА водного характера [57].
Изучение генетического разнообразия изолятов ВГА способствует расследованию очагов ГА и выявлению источника инфекции, установлению эпидемиологической связи между различными случаями заболевания и идентификации завозных случаев инфекции. Так, в Санкт-Петербурге в 2001-2009 гг. определена циркуляция трех субтипов, установлены завозные (субтип 1В) и эндемичные (1А, ША) штаммы, выявлена взаимосвязь между подъемами заболеваемости и появлением в циркуляции новых вариантов 1А и ША, вскрыты некоторые особенности передачи ША среди инъекционных наркоманов [28, 37, 58]. Собственные исследования штаммов, выделенных у больных ГА Н. Новгороде в 2004-2009 гг., выявили подавляющую циркуляцию субтипа 1А с единичными определениями штаммов субтипов 1В и ША [59]. При филогенетическом анализе штаммов, выделенных во время вспышек 2005-2007 годах в Европейской части России, для каждой вспышки был выявлен эндемичный вариант 1А субтипа, вызывающий и спорадическую
заболеваемость, за исключением Н. Новгорода, где во время вспышки в 2005 г. обнаружены 2 штамма в разных районах с разной заболеваемостью ГА и отдельной системой водоснабжения [38, 57]. В азиатской части РФ выявленные при вспышках ГА относились к субтипам IA, причем на Сахалине изоляты относились к средиземноморской группе, не свойственной данной территории. Две вспышки были вызваны вирусом субтипа IIIA, в одной из них (г. Нерюнгри) имела место циркуляция эндемичного штамма, а в другом (Кемеровская область) - два близкородственных штамма индийской группы, до этого выявленные на территории области. Выявление методом сек-венирования нехарактерных для определенного региона штаммов позволило А.Д. Неверову с соавт. (2007) выдвинуть гипотезу о завозе этих штаммов в регион. Присутствие нескольких близкородственных штаммов в пределах вспышки может свидетельствовать о длительном существовании хронического очага ГА. Особенности распределения в пределах одной вспышки нескольких изолятов по вовлеченным районам или населенным пунктам помогают в выявлении штамма, вызвавшего вспышку и штаммов, обуславливающих спорадическую заболеваемость [41, 42].
В работах H.Y Kim (2011) с соавт. приведена роль рецептора TIM1 Т-клеток иммунной системы как рецептора, связывающего ВГА, который может обуславливать запуск аутоиммунных процессов в процессе ГА инфекции [6, 52].
В целом применение молекулярно-генетических методов является теоретическим обоснованием закономерностей проявления и механизмов регуляции эпидемического процесса ГА, включая изучение возбудителя в пространстве и времени. Исследования, проведенные с использованием данных методов, ставят вопрос о необходимости проведения дальнейших исследований для изучения вирулентности возбудителя в течение инфекционного и эпидемического процессов, а также оценке опасности позитивных по РНК ВГА лиц в качестве источников ГА-инфекции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вирусные гепатиты в Российской Федерации. Аналитический обзор / под ред. Покровского В.И., Жебруна А.Б. 8 выпуск. СПб: ФБУН ННИИЭМ Пастера, 2011. C. 13.
Virusnye gepatity v Rossijskoj Federacii. Analiticheskij obzor / pod red. Pokrovskogo V.l., Zhebruna A.B. 8 vypusk. SPb: FBUN NNIIJeM Pastera, 2011. S.13.
2. Попкова М.И. Информативность определения РНК вируса гепатита А при проведении эпиднадзора за инфекцией: атореф. дисс. ... канд. мед. наук. Н. Новгород, 2006.
Popkova M.I. Informativnost' opredelenija RNK virusa gepatita A pri provedenii jepidnadzora za infekciej: avtoref. diss. ... kand. med. nauk. N. Novgorod, 2006.
3. Sanchez G., Bosch A., Pint R.M. Genome Variability and Capsid Structural Constraints of Hepatitis A Virus. Journal of Virology. 2003. Vol. 1. No. 77. P. 452-459.
4. Amado L.A., Marchevsky R.S., de Paula V.S., Hooper C., Freire M.S., Gaspar A.M., Pinto M.A. Experimental hepatitis A virus (HAV) infection in cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis): evidence of active extrahepatic site of HAV replication. International Journal of Experimental Pathology. 2010. № 91. P. 87-97.
5. Feigelstock D., Thompson P., Mattoo P., Zhang Y., Kaplan G.G. The Human Homolog of HAVcr-1 Codes for a Hepatitis A Virus Cellular Receptor. Journal of Virology. 1998. Vol. 8. № 72. P. 6621-6628.
6. Silberstein E., Konduru K., Kaplan G.G. The interaction of hepatitis A virus (HAV) with soluble forms of its cellular receptor 1 (HAVCR1) share the physiological requirements of infectivity in cell culture. Virology Journal. 2009. № 6. P. 175.
7. Polish L.B., Robertson B.H., Khanna B., Krawczynski K., Spelbring J., Olson F., Shapiro C.N. Excretion Of Hepatitis A Virus (Hav) In Adults: Comparison Of Immunologic And Molecular Detection Methods And Relationship Between Hav Positivity And Infectivity In Tamarins. Journal Of Clinical Microbiology. 1999. Vol. 11. № 37. P. 3615-3617.
8. Li J.W., Xin Z.T., Wang X.W., Zheng J.L., Chao F.H. Mechanisms of Inactivation of Hepatitis A Virus by Chlorine. Applied and environmental microbiology. 2002. P. 4951-4955.
9. Балаян М.С. Вирусный гепатит А. Научный обзор. Москва: ВНИИМИ, 1983.
Balajan M.S. Virusnyj gepatit A. Nauchnyj obzor. Moskva: VNIIMI, 1983.
10. Cohen L., Benichou D., Martin A. Analysis Of Deletion Mutants Indicates That The 2a Polypeptide Of Hepatitis A Virus Participates In Virion Morphogenesis. Journal of Virology. 2002. Vol. 15. № 76. P. 7495-7505.
11. Anderson D.A., Ross B.C. Morphogenesis of hepatitis A virus: isolation and characterization of subviral particles. Journal of Virology. 1990. Vol. 11. № 64. P. 5284-5289.
12. Probst C., Jecht M., Gauss-M ller V. Intrinsic signals for the assembly of hepatitis A virus particles. Role of structural proteins VP4 and 2A. Journal of Biologival Chemistry. 1999. Vol. 8. № 274. P. 4527-31.
13. Martin A., Benichou D., Chao S.F., Cohen L.M., Lemon S.M. Maturation of the Hepatitis A Virus Capsid Protein VP1 Is Not Dependent on Processing by the 3Cpro Proteinase. Journal of Virology. 1999. Vol. 8. № 73. P. 6220-6227.
14. Graff U., Richards O.C., Swiderek K.M., Davis M.T., Rusnak F., Harmon S.A., Jia X.Y., Summers D.F., Ehrenfeld E. Hepatitis A Virus Capsid Protein VP1 Has a Heterogeneous C Terminus. Journal of Virology. July 1999. Vol. 7. № 73. P. 6015-6023.
15. Harmon S., Emerson S., Huang Y., Summers D., Ehrenfeld E. Hepatitis A viruses With Deletions In The 2a Gene Are Infectious In Cultured Cells And Marmosets. Journal Of Virology. 1995. Vol. 9. № 69. P. 5576-81.
16. Konduru K., Nakamura S.M., Kaplan G.G. Hepatitis A virus (HAV) packaging size limit. Virology Journal. 2009. Vol. 6. № 204.
17. Beard M.R., Cohen L., Lemon S.M., Martin A. Characterization of recombinant hepatitis A virus genomes containing exogenous sequences at the 2A2B junction. Journal of Virology. 2001. Vol. 3. № 75. P. 1414-1426.
18. Probst C., Jecht M., Gauss-Muller V. Proteinase 3C-mediated processing of VP1-2A of two hepatitis A virus strains: in vivo evidence for cleavage at amino acid position 273274 of VP1. JournaL of Virology. 1997. Vol. 71. № 4. P. 32883292.
19. Schultheiss T., Sommergruber W., Kusov Y., Gauss-Muller V. Cleavage specificity of purified recombinant hepatitis A virus 3C proteinase on natural substrates. Journal of Virology. 1995. Vol. 3. № 69. P. 1727-1733.
20. Desbois D., Couturier E., Mackiewicz V., Graube A., Letort M.J., Elisabeth Dussaix,Roque-Afonso A.M. Epidemiology and Genetic Characterization of Hepatitis A Virus Genotype IIA Journal of Clinical Microbiology. 2010. Vol. 9. No. 48. P. 3306-3315.
21. Perez-Sautu U., Costafreda M.I., Cayla J., Tortajada C., Lite J., Bosch A., Pinto R.M. Hepatitis A Virus Vaccine Escape Variants and Potential New Serotype Emergence Emerging Infectious Diseases. 2011. Vol. 4. №17. P. 734-737.
22. Costa-Mattioli M., Di Napoli A., Ferre V., Billaudel S.,Perez-Bercoff R., Cristina J. Genetic variability of hepatitis A virus Journal of General Virology. 2003. № 84. P. 3191-3201.
23. O. Nainan, G. Xia, G.Vaughan, H. Margolis. Diagnosis Of Hepatitis A Virus Infection: A Molecular Approach. Clinical Microbiology Reviews. 2006. Vol. 1. № 19. P. 63-79.
24. Sanchez G., Bosch A., Gomez-Mariano G., Domingo E., Pinta R.M. Evidence for quasispecies distributions in the human hepatitis A virus genome. Virology. October 2003. Vol. 10. № 315 (1). P. 34-42.
25. Caro V., Guillot S., Delpeyroux F., Crainic R. Molecular strategy for 'serotyping' of human enteroviruses. Journal of General Virology. 2001. Vol. 1. № 82. P. 79-91.
26. Robertson B.H., JansenR.W., Khanna B., Totsuka A., Nainan O.V., SieglG., Widell A., Margolis H.S., Isomura S., Ito K., et al. Genetic relatedness of hepatitis A virus strains recovered from different geographical regions. Journal of General Virology. 1992. Vol. 6. № 73. P. 1365-77.
27. Costa-Mattioli M., Cristina J., Romero H., Perez-Bercof R., Casane D., Colina R., Garcia L., Vega I., Glikman G., Romanowsky V., Castello A., Nicand E., Gassin M., Billaudel S., Fer V. Molecular Evolution of Hepatitis A Virus: a New Classification Based on the Complete VP1 Protein. Journal of Viology. 2002. Vol. 18. № 76. P. 9516-25.
28. Mukomolov S., Kontio M., Zheleznova N., Jokinen S., Sinayskaya E., Stalevskaya A., Davidkin I. Increased circulation of hepatitis A virus genotype IIIA over the last decade in St Petersburg, Russia. Journal of Medical Virology. 2012. Vol. 10. № 84. P. 1528-1534.
29. Stene-Johansen K., Jonassen T., Skaug K. Characterization and genetic variability of Hepatitis A virus genotype IIIA Journal of General Virology. 2005. Vol. 10. № 86. P. 2739-45.
30. Pinta R.M., Alegre D., Dominguez A., El-Senousy W.M., Snchez G., Villena C., Costafreda M.I., Aragonos L., Bosch A. Hepatitis A virus in urban sewage from two Mediterranean countries. Epidemiology and infection. 2007. Vol. 2. № 135. P. 270-273.
31. Kokkinos P., Ziros P., Filippidou S., Mpampounakis I., Vantarakis A. Molecular characterization of hepatitis A virus isolates from environmental and clinical samples in Greece Journal of Virology. 2010. Vol. 7. № 16. P. 235.
32. Gharbi-Khelifi H., Abid N.B., Beji A., Bhiri L., Harrath R., Sdiri K., Billaudel S., Ferre V., Aouni M. Seroprevalence and Molecular Characterisation of Human Hepatitis A virus in Serum Samples of Tunisian Patients with Clinical Symptoms of Viral Hepatitis Indian Journal of Virology. 2012. Vol. 1. № 23. P. 29-35.
33. Chironna M., Prato R., Sallustio A., Martinelli D., Tafuri S., Quarto M., Germinario C. Hepatitis A in Puglia (South Italy) after 10 years of universal vaccination: need for strict monitoring and catch-up vaccination BioMed Central Infectious Diseases. 2012. Vol. 12. № 25. P. 271.
34. Lee H., Jeong H., Yun H., Kim K., Kim J.H., Yang J.M., Cheon D.S. Genetic analysis of hepatitis A virus strains that induced epidemics in Korea during 20072009. Journal of Clinical Microbiology. 2012. Vol. 4. № 50. P. 1252-57.
35. Cao J., Wang Y., Song H., Meng Q., Sheng L., Bian T., Mahemuti W., Yierhali A., Omata M., Bi S. Hepatitis A outbreaks in China during 2006: application of molecular epidemiology Hepatology International. 2009. № 3. P. 356-363.
36. Faber M.S., Stark K., Behnke S.C., Schreier E., Frank C. Epidemiology of hepatitis A virus infections, Germany, 2007-2008 Emerging Infectious Diseases. 2009. Vol. 11. № 15. P. 1760-1768.
37. Davidkin I., Zheleznova N., Jokinen S., Gorchakova O., Broman M., Mukomolov S. Molecular epidemiology of hepatitis A in St. Petersburg, Russia, 1997-2003 Journal of Medical Virology. 2007. Vol. 6. № 79. P. 657-62.
38. Карандашова И.В., Неверов А.Д., Браславская С.И., С.Г. Орлов, А.Е., Михайловская Г.В., Лебедева Е.Б., Самсонова В.К., Алексеева М.Н., Мельникова А.А. Чуланов В.П. Молекулярная эпидемиология вспышек вирусного гепатита А, имевших место на территории России в 2005-2007 годах. Материалы НПК «Молекулярная диагностика 2007».Т. 1. С. 300-302.
Karandashova I.V., Neverov A.D., Braslavskaja S.I., S.G. Orlov, A.E., Mihajlovskaja G.V., Lebedeva E.B., Samsonova V.K., Alekseeva M.N., Mel'nikova A.A. Chulanov V.P. Molekuljarnaja jepidemiologija vspyshek virusnogo gepatita A, imevshih mesto na territorii Rossii v 2005-2007 godah. Materialy NPK «Molekuljarnaja diagnostika 2007».T. 1. S. 300-302.
39. Карандашова И.В., Неверов А.Д., Камолов Б.Д., Лебедева Е.Б., С.Г. Орлов, Браславская С.И., А.Е. Мязин, Малеев В.В., Чуланов В.П. Этиологическая структура вирусных гепатитов в республике Таджикистан по результатам молекулярно-биологических исследований. Материалы НПК «Молекулярная диагностика 2007». Т.1. C. 303-306.
Karandashova I.V., Neverov A.D., Kamolov B.D., Lebedeva E.B., S.G. Orlov, Braslavskaja S.I., A.E. Mjazin, Maleev V.V., Chulanov V.P. Jetiologicheskaja
struktura virusnyh gepatitov v respublike Tadzhikistan po rezul'tatam molekuljarno-biologicheskih issledovanij. Materialy NPK «Molekuljarnaja diagnostika 2007». T.1. S. 303-306.
40. Неверов А.Д., Карандашова И.В., С.Г. Орлов, В.К. Самсонова, М.А. Рафаилова, Браславская С.И., А.Е. Мязин, М.Н. Алексеева, Чуланов В.П. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов в Якутии. Материалы НПК «Молекулярная диагностика 2007». Т.1. С. 315-316.
NeverovA.D., Karandashova I.V., S.G. Orlov, V.K. Samsonova, M.A. Rafailova, Braslavskaja S.I., A.E. Mjazin, M.N. Alekseeva, Chulanov V.P. Molekuljarnaja jepidemiologija virusnyh gepatitov v Jakutii. Materialy NPK «Molekuljarnaja diagnostika 2007». T.1. S. 315-316.
41. Неверов А.Д., Карандашова И.В., Браславская С.И., Чуланов В.П. Филогенетическая структура популяции вируса гепатита А в России. Материалы НПК «Молекулярная диагностика 2007». T.1. C. 318-319.
Neverov A.D., Karandashova I.V., Braslavskaja S.I., Chulanov V.P. Filogeneticheskaja struktura populjacii virusa gepatita A v Rossii. Materialy NPK «Molekuljarnaja diagnostika 2007». T.1. S. 318-319.
42. Неверов А.Д., Карандашова И.В., Браславская С.И Чуланов В.П. Идентификация штаммов вируса гепатита А для эпидемиологических исследований. Материалы НПК «Молекулярная диагностика 2007». T.1. C. 313-314.
NeverovA.D., Karandashova I.V., Braslavskaja S.I Chulanov V.P. Identifikacija shtammov virusa gepatita A dlja jepidemiologicheskih issledovanij. Materialy NPK «Molekuljarnaja diagnostika 2007». T.1. S. 313-314.
43. Pina S., Buti M., Jardi R., Clemente-Casares P., Jofre J., Girones R. Genetic analysis of hepatitis A virus strains recovered from the environment and from patients with acute hepatitis Journal of General Viroloroly. 2001. Vol. 12. № 82. P. 2955-63.
44. Hussain Z., Husain S.A., Almajhdi F.N., Kar P. Immunological and molecular epidemiological characteristics of acute and fulminant viral hepatitis A. Virology Journal. 2011. Vol. 8. № 254.
45. Fujiwara K., Yokosuka O., Ehata T., Saisho H., Saotome N., Suzuki K., Okita K., Kiyosawa K., Omata M. Association between severity of type A hepatitis and nucleotide variations in the 5' non-translated region of hepatitis A virus RNA: strains from fulminant hepatitis have fewer nucleotide substitutions. Gut. 2002. Vol. 1. № 51. P. 82-88.
46. Kanda T., Jeong S.H., Imazeki F., Fujiwara K., Yokosuka O. Analysis of 5 Nontranslated Region of Hepatitis A Viral RNA Genotype I from South Korea: Comparison with Disease Severities. Plos One. 2010. Vol. 5. № 12. P. e15139.
47. Mackiewicz V., Cammas A., Desbois D., Marchadier E., Pierredon S., Beaulieux F., Dussaix E., Vagner S., Roque-Afonso A.M. Nucleotide Variability and Translation Efficiency of the 5 Untranslated Region of Hepatitis A Virus: Update from Clinical Isolates Associated with Mild and Severe Hepatitis. Journal of Virology. 2010. Vol. 12. № 84. P. 10139-10147.
48. Jia X.Y., Tesar M., Summers D.F., Ehrenfeld E. Replication of hepatitis A viruses with chimeric 5' nontranslated regions. Journal of Virology. 1996. Vol. 5. № 70. P. 2861-2868.
49. Emerson S.U., McRill C., Rosenblum B., Feinstone S., Purcell R.G. Mutations responsible for adaptation of hepatitis A virus to efcient growth in cell culture. Journal of Virology. 1992. № 65. P. 4882-4886.
50. Raychaudhuri G., Govindarajan S., Shapiro M., Purcell R., Emerson S. Utilization Of Chimeras Between Human (Hm-175) And Simian (Agm-27) Strains Of Hepatitis A Virus To Study The Molecular Basis Of Virulence. Journal Of Virology. 1998. Vol. 9. № 72. P. 7467-7475.
51. Emerson S., Huang Y., Nguyen H., Brockington A., Govindarajan S., Claire M.S., Shapiro M., PurcellR. Identi cation Of Vp12a And 2c As Virulence Genes Of Hepatitis A Virus And Demonstration Of Genetic Instability Of 2C. Journal Of Virology. 2002. Vol. 17. №76. P. 8551-8559.
52. Kim H.Y., Eyheramonho M.B., Pichavant M.,Cambaceres C.G., Matangkasombut P., Cervio G., Kuperman S., Moreiro R., Konduru K., Manangeeswaran M., Freeman G.J., Kaplan G.G., DeKruyff R.H., Umetsu D.T., Rosenzweig S.D. A polymorphism in TIM1 is associated with susceptibility to severe hepatitis A virus infection in humans. Journal of Medical Investigations. 2011. Vol. 3. № 121. P. 1111-1118.
53. Михайлов М.И. Шахгильдян И.В. Онищенко Г.Г. Энтеральные вирусные гепатиты (этиология, эпидемиология, диагностика, профилактика). Москва: ФГОУ ВУНМЦ Росздрава, 2007.
Mihajlov M.I. Shahgil'djan I.V. Onishhenko G.G. Jenteral'nye virusnye gepatity (jetiologija, jepidemiologija, diagnostika, profilaktika). Moskva: FGOU VUNMC Roszdrava, 2007.
Б4. Быстрова Т.Н., Блохин К.В., Попкова М.И. Эпидемиологическая значимость определения специфических маркеров ВГА в воде методами ИФА и ОТ-ПЦР // матер. науч. конф., посвящ. ВБ-летию акад. РАМН И.Н. Блохиной., 2006. С. 103-104.
Bystrova T.N., Blohin K.V., Popkova M.I. Jepidemiologicheskaja znachimost' opredelenija specificheskih markerov VGA v vode metodami IFA i OT-PCR // mater. nauch. konf., posvjashh. 8S-letiju akad. RAMN I.N. Blohinoj., 2006. S. 103-104.
ББ. Быстрова Т.Н., Блохин К.В., Попкова М.И., Ефимов Е.И., Эпидемиологическое значение находок вируса гепатита А в открытых водоемах. Мир вирусных гепатитов. 2006. № Б. С. 2-6.
Bystrova T.N., Blohin K.V., Popkova M.I., Efimov E.I. Jepidemiologicheskoe znachenie nahodok virusa gepatita A v otkrytyh vodoemah. Mir virusnyh gepatitov. 2006. № S. S. 2-6.
Б6. Быстрова Т.Н., Блохин К.В., Попкова М.И., Юнисова В.К. Закономерности распространения вируса гепатита А в водных объектах // сб. мат. конф. «Эпидемиология, диагностика и профилактика вирусных гепатитов. Современное состояние». 2006. С. 124-126.
Bystrova T.N., Blohin K.V., Popkova M.I., Junisova V.K. Zakonomernosti rasprostranenija virusa gepatita A v vodnyh ob#ektah // sb. mat. konf. «Jepidemiologija, diagnostika i profilaktika virusnyh gepatitov. Sovremennoe sostojanie». 2006. S. 124-126.
Б7. Онищенко Г.Г., Шахгильдян И.В., Петров Е.Ю., Княгина О.Н., Т.В.Осипова, Мельникова А.А., Окунь И.Н., Дерябина О.И., Ефимов Е.И.,
Быстрова Т.Н., Малышев В.В., Чуланов В.П., Гильденскольд О.А., Калашникова Н.А., Погодина Л.В. Водная вспышка гепатита А в Нижнем Новгороде. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2007. № 3. С. 4-9.
Onishhenko G.G., Shahgil'djan I.V., Petrov E.Ju., Knjagina O.N., T.V.Osipova, Mel'nikova A.A., Okun' I.N., Derjabina O.I., Efimov E.I., Bystrova T.N., Malyshev V.V., Chulanov V.P., Gil'denskol'd O.A., Kalashnikova N.A., Pogodina L.V., Vodnaja vspyshka gepatita A v Nizhnem Novgorode. Jepidemiologija i infekcionnye bolezni 2007. № 3. S. 4-9.
58. Сталевская А.В. Эпидемиологические особенности вирусного гепатита А в современный период в условиях мегаполиса: автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Санк-Петербург. 2012.
Stalevskaja A.V. Jepidemiologicheskie osobennosti virusnogo gepatita A v sovremennyj period v uslovijah megapolisa: avtoref. diss.... kand. med. nauk. Sank-Peterburg. 2012.
59. Залесских А.А., Быстрова Т.Н., Чуланов В.П., Карандашова И.В. // Материалы НПК V Ежегодный конгресс по инфекционным болезням. 2013. С. 155.
Zalesskih A.A., Bystrova T.N., Chulanov V.P., Karandashova I.V. // Materialy NPK V Ezhegodnyj Kongress po infekcionnym boleznjam. 2013. S. 155.
60. Быстрова Т.Н. Вирусный гепатит А (эпидемиологические закономерности, лабораторная диагностика): автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. Н. Новгород. 1999.
Bystrova T.N. Virusnyj gepatit A (jepidemiologicheskie zakonomernosti, laboratornaja diagnostika): avtoref. diss.... d-ra med. nauk. N. Novgorod. 1999.
61. Мукомолов С.Л., Калинина О.В. Молекулярная эпидемиология вирусных гепатитов. Мир вирусных гепатитов. 2003. № 11. С. 2-7.
Mukomolov S.L., Kalinina O.V. Molekuljarnaja jepidemiologija virusnyh gepatitov. Mir virusnyh gepatitov. 2003. № 11. S. 2-7.
