CC BY
21
Состояние первичной антибиотикорезистентности Helicobacter pylori в Азербайджане
И.Т.Амирасланова, Л.А.Гидаятова, С.С.Джавадов
Азербайджанский медицинский университет, г.Баку
В настоящее время доказано, что доминирующая роль в этиопатогенезе развития хронического гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, MALT-лимфомы (экстра-нодальная маргинальной зоны В-клеточная лим-фома, ассоциированная со слизистыми оболочками), а также аденокарциномы желудка принадлежит Н.ру1оп инфекции. Все эти заболевания являются прямым показанием к проведению эради-кационной терапии, использование которой значительно снижает риск язвенных кровотечений, развития онкологических заболеваний желудка [1]. На сегодняшний день для эрадикации Н.ру1оп бактерии используются стандартные рекомендации, принятые Маастрихтским консенсусом IV. Определяющим фактором эффективности предложенных схем эрадикационной терапии Маастрихтских соглашений являются антибактериальные препараты. И поэтому, положите ль-ный эффект антимикробной терапии у больных с гастродуоденальной патологией, ассоциированной с хеликобактериозом, в большой степени зависит от резистентности микроорганизма к используемым антибиотикам. При резистентности к антибактериальным препаратам, превышающей 15-20%, эффективность используемых схем антихеликобактерной терапии не может достигнуть приемлемого уровня 85-90% [2]. В схемы эрадикации входит лишь ограниченный набор препаратов, такие как кларитромицин, амокси-циллин, метронидазол, тетрациклин, левофлок-сацин [3]. Резистентность к H.pylori подразделяется на первичную и вторичную. Возникает вопрос , изучен ли уровень антибиотикорезистент-ности Helicobacter pylori в нашем регионе. Необходимость коррекции лечения на основе локальной картины антибиотикорезистентности подчеркивается в Маастрихтском консенсусе III и в положении 7 рабочей версии нового консенсуса (Маастрихт 4) , который является основополагающим международным руководством по диагностике и лечению H. pylori-инфекции. Эти факты указывают на назревшую необходимость проведения собственных исследований в Азербайд-
жане, которые позволили бы уточнить уровень резистентности к основным антибактериальным препаратам, используемым в стандартных схемах Маастрихтских рекомендаций.
Цель данной работы получение объективных данных о состоянии первичной антибиоти-корезистентности штаммов H. pylori, выделенных от пациентов в Баку.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. В исследование включены пациенты поликлиники Учебно Терапевтической Клиники АМУ.
Критерии отбора пациентов:
1. Пациенты с диагнозами хронический гастрит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки в возрасте 18-60 лет.
2. Пациенты с инфекцией H.pylori, подтвержденной быстрым уреазным CLO-тестом гастробиоп-тата, полученного при проведении эзофагогастроду-оденоскопии.
3. Пациенты не получавшие ранее антибактериальную терапию для эрадикации H.Pylori.
4. Отсутствие принятия пациентами за последние две недели перед данным исследованием ингибиторов протонной помпы и препаратов висмута.
5. Пациенты, не принимающие какую-либо антибактериальную терапию на момент забора гаст-робиоптата.
В качестве материала для исследования использованы гастробиоптаты пациентов с положительным быстрым уреазным тестом - использовался CLO-тест. Во время эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС) производился забор биоптатов из антраль-ного отдела и из тела желудка для бактериологического исследования. Биопсийный материал помещался в пробирку типа "эппендорф" с бульоном бруцелла (Brucella broth, OXOID, U.K.) и траспортировался из эндоскопического кабинета в микробиологическую лабораторию в течение 20-30 минут. Затем биоптаты гомогенизировались.
Для выделения H. pylori использовались два метода: классическое культивирование и микрокапиляр-ный метод.
При классическом культивировании за основу питательной среды для выделения и культивирования H. pylori использовался колумбийский агар COS с 5% бараньей кровью и бруцелла агар, САМР агар (OXOID, U.K). Каждый из биопсийных образцов высевался параллельно на две чашки Петри с агаром, со-
держащим антибиотики в следующих концентрациях: ванкомицин в концентрации 10 мг/л, 10 мг/л амфо-терицин B, 5 мг/л цефсулодин и 5 мг/л триметоприм.
Инкубация посевов осуществлялась в микроаэро-фильныхусловиях (О2 11%, СО2 9%, N2 80%) . Для этого были использованы анаэростаты системы GasPac100 c газогенерирующими пакетами типа GasPak (BBL CampyPak Plus Microaerophilic System envelopes with Palladium Catalyst). Посевы инкубировали в термостате при температуре +37°С и влажности 95%. Учет результатов посева проводили через 3 суток. При отсутствии признаков роста инкубацию продлевали до 10 суток.
Микрокапилярный метод проводился следующим образом, после обработки хроматом калия в течение часа для получения гладкой поверхности микрокапиллярные трубки промывались дистиллированной водой и подвергались стерилизации в печи Пастера при 180°С в течение одного часа. Затем их заполняли 60 мкл гомогенизированными образцами и закрывали с обоих концов стерильным силиконом. Капиллярные трубки инкубировались в течение 48 часов при 37°С без подачи подачи СО2. После инкубации гомогенизированные образцы из микрокапилярных трубок в стерильных условиях были инокулированы на готовый селективный агар, содержащий колумбийский агар, 10% дефибринированную лошадиную кровь, 10 мг/л ванкомицина, 10 мг/л флуканазола, 5 мг/л стрептомицина. Затем полученная среда инкубировалась при температуре 37°С в микроаэрофильных условиях в СО2-инкубаторе в течение 12-24 часов.
При получении роста колоний от первичного посева биопсийного материала, сходных по морфологии с Н. pylori, потверждалась принадлежность выделенной культуры к роду Н. pylori путем окраски мазка по Граму и биохимическими тестами - уреазным, каталазным и оксидазным. Штаммы хранились при температуре -70°С в пробирках с триптиказо-сое-вым бульоном (BioMeriеux, Франция) с добавлением 30% стерильного глицерина (Sigma, США).
Исследование чувствительности H. pylori проводили в соответствии с рекомендациями Института по клиническим и лабораторным стандартам США (CLSI) диско-диффузионным методом(Kirby Bauer) в катион-сбалансированном агаре Мюллера-Хинтон (BBL, США), обогащенном 5% лошадиной кровью. Для приготовления инокулюма использовали двухдневную культуру Н. pylori, разведенную 3-5 мл стерильного физиологического раствора до достижения плотности, эквивалентной стандарту мутности 2 по McFarland (DEN-1 McFarland Densitometr, BIOSAN, Латвия) с непосредственной инокуляцией чашек. В результате диффузии антибиотика в агар происходило формирование зоны подавления роста H. pylori вокруг дисков. Инкубацию чашек проводили 72 ч в микроаэрофильных условиях (GEN box microaer) при температуре +37°С Для чашек с метронидазолом осуществляли предварительную инкубацию в течение 24 ч в анаэробных условиях. После окончания инкуба-
ции отмечали чашку с концентрацией антибактериального препарата, вызывающей полное подавление роста микробов. Контроль чистоты роста культуры оценивали по посеву на чашку Петри с селективной кровяной средой без добавления антибиотиков. Определялась чувствительность H. pylori к амоксицилли-ну, кларитромицину, левофлоксацину, тетрациклину и метронидазолу. Данный метод позволил подразделить штаммы H. pylori на чувствительные и резистентные.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. В исследовании использовались гастробиоптаты 103 пациентов в возрасте от 18 до 60 лет. У пациентов были диагностированы различные заболевания, ассоциированные с H.pylori, такие как хронический гастрит 37,8±4,8% (n = 39), язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки (ДПК) 39,8±4,8% (n = 41) и язвенная болезнь желудка 22,3±4,1% (n = 23).
Инфицирование H.pylori было подтверждено у всех пациентов быстрым уреазным CLO-тес-том. Бактериологическим методом микроорганизм выделен лишь у 52 пациентов, что составило 50,5±4,9% . Такой процент отражает технические трудности, связанные с транспортировкой и культивированием микроаэрофильного микроорганизма.
Чувствительность H.pylori к антимикробным препаратам удалось определить у 41 штаммов, выделенных микрокапилярным методом. Выделить культуру H.pylori методом классического культивирования не удалось. Из-за скудного роста культуры в 11 случаях оценить антибиотиког-рамму было невозможно.
Таким образом, в анализ резистентности были включены 41 штаммов хеликобактера, выделенных от 41 пациентов. Среди анализируемых изолятов H. pylori штаммов, 23 (56,1±7,8%) были резистентны к метронидазолу, 6 (14,6±5,5%) -к кларитромицину, 1 (2,4±2,4%) - к тетрациклину, 10 (24,4±6,7%) - к левофлоксацину. Кроме того, был выявлен 1 (2,4±2,4%) штамм, устойчивый к амоксициллину. В случаях выявления резистентности к двум и более группам антимикробных препаратов, штамм хеликобактера относили к полирезистентным. В ходе исследования 5 (12,2±5,1%) штаммов микроорганизма были полирезистентными. Двойная резистентность к кларитромицину и метронидазолу обнаружена у 1 (2,4±2,4%) изолята, метронидазолу и левофлок-сацину - у 4 (9,8±4,6%) микроорганизмов (табл.).
Начало нового века ознаменовалось возникновением проблемы, уже давно обозначившейся при терапии других инфекций, проблемы развития устойчивости H.pylori к антимикробным пре-
Таблица. Уровень первичной резистентности H. pylori при тестировании 41 биоптатов
Антибактериальный препарат Количество штаммов
абс. %
резистентны к метронидазолу 23 5 6,1 ±7,8
резистентны к кларитромицину 6 14,6±5,5
резистентны к тетрациклину 1 2,4±2,4
резистентны к левофлоксацину 10 24,4±6,7
резистентны к амоксициллину 1 2,4±2,4
полирезистентность (=2) 5 12,2±5,1
паратам. Эффективность эрадикационной терапии должна быть не менее 80%. Успех антихели-кобактерной терапии напрямую коррелирует с резистентностью H. pylori к антибактериальным препаратам, предложенных в рекомендациях Маастрихтского консенсуса IV (2010 г.). Она варьирует в различных регионах мира от 30 до 90% [4]. В различных странах мира в результате проведения многоцентровых исследований установлен разный уровень резистентности H. pylori к антибиотикам, в частности к кларитромицину. Уровень резистентности H. pylori к кларитроми-цину в популяции является определяющим фактором при выборе схемы эрадикации [5]. Как и все патогенные микроорганизмы, штаммы H. pylori имеет свои региональные особенности резистентности. В целом, резистентность Helicobacter pylori к кларитромицину возрастает пропорционально его потреблению в данном регионе и в общем в различных странах мира она варьирует от 2% до 35%. В последние годы отмечается неуклонный рост числа резистентных к кла-ритромицину штаммов H.pylori, что связано, по всей вероятности, с широким применением этого антибиотика для лечения респираторных инфекций, а также с частым использованием макроли-дов при лечении других заболеваний [6].
Резистентность ^pylori к метронидазолу колеблется от 20 до 40% в Европе и США, но она значительно выше в развивающихся странах (5080%) [7]. Причиной этого является широкое использование производных нитроимидозолов для лечения урогенитальных и других инфекций и неадекватное использование их в схемах эради-кационой терапии [8].
На сегодняшний день в мире не было установлено четкого роста резистентности H. pylori к амоксициллину, что делает его ключевым препаратом в схемах ЭТ [9,10, 11]. Так, в Европе уровень резистентности H. pylori к амоксициллину держится на стабильно низком уровне и не превышает 1%. И опять таки, сравнивая со странами
Европы, в ряде стран Африки и Азии были выявлены более высокие показатели резистентности к амоксициллину, в частности в Камеруне -85,6% (95% ДИ: 76,9-91,5) и в Тайване - 36,1% (95% ДИ: 27,9-44,2) [12]. При высоком уровне резистентности микроорганизма к макролидам и нитроимидазолам Европейской группой по изучению H. pylori в качестве альтернативы рекомендуется использование схем на основе левоф-локсацина. Однако имеются сообщения, указывающие на рост резистентности H.pylori к данному препарату в последние годы за счет большого потребления фторхинолонов. Резистентность H.pylori к антимикробным препаратам фторхино-лонового ряда в Европе составляет 24,1% (95% ДИ: 20,7-27,4), что выше по сравнению со странами Азии, где этот же показатель составляет 11,6% (95% ДИ: 9,5-13,7). Однако в странах Азии показатели резистентности значительно варьируют от 2,6% (95% ДИ: 0,3-4,8) в Гонконге до 14,9% (95% ДИ: 11,8-18,0) в Японии [12].
По всей видимости, резистентность к тетрациклину формируется крайне медленно, иначе, учитывая то, что тетрациклин много лет используется в висмут-содержащих эрадикационных схемах, рост резистентности давно бы проявился клинически в виде ухудшения результатов эради-кации. В целом резистентность H. pylori к тетрациклину в мире находится на низком уровне. В мире обнаружены лишь единичные штаммы, устойчивые к этому препарату [13]. Первые штаммы H.pylori, резистентные к тетрациклину, были обнаружены в Австралии [14].
Определении чувствительности H.pylori к антибиотикам связано с определенными трудностями, такими как правильный отбор биопсийных образцов, транспортировка материала в лабораторию, наличие навыков работы с его чистой культурой, соблюдение лабораторных стандартов по определению уровня резистентности H.pylori к антибиотикам. Для интерпретации показателей резистентности используются современные
стандартизированные методы. Это методы серийных разведений (в агаре и бульоне, метод микроразведений), диффузионные (дискодиффу-зионный метод и метод Е-тестов) и молекулярные методы. В нашем исследовании использован дискодиффузионный метод. Этот метод является наиболее простым, удобным и широко используемым при рутинном микробиологическом исследовании чувствительности. Он основан на регистрации диаметра зоны подавления роста микроорганизма вокруг бумажного диска с антибиотиком. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста пропорциональна величине минимально подавляющей концентрации (МПК), поэтому дискодиффузионный метод позволяет косвенно судить о ее величине. Данный метод позволяет подразделить штаммы на чувствительные и резистентные.Оценка результатов проводится с использованием критериев интерпретации, разработанных на основе корреляции значений диаметров зон подавления роста и МПК антибиотика [15].
Учитывая объективные сложности, описанные выше, данное исследование ограничено относительно небольшим числом наблюдений - 41 чистых культур микроорганизма. Безусловно, для разработки региональных протоколов ведения пациентов требуется дальнейшее изучение состояния антибиотикорезистентности H. pylori. Однако в ходе исследования выявлено, что уровень первичной резистентности H. pylori к кла-ритромицину составляет 14,6±5,5%.Такой показатель устойчивости позволяет использовать кла-ритромицин в стандартной тройной терапии. Кроме того, левофлоксацин по результатам данного исследования (уровень резистентности 24,4±6,7%) не может быть рекомендован в нашем регионе как альтернатива кларитромицину. Согласно рекомендациям Маастрихтского консенсуса IV в стандартной тройной терапии, амокси-циллин может быть заменен на метронидазол, а также в качестве терапии первой линии может быть использована "последовательная терапия", куда включен метронидазол. Наше исследование выявило высокий уровень резистентности 56,1±7,8% к метронидазолу у штаммов выведенных от наших больных, что существенно может снизить эффективность предложенных схем. Обнадеживающим остается показатель уровня резистентности H.pylori 2,4±2,4% к тетрациклину, который может быть использован, как альтернативный амоксициллину антибиотик при непереносимости больными пенициллина в эрадикаци-онной терапии.
ВЫВОДЫ:
На основании проведенного бактериологического исследования антибиотикорезистентности штаммов H.pylori можно сделать следующие выводы.
1. Хеликобактер является труднокультиви-руемым микроорганизмом. Для повышения чувствительности бактериологического метода требуется максимально четкое соблюдение протоколов методики работы с биоматериалом.
2. Выявлен высокий уровень резистентности H.pylori к метронидазолу(56,1±7,8%), что ставит под сомнение использование схем с присутствием метронидазола в качестве терапии первой линии.
3. Левофлоксацин при выявленной 24,4± 6,7% резистентности не может быть рекомендован в нашем регионе как альтернатива кларитро-мицину.
4. Уровень первичной резистентности
H.pylori к кларитромицину в ходе проведенного исследования составил 14,6±5,5%, что не должно существенно снизить эффективности стандартной тройной терапии.
5. Тетрациклин и амоксициллин с невысоким уровнем резистентности (2,4±2,4%) могут быть использованы в схемах эрадикационной терапии, предложенных консенсусом Маастрихт 4.
ЛИТЕРАТУРА
I. Исаева Г.Ш. Антибиотикорезистентность // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2010.-N 1.-С.57-66.
2. Graham D. Y, Lee Y C., Wu M. S. Rational Helicobacter pylori therapy: evidence-based medicine rather than medicine-based evidence // Clin Gastroenterol Hepatol. 2014; 12: 177-186
3. Дехнич Н. Н., Захарова Н. В., Кузьмин-Крутецкий М. И. и др. Резолюция экспертного совещания "Тактика ведения пациента с инфекцией Helicobacter pylori. От простого к сложному" // Клин. микробиол. и антимикробная хим. 2014. Т. 16. № 3. С. 176-180.
4. Саблин О.А., Ильчишина Т.А. Проблема резистентности Helicobacter pylori к кларитромицину // Гастроэнтерология, 2009, с.4-8.
5. Лазебник Л. Б., Рустамов М. Н. Резистентность к кларитромицину при эрадикации HP у больных дуоденальной язвой // Тез. докл. XII съезда Научного общества гастроэнтерологов России "Классическая и прикладная гастроэнтерология" 2012 г. М., 20.
6. Romano M., Iovene M.R., Russo M.I. et al. Failure of first-line eradication treatment significantly increases prevalence of antimicrobial-resistant Helicobacter pylori clinical isolates // J Clin Pathol 2008; 61:1112-5.
7. Megraud F., Coenen S., Versporten A. et al. Helicobacter pylori resistance to antibiotics in Europe and its relationship to antibiotic consumption // Gut. - 2013. - Vol. 62, № 1 - P.34-42.
8. Кудрявцева Л.В. Биологические свойства Helicobacter pylori // Альманах клинической медицины, 2006 - Т. XIV. - С. 39-46.
9. Iwanczak F., Iwanczak B. Treatment of Helicobacter pylori infec-
tion in the aspect of increasing antibiotic resistance // Adv Clin Exp Med. 2012; 21 (5): 671-680.
10. Megraud F. Antimicrobial Resistance and Approaches to Treatment. In: Sutton P., Mitchell H. M., eds. Helicobacter pylori in the 21 st Century // Wallingford, UK: CABI; 2010
11. Wu W., Yang Y, Sun G. Recent Insights into Antibiotic Resistance in Helicobacter pylori Eradication // Gastroenterol Res Pract. 2012; 723183.
12. De Francesco V., Giorgio F., Hassan C. et al. Worldwide H. pylori antibiotic resistance: a systematic review // J Gastrointestin Liver Dis. 2010; 19 (4): 409-414.
13. Midolo P.D., Korman M.G., Turnidge J.D., Lambert J.R. Helicobacter pylori resistance to tetracycline // Lancet. 2006, Apr 27; 347 (9009): 11945.
14. Megraud F. Helicobacter pylori resistance to antibiotics: prevalence, mechanism, detection. What's new? // Helicobacter pylori. Basic Mechanisms to Clinical Cure. - 2002. - P. 363-373.
15. "Макролиды в современной клинической практике" Л.С.Страчунский, С.Н.Козлов, 1999.
SUMMARY
The condition of the primary antibiotic resistance Helicobacter pylori in Azerbaijan I.Amiraslanova, L.Hidayatova, S.Javadov
Azerbaijan Medical University, Baku
The effectiveness of the eradication therapy in patients with gastroduodenal pathology associated with Helicobacter pylori infection, mainly depends on the resistance of microorganisms to used antibiotics. The recommendations of the Maastricht consensus IV consist of limited set of antibacterial medicine such as clarithromycin, amoxicillin, metronidazole, tetracycline, levofloxacin. The article presents the results of a study on antibiotic resistance strains of Helicobacter pylori, isolated from patients in Baku.
Поступила 05.04.2015
